菌种保藏
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• 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代 谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏 方法虽多，但都是根据这三个因素而设计 的
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选择保藏方法时，首先应考虑方法能否长期地 保持菌种原有的特性，同时也应兼顾到方法的经济 和简便。在实际工作中，往往多种条件同时使用, 以提高保藏效果。
（二）菌种保藏步骤 ① 挑选特征典型的纯菌菌落； ②确定保藏的合适菌体形态； ③ 选择最适宜的保藏方法； ④定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，
若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进 行移种。
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1.琼脂斜面低温保存法
• （1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接种 在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按 规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养 好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养基的水 分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花 塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每 隔 2~3个月移种一次，继续进行保藏。若用半固 体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年 ~ 一 年。有的甚至更长时间。
（4）注意事项： • 保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少
应是第三代的培养物。 • 保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用
流体硫乙醇酸盐培养基。 • 必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌
种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。 • 每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，
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法国生物梅里埃公司提供的商业派生菌株
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保藏的标准储备菌株
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制备的工作菌株
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• 菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存 在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传 标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。
• 菌种衰退不是突然发生的，而是从量wk.baidu.com到质变 的逐步演变过程。开始时，在群体细胞中仅有 个别细胞发生自发突变（一般均为负变），不 会使群体菌株性能发生改变。经过连续传代， 群体中的负变个体达到一定数量，发展成为优 势群体，从而使整个群体表现为严重的衰退。
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• 将上述液体石蜡加 入培养好的菌种试管 内，液体石蜡液面以 高出培养基最上端 1 ㎝为宜，将试管直立， 放入4℃冰箱中保藏。
• 适用范围：适用于保 藏部分霉菌，酵母菌 和放线菌，对细菌保 藏效果较差。
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液体石蜡对各类菌种保藏效果
菌
种
菌株数
保存时间（年 ）
存活率（%）
（1）方法： • 将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~ 0.5 %琼脂半固
体高层培养基中，培养好备用。 • 取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15ml，
加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取 出置37℃温箱或 110~ 170 ℃烤箱中 1 ~ 2 h 或干 燥器内除去液体石蜡中的水分。
⑥制备无菌液体石蜡时，每管装量不 能太多，否则分装到菌种培养基中易造成 污染。
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菌种衰退的原因
• 1、菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。 • 2、表型延迟现象也会造成菌种衰退。 • 3、质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产
中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。 • 4、连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。 • 5、不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的
• 狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通 过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群 体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典 型性状的措施；
• 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有 意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工 作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利 用自发突变（正变）不断地从生产中选种。
• （2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。
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大肠杆菌斜面
金黄色葡萄球菌斜面
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各类菌种保藏条件及时间
菌种
培养基
保存温 度
传种时间
细菌
一般多用于营养琼脂 或根据菌种规定选用 培养基
4~6℃
芽孢杆菌3~6个月， 其它细菌每个月
酵母菌
一般用麦芽汁琼脂或 麦芽汁酵母膏琼脂
细菌
87
5
20.9
霉菌
586
5
83.6
酵母菌
400
2
88.9
放线菌
380
4
91.3
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（3）特点： 本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法， 该法主要使菌种与空气隔绝。
（4）注意事项： ① 保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征 后，方可进行保藏。 ② 保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥， 需重新移种。 ③ 使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一 边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培 养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上 即可使用。
菌种保藏的意义
• 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基 本材料，在医学领域中，诊断制品的制备， 菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的 抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完 整的菌种.微生物具有生命活力，在传代过 程中易发生变异甚至死亡，因此菌种保藏 是一项重要的基础工作，是微生物学基础 工作的一项重要内容，也是药品微生物工 作中的一项常用技术。
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④将沾有少量液体石蜡的接种针浸于 95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接 在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起 污染。
⑤液体石蜡在菌种管中高出培养基的 高度要严格控制，如太多，会影响菌种交 换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面 容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜 面1 ㎝为宜。
确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。 • 保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖小于 2
%为宜，以免产酸过多，影响菌种存活。 • 铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，
不宜用本法保存。
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2、液体石蜡保存法：
本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理 生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。
• 3、淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行 处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。可以采用 各种外界不良理化条件,使发生衰退的个体死亡,从而留 下群体中生长健壮的个体.4、 4、采用有效的菌种保藏 方法。
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菌种保藏的基本原理
• 微生物具有容易变异的特性，因此，在保 藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不 活跃或相对静止的状态，才能在一定的时 间内使其不发生变异而又保持生活能力。
4~6℃
一般4~6个月
丝状真 菌
一般用PDA琼脂、蔡 氏琼脂或麦芽汁琼脂 等
4~6℃
每4个月移植一次（ 每2个月移植一次）
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（3）特点： 优点是——简便，易于推广；一般不
需要另选择保藏用培养基；对大多数微生物 都适用。
缺点是——保藏期太短；传代次数多 ，易发生变异及污染。
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另一个重要原因。
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如何预防衰退
• 1、合理的育种 • 2、选用合适的培养基 • 3、创造良好的培养条件 • 4、控制传代次数 • 5、利用不同类型的细胞进行移种传代 • 6、采用有效的菌种保藏方法
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菌种的复壮
• 菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复 原来优良性状。
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复壮的方法
• 1、纯种分离。采用平板划线分离法、稀释平板法或涂 布法均可。把仍保持原有典型优良性状的单细胞分离 出来，经扩大培养恢复原菌株的典型优良性状，若能 进行性能测定则更好。还可用显微镜操纵器将生长良 好的单细胞或单孢子分离出来，经培养恢复原菌株性 状。
• 2、通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮）。主要是对一些寄生性的菌株， 可以将衰退的菌株接种到相应的宿主体内，提高其寄 生性能及其它性能。
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概念
• 标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保 藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追 溯的菌株。
• 标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得 到的培养物。
• 商业派生菌株：由供应商提供的所有特性 与标准菌株等效的菌株。 工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的 培养物。
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中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株
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选择保藏方法时，首先应考虑方法能否长期地 保持菌种原有的特性，同时也应兼顾到方法的经济 和简便。在实际工作中，往往多种条件同时使用, 以提高保藏效果。
（二）菌种保藏步骤 ① 挑选特征典型的纯菌菌落； ②确定保藏的合适菌体形态； ③ 选择最适宜的保藏方法； ④定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，
若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进 行移种。
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1.琼脂斜面低温保存法
• （1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接种 在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按 规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养 好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养基的水 分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花 塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每 隔 2~3个月移种一次，继续进行保藏。若用半固 体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年 ~ 一 年。有的甚至更长时间。
（4）注意事项： • 保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少
应是第三代的培养物。 • 保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用
流体硫乙醇酸盐培养基。 • 必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌
种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。 • 每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，
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法国生物梅里埃公司提供的商业派生菌株
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保藏的标准储备菌株
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制备的工作菌株
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• 菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存 在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传 标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。
• 菌种衰退不是突然发生的，而是从量wk.baidu.com到质变 的逐步演变过程。开始时，在群体细胞中仅有 个别细胞发生自发突变（一般均为负变），不 会使群体菌株性能发生改变。经过连续传代， 群体中的负变个体达到一定数量，发展成为优 势群体，从而使整个群体表现为严重的衰退。
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• 将上述液体石蜡加 入培养好的菌种试管 内，液体石蜡液面以 高出培养基最上端 1 ㎝为宜，将试管直立， 放入4℃冰箱中保藏。
• 适用范围：适用于保 藏部分霉菌，酵母菌 和放线菌，对细菌保 藏效果较差。
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液体石蜡对各类菌种保藏效果
菌
种
菌株数
保存时间（年 ）
存活率（%）
（1）方法： • 将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~ 0.5 %琼脂半固
体高层培养基中，培养好备用。 • 取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15ml，
加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取 出置37℃温箱或 110~ 170 ℃烤箱中 1 ~ 2 h 或干 燥器内除去液体石蜡中的水分。
⑥制备无菌液体石蜡时，每管装量不 能太多，否则分装到菌种培养基中易造成 污染。
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菌种衰退的原因
• 1、菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。 • 2、表型延迟现象也会造成菌种衰退。 • 3、质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产
中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。 • 4、连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。 • 5、不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的
• 狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通 过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群 体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典 型性状的措施；
• 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有 意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工 作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利 用自发突变（正变）不断地从生产中选种。
• （2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。
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大肠杆菌斜面
金黄色葡萄球菌斜面
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各类菌种保藏条件及时间
菌种
培养基
保存温 度
传种时间
细菌
一般多用于营养琼脂 或根据菌种规定选用 培养基
4~6℃
芽孢杆菌3~6个月， 其它细菌每个月
酵母菌
一般用麦芽汁琼脂或 麦芽汁酵母膏琼脂
细菌
87
5
20.9
霉菌
586
5
83.6
酵母菌
400
2
88.9
放线菌
380
4
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（3）特点： 本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法， 该法主要使菌种与空气隔绝。
（4）注意事项： ① 保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征 后，方可进行保藏。 ② 保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥， 需重新移种。 ③ 使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一 边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培 养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上 即可使用。
菌种保藏的意义
• 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基 本材料，在医学领域中，诊断制品的制备， 菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的 抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完 整的菌种.微生物具有生命活力，在传代过 程中易发生变异甚至死亡，因此菌种保藏 是一项重要的基础工作，是微生物学基础 工作的一项重要内容，也是药品微生物工 作中的一项常用技术。
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④将沾有少量液体石蜡的接种针浸于 95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接 在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起 污染。
⑤液体石蜡在菌种管中高出培养基的 高度要严格控制，如太多，会影响菌种交 换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面 容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜 面1 ㎝为宜。
确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。 • 保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖小于 2
%为宜，以免产酸过多，影响菌种存活。 • 铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，
不宜用本法保存。
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2、液体石蜡保存法：
本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理 生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。
• 3、淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行 处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。可以采用 各种外界不良理化条件,使发生衰退的个体死亡,从而留 下群体中生长健壮的个体.4、 4、采用有效的菌种保藏 方法。
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菌种保藏的基本原理
• 微生物具有容易变异的特性，因此，在保 藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不 活跃或相对静止的状态，才能在一定的时 间内使其不发生变异而又保持生活能力。
4~6℃
一般4~6个月
丝状真 菌
一般用PDA琼脂、蔡 氏琼脂或麦芽汁琼脂 等
4~6℃
每4个月移植一次（ 每2个月移植一次）
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（3）特点： 优点是——简便，易于推广；一般不
需要另选择保藏用培养基；对大多数微生物 都适用。
缺点是——保藏期太短；传代次数多 ，易发生变异及污染。
第17页/共24页
另一个重要原因。
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如何预防衰退
• 1、合理的育种 • 2、选用合适的培养基 • 3、创造良好的培养条件 • 4、控制传代次数 • 5、利用不同类型的细胞进行移种传代 • 6、采用有效的菌种保藏方法
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菌种的复壮
• 菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复 原来优良性状。
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复壮的方法
• 1、纯种分离。采用平板划线分离法、稀释平板法或涂 布法均可。把仍保持原有典型优良性状的单细胞分离 出来，经扩大培养恢复原菌株的典型优良性状，若能 进行性能测定则更好。还可用显微镜操纵器将生长良 好的单细胞或单孢子分离出来，经培养恢复原菌株性 状。
• 2、通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮）。主要是对一些寄生性的菌株， 可以将衰退的菌株接种到相应的宿主体内，提高其寄 生性能及其它性能。
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概念
• 标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保 藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追 溯的菌株。
• 标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得 到的培养物。
• 商业派生菌株：由供应商提供的所有特性 与标准菌株等效的菌株。 工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的 培养物。
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中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株