重组质粒的转化(PPT 53页)
重组质粒DNA转化大肠杆菌实验课件
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预期实验结果
感受态细胞+重组质粒
0.1MCaCl2+重组质粒
感受态细胞+无菌水
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2、Amp母液： 称取氨苄西林100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm滤器过 滤除菌，用1.5ml离心管分装后储存于-20℃冰箱.
3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至 100ml,用0.22μm滤器过滤除菌或高压灭菌。EP管分装于 4℃冰箱储存 .
实验报告
思考题
(1). 根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些？ (2). 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落 ，你将如何解释这种现象？
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实验中要考虑的重要因素
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次继代或储于４℃的培 养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制 备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为 好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为 0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同), 这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
结构的三大要素： • 多克隆位点 • 选择标记（耐药性，LacZ） • 复制起始位点 种类： • 质粒 • 噬菌体 • 酵母人工染色体（YAC） • 反转录病毒载体 • 表达载体等
实验8 重组质粒的转化及筛选
实验八、重组质粒的转化及筛选转化（transformation）：是将异源DNA分子引入受体细胞，使其获得新的遗传性状的一种技术方法。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
热激转化将大肠杆菌感受态细胞与待转化的DNA样品小心混合均匀，置于冰上约10min，使DNA充分粘附于细胞表面，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA样品。
将已转化处理的细胞置于无选择压力的培养基中保温一段时间，然后涂布于有选择压力的平板培养基上，获得重组子。
实验材料DNA材料：连接产物、质粒pQE30-EGFP；感受态细胞：大肠杆菌DH5α；培养基：LB抗生素：AMP（氨苄青霉素），在培养基冷却到60℃以下添加，添加量为1/1000。
已灭菌的EP管操作步骤1.从冰箱取出的感受态细胞放置冰上融化，分别取100µl转移到2支已灭菌的1.5ml离心管中，分别加入质粒1µl、连接产物10µl，温和混匀，冰上放置5~10min；2.热激处理：将EP管置于42℃恒温水浴锅中，保温90秒，不要摇动，然后迅速转移到碎冰块中，冷却1~2分钟。
3.往EP管中加入500µl新鲜LB培养液（37℃预热），37℃，培养30min~60min（注：转纯质粒可省略，转连接产物需进行）。
4.取100~150µL细胞（可离心，重悬）涂布于含有抗生素的LB平板上，室温放置3~5分钟。
5.37℃培养12~16h（过夜）；然后把培养箱温度调至30℃培养3~4h，观看EGFP基因表达情况。
转化实验流程感受态细菌100µl 质粒1 µl冰浴中10′混匀420C水浴90′冰浴1-2 ′ 加入500 l LB370C培养30′涂板培养过夜勿动热激＋用CaCl法制备的感受态细胞，可使每微克超2螺旋质粒DNA产生5 106-2 107个转化菌落。
在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。
101分子生物学实验3重组质粒转化
实验重组质粒的转化实验原理：利用CaCl2处理感受态体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90秒，热休克后，需要使受体细胞在不含有抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够的蛋白，以便能在含有抗生素的平板上生长菌落。
实验目的：学习外源DNA导入原核生物细胞的方法。
实验内容：化学转化法。
一、实验材料感受态细胞，重组质粒，LB培养基，抗生素AMP，质粒T+P。
二、主要设备微量移液器，微量离心管，台式离心机、恒温振荡摇床、恒温水浴锅、制冰机和记时器。
三、实验方法1. 制备含有Amp抗生素的LB平板。
2. 取一个1.5ml离心管，加入100μl感受态细胞悬液，置冰上：加入10ul质粒T＋G（提取的质粒DNA稀释500X），用移液器轻柔混匀。
冰上静置20min。
3. 42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3~5min。
整个过程不要振荡菌液。
4. 加入1ml LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振荡培养（180rpm）1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
5. 取100ul菌液，至含有抗生素Amp的LB固体培养基上，涂布均匀。
7. 待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12~16小时，菌落生长良好而又未互相重叠时，取出。
8.计算转化率统计每一个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积；转化频率（转化子数/μg质粒DNA）=转化子总数/质粒DNA加入量（μg）；。
重组质粒的转化(转菌)
重组质粒的转化重组质粒的转化(热休克法)本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2µl质粒即可）。
本流程以α-互补鉴定为例。
适用于含有β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体（如T载体），载体含有LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。
不能使用α-互补鉴定的载体可以使用含相应抗生素的平板鉴定（即直接使用LB/Amp或LB/Kana等，不用加IPTG/X-Gal）。
㈠试剂及材料:1.IPTG溶液(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，200mg/ml): 2g IPTG溶于8ml双蒸去离子水中，用双蒸去离子水调节体积至10ml，0.22um滤器过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。
2.X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷):已购入，铝箔纸包裹避光，-20℃保存。
3.LB液体培养基（无抗生素）。
4.含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板（LB/Amp/IPTG/X-Gal）: 在含有ampicillin的LB培养板表面加入4µl 200mg/ml IPTG和16µl 50mg/ml X-Gal，用无菌玻璃涂布器均匀涂布平板表面，37℃×30min可完全吸收，即可使用。
（注意：4µl 200mg/ml IPTG 加上16µl 50mg/ml X-Gal不足以涂布整个平板表面，可同时加入含与平板相同抗生素的LB液体培养基100µl左右。
）5.感受态细胞。
6.42℃水浴。
7.冰浴。
㈡操作流程:1.准备LB/Amp/IPTG/X-Gal平板或者其它筛选用平板，使用前将平板预热至室温。
2.从-80℃中取出冰冻的感受态细胞(如JM109)，臵冰浴中约5min至刚刚融化。
轻轻晃动使细胞混匀，仍臵冰浴中。
3.离心连接反应管，吸取5~20µl连接体系至臵于冰上的感受态细胞中。
4.轻轻晃动使其混匀，臵冰上30min。
实验质粒DNA的转化幻灯片PPT
B(转化-Amp+Kan):100ul菌液涂布于LB+Amp+Kan培养基，菌落生长 情况;
C(对照-无):100ul菌液涂布于LB培养基，菌落生长情况;
六、结果讨论
❖转化过程中的影响因素
1．受体细胞的生长状态和密度 细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个
左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过 测定培养液的A600控制。
5.将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Kan+Amp的筛选平 板上，涂布之后，在37℃培养箱中正面向上放置半小时， 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16 小时；
6. 涂布细则如下表：
组别
培养皿编号
1 1-1-对照-无
1-1-对照-Amp+Kan
1-1-转化-Amp+Kan
2 1-2-对照-无
2．质粒DNA的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外 源DNA的浓度在一定范围内成正比，但外源DNA的量过 多时，则会使转化率下降。一般来讲，DNA溶液的体积 不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的超螺旋DNA即可 使50 µl的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重 组分子而言，分子量大的转化效率低。此外，重组DNA 分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化 率较分子量相同的线性重组质粒高10-100倍。
组别
培养皿编号
6 1-6-对照-无
1-6-对照-Amp+Kan
1-6-转化-Amp+Kan
7 1-7-对照-无
1-7-对照-Amp+Kan
1-7-转化-Amp+Kan
8 1-8-对照-无
重组质粒的转化.ppt
提高转化效率的方法
• 感受态质量 • 质粒DNA的相对分子质量和浓度 • 防止杂菌和杂DNA污染
重组子的筛选
• 转化后的细胞在筛选培养基中培养，可筛选出转化子
蓝白斑筛选
• 蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生 型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal 切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可 以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛 选的最直观有效的方法。
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花粉管通道
花粉管通道法是指在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利 用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵 细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而 成为带转基因的新个体。
重组质粒的转化
• 外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，重组的 DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存 在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体 分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态 细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通 过各种方法筛选出重组子，并可通过酶切电泳进行重组子 的鉴定。
操作步骤
• 取100µl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面 的操作)，加入10 µl重组质粒DNA(体积不超过10µl)+ 100µl感受态 细胞
• 将以上样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温1－ 2min，然后迅速冰上冷却2min
• 立即向上述管中分别加入 LB液体培养基（不需在冰上操作），摇匀 后于37℃振荡培养约45-60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使 转化体表达抗生素基因产物。
重组质粒的构建与转化
重组质粒的构建与转化实验⽬的1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能⽤限制性核酸内切酶对载体和⽬的DNA进⾏切割，产⽣利于连接的合适末端。
2.学习设计构建重组DNA分⼦的基本⽅法，掌握载体和外源⽬的DNA酶切的操作。
3.学习利⽤T4 DNA连接酶把酶切后的载体⽚段和外源⽬的DNA⽚段连接起来，构建体外DNA分⼦的技术，了解并掌握⼏种常⽤的连接⽅式。
4.掌握利⽤Cacl2制备感受态细胞的⽅法。
5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和⽅法。
6.学习并掌握使⽤红⽩菌落法筛选获得重组⼦以及α互补筛选法的原理及⽅法。
7.学习并掌握使⽤Omaga试剂盒抽提质粒的⽅法及进⼀步确定重组质粒中含有外源⽬的DNA⽚段。
实验原理：（⼀）限制性核酸内切酶的酶切反应体外构建重组DNA分⼦，⾸先要了解⽬的基因的酶切图谱，选⽤的限制性内切酶不能在⽬的基因内部有专⼀的识别位点，否则当⽤⼀种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA时不能得到完整的⽬的基因。
其次要选择具有相应的单⼀酶切位点质粒或者噬菌体载体分⼦。
常⽤的酶切⽅法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采⽤单酶切法，即只⽤⼀种限制性内切酶切割⽬的DNA ⽚段，酶切后的⽚段两端将产⽣相同的黏性末端或平末端，再选⽤同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组⼦时，除了形成正常的重组⼦外，还可能出现⽬的DNA⽚段以相反⽅向插⼊载体分⼦中，或⽬的DNA串联后再插⼊载体分⼦中，甚⾄出现载体分⼦⾃连，重新环化的现象。
单酶切法简单易⾏，但是后期筛选⼯作⽐较复杂。
各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成。
在双酶切体系中，如果两种酶对盐离⼦的浓度和温度要求⼀致，原则上可以将这两种酶同时加⼊⼀个反应体系中同步酶切；如果不⼀致，则酶切反应最好分步进⾏，常⽤的酶切顺序是：先低盐后⾼盐，先低温后⾼温。
酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到⾼效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。
重组质粒的转化(转菌)
重组质粒的转化重组质粒的转化(热休克法)本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2µl质粒即可）。
本流程以α-互补鉴定为例。
适用于含有β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体（如T载体），载体含有LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。
不能使用α-互补鉴定的载体可以使用含相应抗生素的平板鉴定（即直接使用LB/Amp或LB/Kana等，不用加IPTG/X-Gal）。
㈠试剂及材料:1.IPTG溶液(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，200mg/ml): 2g IPTG溶于8ml双蒸去离子水中，用双蒸去离子水调节体积至10ml，0.22um滤器过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。
2.X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷):已购入，铝箔纸包裹避光，-20℃保存。
3.LB液体培养基（无抗生素）。
4.含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板（LB/Amp/IPTG/X-Gal）: 在含有ampicillin的LB培养板表面加入4µl 200mg/ml IPTG和16µl 50mg/ml X-Gal，用无菌玻璃涂布器均匀涂布平板表面，37℃×30min可完全吸收，即可使用。
（注意：4µl 200mg/ml IPTG 加上16µl 50mg/ml X-Gal不足以涂布整个平板表面，可同时加入含与平板相同抗生素的LB液体培养基100µl左右。
）5.感受态细胞。
6.42℃水浴。
7.冰浴。
㈡操作流程:1.准备LB/Amp/IPTG/X-Gal平板或者其它筛选用平板，使用前将平板预热至室温。
2.从-80℃中取出冰冻的感受态细胞(如JM109)，臵冰浴中约5min至刚刚融化。
轻轻晃动使细胞混匀，仍臵冰浴中。
3.离心连接反应管，吸取5~20µl连接体系至臵于冰上的感受态细胞中。
4.轻轻晃动使其混匀，臵冰上30min。
感受态细胞的制备及重组质粒的转化PPT课件
❖经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发
生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA 分子便趁机进入细胞内。
experiments of molecular biology
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❖ 转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的 变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体。
感受态细胞的制备及 重组质粒的转化
experiments of molecular biolog1y
重组DNA技术
分：分离外源基因 目的基因。
切、接：利用酶学 方法，将外源基因 与载体连接，形成 复制子。
转：转化宿主细胞， 使复制子可以扩增 复制。
筛：筛选含有目的 基因的细胞(转化子) 并扩增以获得目的 基因克隆。
转化是微生物遗 传、分子遗传、基因 工程等研究的基本实 验技术。
experiments of molecular biology
5
转化的方法
❖ 化学的方法(CaCl2法、热休克法)：使用化学试 剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热休克 处理将载体DNA分子导入受体细胞。
❖ 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受 态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子 导入受体细胞。
注
意
experiments of molecular biology
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思考题
1、影响CaCl2法转化率的因素有哪些？如何提 高转化率？
2、如何利用抗性筛选出重组克隆？
experiments of molecular biology
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experiments of molecular biology
细菌转化PPT课件
化学方法人工合成的DNA片段
第7页/共19页
实验原理 关于外源DNA片段与载体 的连接重组
采用由Hind III切割开的pUC19 质粒，以及由Hind III切割PCR
片 段 ， 用 T4 噬 菌 体 DNA 连 接 酶 将 PCR 片 段 与 切 割 开 质 粒 DNA 片 段 重 新 连 接 成 一 个 环 状 的 DNA 分 子 ， 即 把 目 的 基 因 DNA 插 入 质 粒 DNA ， 实 现 质粒重组。
第8页/共19页
➢ 限制性内切酶（restriction endonuclease）指能识别碱基构成特异的 一段（4~8 bp）双链核酸序列，并从中将核酸的磷酸二酯键断裂的 一种蛋白酶。
➢ 每种酶有特异的识别核酸序列，称为酶切位点，一般为回文序列。 ➢ 所有的限制性内切酶切割DNA均产生含5′磷酸基和3′羟基基团
2. 加入2 μl质粒DNA溶液,轻轻摇匀,冰上放置30分钟。
3. 42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分 钟。
4. 向管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养1 小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因 (Ampr )。
转化用的质粒， 无菌1.5mL的eppendorf管
仪器
恒温摇床， 台式高速离心机， 恒温水浴锅， 电热恒温培养箱， 超净工作台， 微量移液枪
试剂
LB固体和液体培养基， 氨卞青霉素
第17页/共19页
操作步骤
1. 从-70℃冰箱中取100μl（或50 μL）感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解 冻后立即置冰上。
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基因产品的开发现状
转基因食品的开发
• 美国55%的大豆是转基因产品，40%—50%玉米 是经过基因工程改变过的。美国超市上有4000多 种食品含有转基因成份。
• 1996年，世界种植转基因农作物的面积为700万 公顷。到1999年增加到7500万公顷，美国占了 74%，中国只占1%。
• 2000年美国基因农作物产品的销售额达950亿美 元。植物基因工程源源创造新品种，转基因食品 的增长是无限的，将不断推进经济增长。
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重组子的鉴定及基因表达产物的分析
• 琼脂糖凝胶电泳检测 • 聚丙烯酰胺凝胶电泳 • SDS-PAGE • 核酸分子杂交
IPTG诱导的结果： MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。
通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有 DNA插入。
抗生素抗性筛选
• 实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培 养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样， 一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载 体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，长成 白色菌落。
转基因技术
• 什么是转基因技术？
1983年，世界上第一例转基因植物在美国成功 培植，当时就曾有人惊呼：“人类开始有了一双创 造新生物的‘上帝之手’。”有人预言，21世纪将 是转基因作物的一个转换期，科技含量将有很大的 提高。
• 转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入 到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起 生物体的性状的可遗传的修饰。人们常说的“遗 传工程”、“基因工程”、“遗传转化”均为转 基因的同义词。
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“选择性繁殖”技术
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植物转基因方法
• 直接基因转移方法:基因枪法、 PEG介导的原生质 体法、花粉管通道法、电激转化法等，其中基因 枪转化法是代表。
• 生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒 介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法 操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子 叶植物的遗传转化。
基因工程和选择性繁殖技术有什么不同
• 转基因技术与选择性繁殖都会改变生物的基因。 • 转基因技术可以实现基因在不同物种之间的传递
和流动。可以实现物种间的基因转移。 • 转基因技术转移的基因更明确，更有目的性。 • 选择性繁殖实验过程缓慢。基因工程技术筛选优
良品种的周期更短，利用基因工程，可以很容易 地进行物种的杂交。
• 该方法简便、快速、稳定 • 将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液
中，便会造成细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，
CaCl2法制备感受态细胞
影响因素
• 细胞的生长状态：对数生长期 • 试剂质量：分析纯 • 杂菌和杂DNA污染：所用器皿、试剂均需灭菌 • 温度：冰上操作
转化
提高转化效率的方法
• 感受态质量 • 质粒DNA的相对分子质量和浓度 • 防止杂菌和杂DNA污染
重组子的筛选
• 转化后的细胞在筛选培养基中培养，可筛选出转化子
蓝白斑筛选
• 蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生 型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal 切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可 以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛 选的最直观有效的方法。
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
凝胶
滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印迹杂交的技术流程
凝胶
滤
玻 璃
纸板
白瓷盘
尼龙膜
滤纸
吸水纸
玻璃板
重物
吸水纸转膜
。
真空转膜
-
凝胶
尼 龙 膜
滤 纸
真空转膜槽
+
盖子
• 是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA 而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。
• 在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热 激或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。
• 进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的 遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出 重组子。
感受态
• 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA 的生理状态。它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、 外界环境等因素有关。
感受态细胞制备方法及原理
• 目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可 以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。经过 CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。
转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷 的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
方法及原理
• 热激法：使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，细 胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞 表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。此时 ，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞 膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外 源DNA就可能被细胞吸收。
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
2）转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交的基本原理
变性
复性
• 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下
DNA-DNA 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交双链分子 • 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知
核酸序列且已标记的DNA或RNA,称探针。
• 克隆是对单体的复制。转基因技术可以保持生物基因的多 样性，而克隆却没有什么帮助，反而有一定的威胁。
30
克隆羊“多莉”的产生过程
32
转基因食品
• 以转基因生物为原料加工生产的食品。 • 根据原料来源：动物源、植物源、微生物源 • 根据功能：增产型、控熟型、高营养型、保健型、新品种
型、加工型 • 最初目标：保护作物 • 风险评估：环境和人类健康
操作步骤
• 取100µl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面 的操作)，加入10 µl重组质粒DNA(体积不超过10µl)+ 100µl感受态 细胞
• 将以上样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温1－ 2min，然后迅速冰上冷却2min
• 立即向上述管中分别加入 LB液体培养基（不需在冰上操作），摇匀 后于37℃振荡培养约45-60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使 转化体表达抗生素基因产物。
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花粉管通道
花粉管通道法是指在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利 用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵 细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而 成为带转基因的新个体。
该方法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不 需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。
DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分
子量大。
Marker 重组子 载体
直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆中分离质 粒，电泳、比较其分子量。
根据重组DNA分子大小鉴定重组子
原理：有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载体 DNA之间的大小差异。
基本方法：提取转化子的DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离 ，电泳迁移慢的带是重组DNA的带。 此法是对重组子进行分析鉴定的最基本、最简单的方法 ，只适用于重组子的初步鉴定。
• 杂交有固一液相杂交和液相杂交。
2.1 探针（Probe)的概念:
一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序 列。
4.1 Southern 印迹杂交
此技术由Southern 1975年首先设 计。被检测对象为DNA。
限制性酶切割
限制片段
DNA分子
琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
农杆菌介导的植物转基因技术
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农杆菌介导的植物转基因技术
感染 转化
选择
再生
转基因植株评价与鉴定
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转基因和克隆技术
• 克隆是将一个体细胞的DNA移入一个已经被去掉细胞核 的卵细胞中，然后刺激这个改造后的卵细胞，使它开始分 裂并成为一个胚胎，这个胚胎的基因与体细胞提供者的基 因完全一样。
• 关于转基因，通常因有性生殖造成同种生物个体之间遗 传物质的重组.
筛选原理
• IPTG可以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体 平板培养基中菌落呈现蓝色。当外源DNA（即目的片段）与含lacz' 的载体连接时，会插入进MCS（即靶基因），使α 肽链读码框破坏， 不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色， 培养表型即呈现白色菌落。
重组质粒的转化
• 外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，重组的 DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存 在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体 分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态 细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通 过各种方法筛选出重组子，并可通过酶切电泳进行重组子 的鉴定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：
在电场的作用下线性 蛋白质链在聚丙烯酰 胺凝胶介质中向正极 移动，移动的速率主 要取决于其分子量大 小（链的长短），从 而把不同分子量的肽 链分开。