第四章_发酵工业的无菌技术
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4微生物工程第四章发酵工业的无菌技术
解：C0=2×105(个/ml) Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml) t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)] =2.37 min
喷淋冷却连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程
薄板式换热器连续 灭菌流程
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝 大量自溶，发酵液粘度黏度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂； ②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，使水相和溶媒之 间极易发生乳化。
（二）杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 平板划线培养或斜面培养检查法 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、发酵培养基及设备管道灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）发酵培养基及设备管道灭菌技术
（一）湿热灭菌原理 1.微生物的热阻
灭菌后弃去
发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分， 重新接种
发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，应根据各种发酵的特 点和具体情况尽快处理 。
抗生素发酵
输入正常发酵的另一罐发酵液
柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸；加入盐 酸等条pH3.0以下，抑制细菌
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制 酵母；通风加大，加速产酸。
3. 杂菌污染的途径及其预防
（1）种子带菌的防治
培养基及器具彻底灭菌 避免菌种在移接过程中受污染 避免菌种在培养及保藏过程中污染
喷淋冷却连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程
薄板式换热器连续 灭菌流程
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝 大量自溶，发酵液粘度黏度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂； ②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，使水相和溶媒之 间极易发生乳化。
（二）杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 平板划线培养或斜面培养检查法 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、发酵培养基及设备管道灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）发酵培养基及设备管道灭菌技术
（一）湿热灭菌原理 1.微生物的热阻
灭菌后弃去
发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分， 重新接种
发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，应根据各种发酵的特 点和具体情况尽快处理 。
抗生素发酵
输入正常发酵的另一罐发酵液
柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸；加入盐 酸等条pH3.0以下，抑制细菌
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制 酵母；通风加大，加速产酸。
3. 杂菌污染的途径及其预防
（1）种子带菌的防治
培养基及器具彻底灭菌 避免菌种在移接过程中受污染 避免菌种在培养及保藏过程中污染
4.发酵工业无菌技术 ppt课件
二 如：
发 酵 工
青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌 的危害大；
业 污
高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的
染 危害较大；
的
防
治
策
略
发酵工业无菌技术
不同污染时期对发酵的影响
二
发 种子培养期 菌浓低，营养丰富；灭菌；
酵 工
发酵前期 杂菌争夺营养成分，干扰生产菌的
业 繁殖和产物的形成；灭菌，重接种；
通；
略
发酵工业无菌技术
2.无菌空气带菌及防止；
二 3.培养基和设备灭菌不彻底导致的染菌及防
发 酵
止：原料 蒸汽压力 设备死角
工 业
4.设备渗漏引起的染菌及防止；
污 染
5.操作不规范引起的染菌
的
防
治
策
略
第 发酵染菌的拯救与处理
十 一
1.种子培养期染菌的处理：灭菌，倒种；
章 2.发酵前期染菌的处理：灭菌，接种；
养 基Байду номын сангаас
杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致
发酵工业无菌技术
无菌室 室内布置应尽量简单，通常用30瓦
二 发
紫外线灭菌灯照射20~30分钟，配合使用化 学灭菌药剂；无菌室内无菌度的要求是：
酵 把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放
工 业
置30分钟，根据一般工厂的经验，长出的
污 染
菌落在3个以下为好。
的 防
灭菌锅 灭菌操作时需要注意排气管是否畅
治 策
4.发酵工业无菌技术 ppt课件
发酵工业无菌技术
一 发酵工业的无菌处理
在工业微生物培养过程中，只允许生产菌存
在和生长繁殖，不允许其他微生物共存，因
发酵工程第四章无菌技术
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
ND
dNR/dt=-kR NR
dNs/dt =kR NR -ks Ns
→Nt/N0=KR/(kR-kS) [ekst-ks/kR e-kRt]
式中NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数
ND：死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率；
ks：敏感性芽孢的比死亡速率；
N0：初始活芽孢数。
培养基中含有大量的不耐热的微生物和 相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留 曲线
蒸汽
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽Βιβλιοθήκη 放汽冷却水无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
dN kN dt
ln Nt kt N0
t 2.303/klogN0 Nt
当Nt=0时， t=∞， 既无意义，也不可能。
一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。
(2) 非对数残留定律
某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
ND
dNR/dt=-kR NR
dNs/dt =kR NR -ks Ns
→Nt/N0=KR/(kR-kS) [ekst-ks/kR e-kRt]
式中NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数
ND：死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率；
ks：敏感性芽孢的比死亡速率；
N0：初始活芽孢数。
培养基中含有大量的不耐热的微生物和 相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留 曲线
蒸汽
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽Βιβλιοθήκη 放汽冷却水无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
dN kN dt
ln Nt kt N0
t 2.303/klogN0 Nt
当Nt=0时， t=∞， 既无意义，也不可能。
一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。
(2) 非对数残留定律
某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些
发酵工业无菌技术演示教学
• 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比 生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为 主；
• 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难 • 杂菌会降解目的产物； • 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；
• 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现 象。
4，培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中， 培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引 起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
4.5.3空气过滤除菌
（一）、空气过滤除菌流程
1、高空采风、两次冷却、两次分油水、 适当加热流程
• 特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。 空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却 至20～25℃，经分水后加热到30～35℃， 因为温度升高，相对湿度下降。
2、冷热空气直接混合式空气除菌流程
第四章 发酵工业的无菌技术
• 4.1 灭菌与消毒的区别
灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中 所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和 孢子
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、 器皿内外的病源微生物。
• 培养基灭菌的目的
• 1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： • 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
七、补料液的灭菌
在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这 些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补 料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭 菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分 批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属 设备和管道都要经过灭菌。
缺点 –设备比较复杂，投资较大。
• 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难 • 杂菌会降解目的产物； • 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；
• 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现 象。
4，培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中， 培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引 起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
4.5.3空气过滤除菌
（一）、空气过滤除菌流程
1、高空采风、两次冷却、两次分油水、 适当加热流程
• 特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。 空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却 至20～25℃，经分水后加热到30～35℃， 因为温度升高，相对湿度下降。
2、冷热空气直接混合式空气除菌流程
第四章 发酵工业的无菌技术
• 4.1 灭菌与消毒的区别
灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中 所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和 孢子
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、 器皿内外的病源微生物。
• 培养基灭菌的目的
• 1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： • 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
七、补料液的灭菌
在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这 些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补 料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭 菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分 批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属 设备和管道都要经过灭菌。
缺点 –设备比较复杂，投资较大。
发酵工程发酵工业的无菌技术课件
发酵工程发酵工业的无菌技术
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4.2.2 杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间
平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑
肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
› DO2水平异常变化 › pH异常变化 › 尾气CO2异常变化
发酵工程发酵工业的无菌技术
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（2）不同发酵时期染菌对发酵的影响
1）种子培养期染菌 ➢ 由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势
，而且培养基营养丰富，容易污染杂菌。种子 染菌对发酵危害极大，应严格控制种子染菌， 如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。
发酵工程发酵工业的无菌技术
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2）发酵前期染菌
➢发酵前期最易染菌。
➢原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势 ；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌 能力弱。在这个时期要特别警惕以防止染菌的发生。
20
➢染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白 和其它杂质。 ➢采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化， 很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 ➢采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、 庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面 ，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的 交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时 与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
发酵工程发酵工业的无菌技术
9
➢链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不 象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成 不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养，干扰 生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。 ➢灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑 制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。
发酵工业的无菌技术
间 1.设备要求低，不需另外 1.培养基的营养物质损 加热、冷却装置。 失大，灭菌后培养基 歇 质量下降 灭 2.操作要求低，适合小批 量生产规模 2.发酵罐的利用率较低 菌
3.适合含大量固体物料的 3.不适合大规模生产的 灭菌 灭菌
作业
1、连续灭菌的流程与设备 2、对数残留定律 3、分批灭菌、连续灭菌 4、P273第8题
二、影响培养基灭菌的因素p68
杂菌的种类与数量 灭菌温度与时间 培养基成分 pH值 培养基中的颗粒 泡沫
培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性 在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。 环境 耐热性 60～65℃便死亡
水
大肠杆菌
10％糖液
30％糖液
70℃，4～6min
喷射加热连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌流程
3、灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
解：C0=2×105(个/ml)
Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)
t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k=2.303×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]
/15 =2.37 min
间歇灭菌与连续灭菌的比较
优 点 缺 点
连 1.高温短时灭菌，培养基 1.设备复杂，操作麻烦, 营养成分损失少。 染菌机会多。 续 灭 2.发酵罐占用时间缩短， 2.不适合含大量固体物 利用率高。 料的灭菌。 菌
3.适合含大量固体物料的 3.不适合大规模生产的 灭菌 灭菌
作业
1、连续灭菌的流程与设备 2、对数残留定律 3、分批灭菌、连续灭菌 4、P273第8题
二、影响培养基灭菌的因素p68
杂菌的种类与数量 灭菌温度与时间 培养基成分 pH值 培养基中的颗粒 泡沫
培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性 在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。 环境 耐热性 60～65℃便死亡
水
大肠杆菌
10％糖液
30％糖液
70℃，4～6min
喷射加热连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌流程
3、灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
解：C0=2×105(个/ml)
Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)
t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k=2.303×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]
/15 =2.37 min
间歇灭菌与连续灭菌的比较
优 点 缺 点
连 1.高温短时灭菌，培养基 1.设备复杂，操作麻烦, 营养成分损失少。 染菌机会多。 续 灭 2.发酵罐占用时间缩短， 2.不适合含大量固体物 利用率高。 料的灭菌。 菌
华中科技大学发酵工程 第四章 无菌技术
/jpkc
1
2
/jpkc
2. 污染原因分析
主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善
/jpkc
2. 污染原因分析
/jpkc
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
柠檬酸发酵
c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下
降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。
发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵 污染严重，则提前放罐 杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
种子扩大时期染菌: 灭菌后弃去 发酵前期染菌： 应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
dC k ' C dt
式中C：对热不稳定物质的浓度；k’：分解速度常数；
k’的变化也遵循阿累尼乌斯方程：
E ' ) RT E k A exp( ) RT k ' A' exp(
都与相应的活化能及T有关
/jpkc
3. 灭菌温度和时间的选择
消毒与灭菌的区别 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
/jpkc
二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
/jpkc
1.染菌的不良后果
消耗营养 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 改变pH 分解产物 噬菌体破坏极大
1
2
/jpkc
2. 污染原因分析
主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善
/jpkc
2. 污染原因分析
/jpkc
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
柠檬酸发酵
c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下
降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。
发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵 污染严重，则提前放罐 杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
种子扩大时期染菌: 灭菌后弃去 发酵前期染菌： 应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
dC k ' C dt
式中C：对热不稳定物质的浓度；k’：分解速度常数；
k’的变化也遵循阿累尼乌斯方程：
E ' ) RT E k A exp( ) RT k ' A' exp(
都与相应的活化能及T有关
/jpkc
3. 灭菌温度和时间的选择
消毒与灭菌的区别 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
/jpkc
二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
/jpkc
1.染菌的不良后果
消耗营养 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 改变pH 分解产物 噬菌体破坏极大
4.发酵工业无菌技术
业 污
高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的
染 危害较大；
的
防
治
策
略
发酵工业无菌技术
不同污染时期对发酵的影响
二
发 种子培养期 菌浓低，营养丰富；灭菌；
酵 工
发酵前期 杂菌争夺营养成分，干扰生产菌的
业 繁殖和产物的形成；灭菌，重接种；
污 染
发酵中期 严重干扰生产菌的繁殖和产物的生
的 防
成；并罐、提前放罐等；
一 概 述
发酵工业无菌技术
二 发酵工业污染的防治策略
污染的危害
二
发 染菌是发酵工业的致命伤。轻者培养基利用
酵 工
率下降；产品分离困难；发酵异常；影响产
业 污 染
品质量；重者造成“倒罐”；造成严重经济 损失，扰乱生产秩序，影响生产计划。
的
防
治
策
略
发酵工业无菌技术
二 在现有的技术条件下要做到完全不染菌是不
过程的正常进行，甚至使培养过程彻底失
败导致倒罐，造成严重的经济损失。空气
除菌不彻底是发酵染菌的主要原因之一。
发酵工业无菌技术
灭菌指利用物理、化学的方法杀灭或除去物 料及设备中一切生命物质的过程。消毒是指 用物理或化学的方法杀死物料、容器、器具 内外的病源微生物，一般只能杀死营养细胞 而不能杀死芽抱；
的
防
治
发酵工业无菌技术
三 发酵工业的无菌技术
灭菌的方法有：干热灭菌法，湿热灭菌法，
三 火焰灭菌法，电磁波、射线灭菌法，化学药
发 品灭菌法及过滤除菌法。根据灭菌对象和要
酵 工
求不同选用不同的方法。
业
的
无
菌
技
生物化学 第四章 发酵工业的无菌技术
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
湿热：121 ℃ 0.1MPa 20～30分钟饱和蒸汽 高温瞬间灭菌法 干热：160℃ 1小时 烧灼 巴斯德消毒法 冷冻 冷藏
温度
HIST灭菌法：温度升高时，微生物死亡速率常数远远大于 营养成分分解速率常数，因而可以采用在较高温度下缩短灭菌 时间而减少营养成分的损失。
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
第二节 培养基灭菌——分批灭菌和连续灭菌 一、分批灭菌（间歇灭菌）
dN dt
kN
t 2 . 303 /( k lg
N0 Nt
)
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
生物化工基础
第四章 发酵工业的无菌技术
化工学院 应用化学系 沈齐英
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
第一节 概述 灭菌：用物理或化学方法杀灭或清除设备及物料中所有 微生物的技术。 消毒：用物理或化学方法杀灭或清除致病微生物的技术。 防腐：防止或抑制微生物生长的方法。 温度 湿度 物理 射线 过滤 消毒剂 方法 化学 防腐剂 化学治疗剂 生物
t 2 . 303 ( k lg
N0 Nt
第四章 发酵工业的无菌技术
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
第三节 空气除菌 空气过滤除菌是发酵工业中最常用、最经济的方法。 解决： 1、压缩空气及其 冷却 2、除水
第四章 发酵工业的无菌技术
湿热：121 ℃ 0.1MPa 20～30分钟饱和蒸汽 高温瞬间灭菌法 干热：160℃ 1小时 烧灼 巴斯德消毒法 冷冻 冷藏
温度
HIST灭菌法：温度升高时，微生物死亡速率常数远远大于 营养成分分解速率常数，因而可以采用在较高温度下缩短灭菌 时间而减少营养成分的损失。
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第四章 发酵工业的无菌技术
第二节 培养基灭菌——分批灭菌和连续灭菌 一、分批灭菌（间歇灭菌）
dN dt
kN
t 2 . 303 /( k lg
N0 Nt
)
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生物化工基础
第四章 发酵工业的无菌技术
化工学院 应用化学系 沈齐英
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第四章 发酵工业的无菌技术
第一节 概述 灭菌：用物理或化学方法杀灭或清除设备及物料中所有 微生物的技术。 消毒：用物理或化学方法杀灭或清除致病微生物的技术。 防腐：防止或抑制微生物生长的方法。 温度 湿度 物理 射线 过滤 消毒剂 方法 化学 防腐剂 化学治疗剂 生物
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N0 Nt
第四章 发酵工业的无菌技术
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
第三节 空气除菌 空气过滤除菌是发酵工业中最常用、最经济的方法。 解决： 1、压缩空气及其 冷却 2、除水
4.发酵工业无菌技术
这样对于不同 N0 的培养基，其灭菌时间不 同，即 t = t (N0) 。
发酵工业无菌技术
根据
四 发 酵 培 养 基 及 设 备 管 道 灭 菌
1 N t ln K N0
在给定的温度条件下，t 与 ln N0/N 呈直线 关系，其斜率为 -1/K ；当 N0 给定后，t 决 定于 K ；K 除了决定于菌体的种类及存在 形式外，还是温度的函数。
发酵工业无菌技术
四 发酵培养基及设备管道灭菌
四 发 酵 培 养 基 及 设 备 管 道 灭 菌
发酵生产中主要采用湿热灭菌的方法
生产中需要解决的问题：
杀灭培养基中的杂菌 避免培养基中营养成分的破坏
发酵工业无菌技术
湿热灭菌原理
四 发 酵 培 养 基 及 设 备 管 道 灭 菌
微生物的热阻 表征不同微生物对热抵抗能力强弱的指标。 指微生物在某一特定条件(主要是温度和加热 方式)下的致死时间。 每一种微生物都有一定的最适生长温度范围， 如一些嗜冷菌的最适温度为5～l 0℃；大多数 微生物的最适温度为25～37℃；另有一些嗜 热菌的最适温度为50～60℃。
二 发 酵 工 业 污 染 的 防 治 策 略
发酵工业无菌技术
3.不同染菌的时间分析
二 发 酵 工 业 污 染 的 防 治 策 略
种子阶段
发酵初期
发酵后期
发酵工业无菌技术
杂菌污染途径及预防
二 发 酵 工 业 污 染 的 防 治 策 略
1.种子带菌及防止： 带菌的原因 无菌室的无菌条件不符合要求；培养基灭菌 不彻底；操作不当。 种子带菌的防止 种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在 每次接种后应留取少量的种子悬浮液迚行平 板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂 菌。严格技术觃范种子培养的设备和装置
第四章 发酵工业的无菌技术 2
第四章发酵工业的无菌技术内容提要•常用技术概念•发酵工业污染的防治策略•发酵工业的无菌技术•发酵培养基及设备管道的灭菌•空气除菌目前，绝大多数的工业发酵都采用纯种培养，即发酵全过程只有生产菌，不允许有“杂菌”污染。
为了保障纯种发酵的顺利进行，在进行生产菌接种之前，必须对整个发酵系统进行灭菌，对发酵环境进行消毒，防治杂菌和噬菌体的感染。
在实际生产中，为了防止杂菌污染，而采用的消毒和灭菌技术，统称为发酵工业的无菌技术。
一般采用“污染概率”作为评价标准。
发酵工业中允许的染菌概率为10-3，即灭菌1000批次的发酵中只允许有1次染菌。
一、常用技术概念几个容易混淆的概念说明：1、灭菌：指用物理或化学的方法杀死物料或设备中所有生命物质的过程。
2、消毒：指用物理或化学的方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。
3、除菌：指用过滤的方法去除空气或液体中的微生物及其孢子。
4、防腐：指指用物理或化学的方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖。
灭菌和消毒的区别和主要用途。
二、发酵工业污染的防治策略（一）、污染的危害1、污染杂菌，造成培养基的异常消耗，生产菌的生产能力下降；2、杂菌合成的代谢产物改变发酵环境，造成产物收率降低或质量下降；3、杂菌代谢产物使发酵系统的PH变化，造成生产菌自溶；4、杂菌分解产物，使发酵失败；5、噬菌体污染，造成生产菌细胞破裂，发酵失败。
目前，国内抗生素发酵，如青霉素发酵染菌率为2%；链霉素、红霉素和四环霉素发酵染菌率为5%；谷氨酸发酵噬菌体感染率为1%-2%。
（二）、发酵生产的产品不同，染菌的种类和性质不同、染菌发生的时间、染菌的途径和程度各不同。
1、不同种类的杂菌对发酵的影响（1）、细菌发酵：发酵周期短。
主要防止噬菌体感染。
例如：谷氨酸发酵菌种：棒状杆菌营养缺陷型细菌发酵（2）、霉菌发酵：发酵周期较细菌发酵长，产物类型各不相同。
主要防止细菌感染。
例如：青霉素发酵——水解产物。
（3）、酵母菌发酵：发酵周期最长。
第四章 发酵工业的无菌技术
3 杂菌污染的途径及其预防
种子带菌及其防治 培养基及器具彻底灭 菌，避免菌种在移接过程中受污染，避 免菌种在培养过程中或保藏过程中受杂 菌污染 过滤空气带菌及其防治 正确选择采气口， 提高采气口的位置或安装前置粗过滤器， 提高空压机进口空气的洁净度。
根据发酵工厂所在地区的气候条件，设 计合理的空气预处理流程，尽可能减少 过滤空气的含油量和湿度，适当提高进 入过滤器的空气湿度，降低空气的相对 湿度，保持过滤介质的干燥状态。设计 和安装合理的空气过滤器，防止过滤器 失效，选用除菌效率高的过滤介质。
杀死微生物的极限温度称为致死温度。 在致死温度下，杀死全部微生物所需要 的时间称为致死时间。 在致死温度以上，温度越高，致死时间 越短。
微生物对热的抵抗力称为热阻，即指微 生物在某一条件下（主要是温度）的致 死时间。 相对热阻是指某一微生物在某一条件下 的致死时间与另一微生物在相同条件下 的致死时间之比。
平板划线培养检查法 先将待检样品在无 菌平板上划线，根据可能的污染类别分 别置于37、27℃下培养划线平板，以适 应嗜中温和低温菌的生长，一般在8h后 即可观察到是否有杂菌污染。
对于噬菌体检查，可采用双层平板培养 法，上层和下层同为肉汤琼脂培养基， 上层减少琼脂糖用量，先将灭菌的下层 培养基融化后倒入平板，凝固后再将上 层培养基溶解并保持40℃，加上生产菌 作为指示菌核待检测样品混合后迅速倒 在下层平板上。置培养箱保温培养经1220h培养，观察有无噬菌斑。
第四章 发酵工业的无菌技术
发酵工业的无菌处理 发酵工业污染的防治策略 发酵工业的无菌技术 发酵培养基及设备管道灭菌 空气除菌
项目四 发酵工业的无菌操作PPT课件
20
精选课件
溶解氧水平异常变化显示染菌
溶氧浓度
污染噬菌体
正常发酵
溶氧浓度 正常发酵
污染嫌气性杂菌
发酵时间
污染好气性杂菌
发酵时间
21
精选课件
CO2异常显示染菌
工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律 污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加 污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少
22
精选课件
2.污染噬菌体的检测
7
精选课件
2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
8
精选课件
2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
（1）种子培养期染菌
菌体浓度低、培养基营养丰富，较易染菌，应严格控 制。 若将污染的种子带入发酵罐，则损失更大，因此一经 发现，应立即灭菌丢弃，并对种子罐、管道等进行仔 细检查和彻底灭菌。 采用备用菌种或以无污染的适当菌龄的发酵罐内的发 酵液作为种子，接入新鲜培养基中进行发酵。
9
精选课件
2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
（2）发酵前期染菌
发酵前期易染菌，且危害很大，需特别注意防止 一旦发现染菌，如原料营养还比较丰富，则进行重新灭 菌、接种发酵；如已消耗较多营养物质，则放掉部分料 液、补充新鲜培养基，重新灭菌、接种发酵。
10
精选课件
2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
（3）发酵中期染菌
4
精选课件
1.染菌对不同发酵过程的影响
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌
谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少 染杂菌，但噬菌体威胁大。
肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌， 营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成 代谢产物。
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精选课件
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溶氧浓度
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菌体浓度低、培养基营养丰富，较易染菌，应严格控 制。 若将污染的种子带入发酵罐，则损失更大，因此一经 发现，应立即灭菌丢弃，并对种子罐、管道等进行仔 细检查和彻底灭菌。 采用备用菌种或以无污染的适当菌龄的发酵罐内的发 酵液作为种子，接入新鲜培养基中进行发酵。
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2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
（2）发酵前期染菌
发酵前期易染菌，且危害很大，需特别注意防止 一旦发现染菌，如原料营养还比较丰富，则进行重新灭 菌、接种发酵；如已消耗较多营养物质，则放掉部分料 液、补充新鲜培养基，重新灭菌、接种发酵。
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肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌， 营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成 代谢产物。
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第四章 发酵工业的无菌技术
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第四章 发酵工业的无菌技术
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生物化工基础
第四章 发酵工业的无菌技术
化工学院 应用化学系 沈齐英
BEIJING INSTITUTE OF PETROCHEMICAL TECHNOLOGY
第四章 发酵工业的无菌技术
第一节 概述 灭菌：用物理或化学方法杀灭或清除设备及物料中所有
微生物的技术。 消毒：用物理或化学方法杀灭或清除致病微生物的技术。 防腐：防止或抑制微生物生长的方法。
温度 湿度 物理 射线 过滤 消毒剂 方法 化学 防腐剂 化学治疗剂 生物
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第四章 发酵工业的无菌技术
湿热：121 ℃ 0.1MPa 20～30分钟饱和蒸汽 高温瞬间灭菌法 温度 干热：160℃ 1小时 烧灼 巴斯德消毒法 冷冻 冷藏
第四章 发酵工业的无菌技术
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第四章 发酵工业的无菌技术
本章要点： 掌握发酵工业常用的无菌技术; 明确空气过滤除菌需注意的环节; 作业:解释名词 消毒 灭菌 防腐 瞬间高温灭菌
HIST灭菌法：温度升高时，微生物死亡速率常数远远大于营 养成分分解速率常数，因而可以采用在较高温度下缩短灭菌时 间而减少营养成分的损失。
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第四章 发酵工业的无菌技术
第二节 培养基灭菌——分批灭菌和连续灭菌 一、分批灭菌（间歇灭菌）
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第四章 发酵工业的无菌技术
二、连续灭菌
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回答问题 发酵工业培养基和空气常用灭菌技术如何? P272第四章2
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一、压缩空气及其冷却
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二、压缩空气冷却后除水
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