发酵无菌技术

2、空气总过滤器和分过滤器灭菌：
排出过滤器中的空气，从过滤器上部通入蒸汽， 并从上、下排气口排汽，维持压力0.147MPa灭菌2 h。灭菌完毕，通入压缩空气吹干。
1、种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭 菌及管道灭菌: 从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达 0.147MPa，维持45min，灭菌过程中，从所有液 位以上的阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过这 些阀门以防止出现死角。灭菌完毕后，关闭蒸汽， 待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空 气保压0.098MPa。
pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH<6.0，H+ 易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促 使其死亡。∴培养基pH愈低，灭菌所需时间愈 短。
培养基的物理状态：固体时间大于液体 泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为
不利，可加入少量消泡剂 。 培养基中的微生物数量：数量多，时间长。
3、杂菌污染的途径及其预防
(1)种子带菌的防治
灭菌彻底：培养基及用具灭菌要彻底，应防止假压。 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可靠。 保藏可靠：
(2)过滤空气带菌的防治
提高空气进口的洁净度。 除尽压缩空气中的油和水。 保证空气过滤器介质的填装质量。
(3)设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
室灭菌不彻底或操作问题。
酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长。
(2)从污染时间看： 早期污染可能与 种子带菌、无菌空气带菌、灭菌
不彻底 、操作失误 有关。 后期污染可能与设备渗漏、操作失误及中间补料
有关。 (3)从染菌幅度看： 各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同
一种杂菌，一般是空气系统问题。 个别罐连续染菌，一般是设备问题。
发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌 轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支 撑件。 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进 料管口。
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀
管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
一、常用的灭菌方法
1.化学试剂灭菌法 2.射线灭菌法 3.干热灭菌法
甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒
电磁波、紫外线或放射性物质 适用范围：无菌室、接种箱
常用烘箱，灭菌条件：160℃下保温1h 适用范围：金属或玻璃器皿
4.湿热灭菌法
利用饱和蒸汽灭菌，条件：121℃，30min 适用范围：生产设备及培养基灭菌
灭 2.发酵罐占用时间缩短， 2.不适合含大量固体物
菌 利用率高。
料的灭菌。
间 1.设备要求低，不需另外 1.培养基的营养物质损
歇 加热、冷却装置。
失大，灭菌后培养基
灭 2.操作要求低，适合小批 质量下降
菌 量生产规模
2.发酵罐的利用率较低
3.适合含大量固体物料的 3.不适合大规模生产的
灭菌
灭菌
四、发酵培养基及设备管道灭菌技术
③发酵中期染菌：危害极大、挽救困难，应早发现，快处 理 ，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决 定。 ▪ 抗生素发酵 ：输入正常发酵已产抗生素的发酵液。 ▪ 柠檬酸发酵： a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑 制细菌 。
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母；通 风加大，加速产酸。
快造成罐内负压造成染菌。冷却前先通入无菌空气维持 罐内一定的正压，再进行冷却 。 死角 ：消除。
(5)操作不当造成染菌
移种时或发酵过程中，罐内压力跌至零。 管道阀门操作不当，无菌空气的压力突然下降，罐内压力
高，发酵液倒流进入与发酵罐液面下相连的各个管道以及
空气过滤器 。
(6)噬菌体染菌及其防治
第四章 发酵工业的无菌技术
第一节 第二节 第三节
发酵工业污染的防治 发酵培养基及设备管道灭菌 空气除菌
第一节 发酵工业污染的防治
• 纯种培养要求必须防止杂菌污染 • 为防止染菌，采取了一系列措施：
密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设 备灭菌、无菌操作； • 染菌无法彻底避免；据报道： 国外抗生素发酵染菌率为2％~5%，国内抗生素发酵、 青霉素发酵的染菌率为2％，链霉素、红霉素和四环素 发酵染菌率为5%，谷氨酸噬菌体感染率为1％～2％。 • 染菌影响产率、质量、三废治理都有很大的影响。
养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢 产物。
B. 霉菌 • PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发
酵一无所获。
• 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 。 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都
应全部废弃。
（2）染菌种类对发酵的影响
5.过滤除菌法
利用过滤方法阻留微生物 适用范围：制备无菌空气
6.火焰灭菌法
火焰 适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口
培养基的湿热灭菌
湿热灭菌的优点： • 蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒； • 蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底； • 蒸汽有很大的潜热（冷凝热）； • 操作方便，易管理。
热阻
• 定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死 亡速率常数k来表示 。
(4)培养基与设备灭菌不彻底的防治
原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 假压：实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂，防止泡
沫升顶。 连消不彻底 ：蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温
度，最好采用自动控制装置 。 灭菌后期罐压骤变：灭菌后，冷却水冷却时，如冷却过
一、污染的危害
1、染菌的不良后果
① 消耗营养 ② 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 ③ 改变pH ④ 分解产物 ⑤ 噬菌体破坏极大
2.染菌危害的具体分析
（1）染菌对不同菌种发酵的影响 A．细菌 • 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染
杂菌，但噬菌体威胁大。 • 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营
以净化环境为中心的综合防治法。
采取哪些措施能够保持无菌发酵？
• 物料、培养基、中间补料要灭菌； • 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌； • 好气发酵通入的空气要除菌； • 种子无污染；接种无菌操作过关； • 为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
第二节 发酵培养基及设备管道灭菌
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
设备渗漏引起的染菌及其防止
发酵设备、管道、阀门长期使用，由于腐蚀、摩 擦和振动等原因，造成渗漏。
方法：选用优质的材料，并定期进行检查。
微小渗漏的检查：加入碱性水，用浸湿酚酞 指 示剂的白布擦，有渗漏则白布显红色。
二、分批灭菌
将配制好的培养基放入发酵罐或其 他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设 备一起进行加热灭菌的过程，也称实罐 灭菌。
1.灭菌工艺过程
分空气过滤器灭菌 并用空气吹干
夹套或蛇管排冷水，开启排 达70℃左右 气管阀，空气管通蒸汽，也 可夹套内通蒸汽
取样管 放料管
通蒸汽 120℃，1×105pa
保温
以上方法缺点： 镜检出杂菌需要一定时间。
(4)发酵过程的异常现象判断
DO2水平异常变化：
pH异常变化： 污染产酸菌或者利用碳源效率高生长较快的杂菌
尾气CO2异常变化： 染菌引起糖的消耗变化，染好氧性杂菌，糖耗加快， CO2含量增加；染噬菌体，糖耗减慢， CO2含量减少。
污染噬菌体后异常现象
1
2
2. 污染原因分析
嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同 温度下的死亡曲线
影响培养基灭菌的其它因素
培养基成分 – 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机 物等增加微生物的耐热性 – 低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用， 随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%10%以上，则减弱微生物的耐热性。
影响培养基灭菌的其它因素
dN kN dt
ln Nt kt N0
k↓，热阻↑, t↑
热阻
• 当温度T一定时，k随微生物不同而不同，具体 计算时，可取细菌芽孢的k值为标准。
• 当 T 变化时，k有很大变化，其变化遵从阿累 尼乌斯定律 k=Aexp(- △E/RT) ∴ k与微生物活化能及T有关
大肠杆菌在不同温度下 的残留曲线
主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤ 操作失误 ⑥ 技术管理不善
(1)从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与灭菌不彻底有关。 球菌、无芽孢杆菌：与种子带菌、 无菌空气带菌、
设备渗漏、操作失误有关。
浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与操作失误、 技术管理不善有关，即无菌
培养基灭菌的定义
• 是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其 芽孢或孢子，或从中将其除去。
• 工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌 更为常用。
灭菌与消毒的区别
• 灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微 生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。
• 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿表 面的微生物。
4、冷却罐：使料液冷却到40 50°C后（冷水喷淋） ， 输送到预先灭菌过的罐内。
喷淋冷却器
结构简单；广泛使用
板式换热器
体积小，换热效率高；但流动阻力较大
板式换热器
板式换热器
板式换热器原理图
2、分批灭菌与连续灭菌的比较
• 连续灭菌的优点：（适用于大型罐） – 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； – 发酵罐利用率高； – 蒸汽负荷均衡； – 采用板式换热器时，可节约大量能量； – 适宜采用自动控制，劳动强度小； – 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。