流式多因子检测技术 ppt课件
BD流式全面介绍ppt课件
流式细胞仪的遗传学应用
细胞DNA, RNA 含量的测定 染色体倍体分析 染色体分离 基因表达产物的生物活性研究 基因转染表达的生物效应 基因表达调控研究 细胞内基因定位 酵母转基因株的筛选 报告基因的定性定量检测 植物遗传学研究 ••••••
What can Flow Cytometer tell us about a cell?
样本处理
细胞悬液的制备
— 细胞悬液：
– 分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞 特定群体丢失，并可能引入某些误差
– 直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本 用血量小
– 灌洗液、体腔积液 – 培养细胞、细胞系
— 实体组织：
– 病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本 – 针吸组织：新鲜样本
Voltage
Laser Laser Laser
Voltage
Voltage
Time Time Time
Quantification of a Voltage Pulse
— Height is a measurement for all parameters. — Width = Area/Height
1. 散射光信号
•前向角散射光（FSC,Forward
Scatter） 入射激光的同向散射光信号 细胞相 对大小及其表面积。
•侧向角散射（SSC, Side Scatter）
入射激光90角的散射光信号 细胞粒度及细胞内相对复杂性。
散射光
—散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态 上的差异 - 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的 数据
Optics
• Excitation optics consist of:
luminex多因子检测原理
luminex多因子检测原理Luminex多因子检测是一种高通量、多参数、有色微球流式细胞技术。
它可以同时检测多个分子分析物，包括蛋白质、核酸、生物标志物等，具有快速、高灵敏度和高特异性等优点。
其工作原理分为四个步骤：微球标记、样品反应、洗涤和检测。
第一步，微球标记。
利用荧光染料将聚合物微球标记上不同的颜色，每种颜色微球上面可以结合一个特异性的抗体、核酸探针或配体。
不同颜色的微球可用于区分不同的检测物，每种被检测物对应一种颜色的微球。
第二步，样品反应。
将待测样品和微球混合，其中的待测分子与微球上的抗体、探针或配体结合。
比如，如果待测分子是蛋白质，那么它将与微球上的抗体结合。
第三步，洗涤。
将混合物置于洗涤缓冲液中，洗去未结合的待测分子。
这一步旨在去除非特异性吸附的物质，以提高检测的特异性。
第四步，检测。
将洗涤后的微球悬浮液注入一台Luminex仪器中，该仪器会通过激光激发荧光素，引起微球上的标记物发出特定波长的荧光信号。
这个信号将被检测器检测并转化为数字信号。
每种颜色微球对应的信号对应于与之结合的待测分子的浓度。
Luminex多因子检测的原理是基于荧光信号的区分，并通过检测信号强度来计算待测分子的浓度。
每种颜色微球上标注不同的抗体或配体，使其与目标分子特异性结合。
这种特异性结合可通过荧光标记物发出的特定波长和强度来检测。
荧光信号的强度与待测分子的浓度成正比，因此可以根据荧光信号的强度来计算待测分子的浓度。
Luminex多因子检测技术具有许多优势。
首先，它可以在一个反应体系中同时检测多个分子，减少了实验时间和样品消耗。
其次，该技术具有高灵敏度和高特异性，可以可靠地检测低浓度的分子。
此外，它也具备高通量性，可以同时分析大量样品。
Luminex多因子检测可以应用于多个领域，如病原体检测、免疫学研究和药物筛选等。
总的来说，Luminex多因子检测技术为多个分子分析物的高通量检测提供了一种快速、准确和可靠的方法。
流式细胞术实验技巧及数据分析ppt课件
FITC+T red
488
568
FITC+PeCy5 488
FITC+ ECD
488
F+P +PeCy5
488
F+ ECD +PeCy5 488
F+P +PeCy5 +APC 488
633
525 、575
绿色、橙色
525
绿色
615
红色
525、 675
绿色、 红色
525、 625
绿色、橙红色
525、575、675
17
流式细胞术操作流程：
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
表型测定 细胞分选
统 计 学 分 析
FISH PCR
继 续 培 养
18
单 分 散 细 胞
19
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
20
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
21
细胞散色光信号
22
排除双联体细胞
27
细胞阻滞在G2M期
28
双 克 隆 细 胞 周 期 分 析
29
BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅 可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流 的形成要满足雷诺数
细胞内细胞因子的流式检测讲解
刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和
刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测 IFN-γ 则可选择 PMA 和Ionomycin 同时刺激；如果用 CD4 做表面标记，由于多数病人的
CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，
4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析。
当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。 ③同型对照 ：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的
免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表减少非特异性的背景染色，保证结
果的准确性
① Fc 受体阻断 ： 使用试剂阻断 Fc 受体可以有效减少非特异荧光染色，在
小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig 或血清。
② 表面结合的细胞因子的阻断 ：使用相同克隆的纯化的细胞因子抗体，
阻断细胞表面结合的细胞因子，阻断由于荧光抗体与表面细胞因子结合 引起的背景。
荧光素的选择： 检测相对低表达细胞因子如 IL-4时，应选用PE或APC
Monensin Brefeldin-A(BFA) 6、固定剂
固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在 细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。 一般使用含4%的多聚甲醛PBS溶液
7、破膜剂
将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与 相应的细胞因子结合。 一般使用含1％皂甙、0.05％NaN2的Hanks溶液/HBBS
标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记
细胞内IL-1β的细胞内染色结果
未使用阻断剂
使用阻断剂
阴影部分代表的是同型对照染色结果； 黑色代表的是未使用破膜剂的染色 结果； 灰色代表的是使用破膜剂的染色结 果。
《流式分析技术》课件
流式细胞分选技术
了解流式细胞分选技术的原理 和应用，以及常用的荧光标记 物。
数据分析和可视化
掌握流式细胞仪数据的分析方 法和可视化工具。
故障排除和维护
学习如何识别和解决流式细胞 仪中常见的问题，以及正确的 维护方法。
分子细胞学中的应用
1
基因表达分析
利用流式分析技术研究基因的表达水平和细胞类型特异性。
《流式分析技术》PPT课 件
本课件将全面介绍流式分析技术的原理、应用和未来发展趋势，带您进入流 式细胞仪的神秘世界。
概述流式分析技术
了解流式分析技术的基本原理，以及其在生命科学中的重要性和应用领域。
发展历程
回顾流式分析技术的进化过程，从早期手工操作到现代自动化设备的应用。
相关的流式细胞仪设备和技术
2
蛋白质分析
测定细胞中特定蛋白质的表达量和功能。
3
Hale Waihona Puke 细胞周期分析研究细胞的增殖状态和细胞周期相关的事件。
整合多种流式分析技术提高精度
了解如何结合不同的流式分析技术，从而提高实验结果的准确性和可靠性。
纳米流式技术
介绍纳米尺度下流式分析技术的应用和优势，以及对细胞和生物颗粒的高分辨率检测。
流式分析技术在医学中的应用
探索流式分析技术在疾病诊断、免疫监测和药物研发中的广泛应用。
细胞免疫治疗中的流式分析技术
了解流式分析技术在细胞免疫治疗中的应用，以及如何监测和评估治疗效果。
流式细胞检测技术讲座分析解析共48页PPT
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
流式细胞检测技术讲座分析解析
•
46、寓形宇内复几时，曷不委心任去 留。
•
47、采菊东篱下，悠然见南山。
•
48、啸傲东轩下，聊复得此生。
•
49、勤学如春起之苗，不见其增，日 有所长 。
•
50、环堵萧然，不蔽风日；短褐穿结 ，箪瓢 屡空， 晏如也 。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
流式多因子
流式多因子随着流式细胞术和固相化技术的普及和基于微球的多指标检测技术的革命式发展，采用流式细胞术同样可以对可溶性蛋白质进行定性和定量分析。
与传统ELISA 技术只能检测一个指标相比，流式多因子检测技术能够实现从一份标本中同时检测多种指标，大大提高了科研人员的工作效率以及实现了对稀少珍贵样品的多指标分析。
其中代表技术是Luminex和BD CBA (cytometric bead array system, CBA), 以及eBioscience公司旗下的FlowCytomix技术。
百泰派克公司采用BD公司的CBA技术以及FlowCytomix技术为广大科研人员提供多参数细胞因子或其它可溶性分子检测服务。
检测原理：该技术的检测原理与夹心法免疫测定相同。
荧光微球被选择的抗原特异的抗体包被。
已包被了抗体的微球混合物与样本进行孵育。
样本中的待检物（如细胞因子等）与微球上包被的抗体结合。
生物素标记的抗体混合物，与结合于捕获抗体（微球）的待检物特异性结合。
最后加入Streptavidin-PE，与生物素结合进行荧光检测。
流式细胞仪根据微球大小和荧光标记强弱来区分微球群。
2种大小的微球（4.4μm, 5.5μm）内部分别标记9、11种不同强度的荧光染料（远红荧光，可被氩、氦氖甚至紫外光源激发，发射波长690nm），构成了20种可以同时被流式细胞仪识别和区分的不同微球故可以同时在一份标本中进行多达20种指标的检测。
百泰派克提供以下流式多因子检测服务：特异性皮炎细胞因子检测代谢性骨病细胞因子检测心血管疾病细胞因子检测细胞凋亡因子检测糖尿病细胞因子检测免疫调节细胞因子检测肥胖相关免疫因子检测疼痛相关免疫因子检测系统性红斑狼疮细胞因子检测肿瘤免疫细胞因子检测技术优势：与传统的ELISA检测相比，采用流式进行多因子检测有以下优点：抗体的选择目前有上百种的抗体适用于该项技术，并可以根据科研的不同需求进行随机组合开发。
其中我们将常见的检测因子组合，开发成一系列流式试剂盒，大大缩短了抗体定制所需要的时间。
细胞因子流式
细胞因子流式
细胞因子流式是一种检测细胞因子表达水平、类型、数量和功能的
高通量技术。
它是基于细胞分析仪原理的一种技术，可以将多种细胞
因子同时分析，从而获得更为全面和准确的信息。
细胞因子是一类介导细胞间信号传递的小分子蛋白质。
它们在机体免疫、炎症、发育和修复过程中发挥重要的生物学功能。
目前已知的细
胞因子有多种，包括促炎症因子、细胞生长因子、趋化因子等。
细胞因子流式技术主要通过使用荧光标记的单克隆抗体识别和检测不
同种类的细胞因子。
利用流式细胞仪的精细检测能力，可以实现同时
检测多种不同种类的细胞因子。
细胞因子流式技术的优点在于快速、高通量、准确、方便。
它可以用
于研究免疫细胞在病毒感染、恶性肿瘤、炎症和自身免疫性疾病等多
种疾病中的免疫调节机制。
同时，它还可以帮助研究人员快速发现新
的免疫调节标记并开发新的治疗方法。
除此之外，细胞因子流式技术还可应用于药物筛选、免疫细胞疗法、
临床诊断等多个领域。
它在新药开发、免疫治疗和疾病诊断中的应用
前景非常广阔。
总的来说，细胞因子流式技术在生命科学领域中具有重要的应用价值。
它的应用不仅可以促进我们对于细胞因子在生物学过程中的作用机制
的深入理解，而且可以在实际应用中为疾病的防治和药物开发做出重要的贡献。
细胞内因子的流式检测(共10张PPT)
所需试剂
1、细胞表面染色用的荧光标记的单抗试剂 如CD3、CD4、CD8、CD25等
2、荧光标记的细胞因子抗体： 如IFN-g、TNF-a、IL-2、IL-4等
3、溶血素：裂解红细胞
4、激活剂：
如PMA、Ionomycin，可以刺激T细胞活化并分泌细胞因子
所需试剂
5、阻断剂
67、、胞固破内定膜固，剂剂定另的一目方MB％的面roen皂在避fee甙于n免lsd、通细iinn％过胞-A蛋表(B白面F的的A抗)交原联丢和失变。性一方面使细胞因子固定在细 刺阴固血②，使如如下一1如固阴刺黑如3③的使M选安 刺荧①纯简黑一② ，使一标、 、o激影定样激过用I果调般C定影激色不同背用择全激光F化便色般激过用般本Fn细溶cDNe细 部 的 在 活 期 适 用 影 使 的 部 细 代 能 型 景 适 合 ：细 素 I： 代 使 活期 适 使 处受g3n胞血-或g胞分目8对，当C响用、目分胞表在对染当适减 胞的无表用对 ，当用理s体、小表素iDn血（代的照制细分含C的代（的8照色细的少 （选需的含照 制细含：阻4T时面小：D清P表在：备胞做析1在表P是：。胞对样 P择组是1： 备胞4避N断4内因内％染时裂％%MMM。F的于激不表。于的未使表照本 ：织未激 不表免表、：-的AAA分色之解皂皂a，子是通活当面通是使用面：处 检培使活 当面使C面使、、、、一多析用内红甙甙D同过对或阻过同用与阻为理 测养用对 或阻用标用III以I一阻 将8ooo聚结，的检细、、L般型蛋照溶断蛋型破荧断保与 相，破照 溶断络、记nnn试-甲2超 荧 测 胞％ ％ooo利断般细合对白使剂试白对膜光试证生对可膜使剂试合C，、剂mmm使醛过光，NNDyyy照的用污剂的照剂标剂结物 低以剂用 污剂钙由I于阻高aa使L胞。2Pccc用标应8NN-iii5染交细染，交染的记，合源 表全的细 染，的于断小Bnnn4准等记将22尔、、、等S用膜含色联胞，减联色染抗减的性 达血染胞 ，减抗多F时的的溶的真cBBB确基结和表需少和结色体少真污 细分色表 需少凝数会HH受含1穿FFF液单空aaAAA果变面制非变果结相非是染 胞析结面 制非剂病导体检体nn抗采）））4孔kk；性表备特性；果同特和因，果表 备特，人致可ss%试血测介溶溶一达新异一；来异可子无；达 新异如的活以，的剂管液液方鲜性方源性靠如需鲜性CCCA细性导有水CDDD以多//面刺的面、的性分刺的I的效HHLD胞646的平-BB9使激背使相背，离激背9抗与损4减利聚室来 来BB时产转细剂景细同景至剂景原PE失少SS温评评B，于甲D胞重染胞标染少重染会，非生M运T放价价应因新色因记色应新色因A一C特N荧醛置激激细，选作a子实，子、，该实，P般异。活活MN光因P用固验保固相保设验保胞细用荧2BA与与为P定。证定同证置。证胞的标S光因E，否否它溶在结在剂结以结或因激染，，记们子H使细果细量果下果A子活色液a如如会P胞的胞和的对的阳的而的，n得C果果限k内准内亚准照准性标有在未未能细s刺制，确，型确：确细记不小溶达达钙力另性另的性性胞激胞；同鼠到到依液一一免会程可。细CC因赖方方疫减度以DD/性胞面面球66子少的H用99激B避避蛋期期5下纯表抗B%活免免白望望调化S。达过细细，体的的，的程胞胞用的水水所抗进，表表于平平以小细推入面面消，，培鼠荐胞抗 抗 除则则养的细用原原由激激时C因肝D胞丢丢于活活间1子素失失抗步步不6内钠/。。体聚3骤骤能2。，非出出太，集特了了长在与在异问问，人相性题题4可胞-结6，，以应小浆合某某用时的到内一一过为细试试量细质宜胞剂剂的，胞网表可可同否面能能种则而失失无C产活活关D生4
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
10000
1000
MFI
100
10
1
1
10
100 1000 10000
pg/mL
曲线自动生成 线性或对数形式显示 IL-4 回归曲线拟合
IFNg IL-2 TNFa IL-6 IL-8
样本检测举例
Human Th1/Th2 Standard: Blank
Human Th1/Th2 Standard: 14 pg/ml
流式高通量多因子检测技术及应用
细胞因子与疾病
免疫调节作用：
➢ 调节着每个细胞乃至组织活动；
➢ 直接参与了细胞间相互作用以及细胞 外微环境的变化
参与疾病发生：
类风湿性关节炎； 强直性脊柱炎 SLE； 银屑病； 细胞因子风暴
以Th淋巴细胞为枢纽的细胞因子调节网
细胞因子与疾病治疗
多因子检测技术
流式多重定量技术
1 2 3
1 2 3
4
6
微球
PE 荧光强度 即为靶蛋白量 5 4
FL4 (Differentiator Parameter)
不同大小种类微球分布
FL2 (Reporter Parameter)
AimPlex检测过程
60分钟的抗原 抗体孵育
30分钟生物素 化检测抗体孵
育
20分钟链霉素 亲和素-PE孵育
IL-17A
400
y = 0.8712x + 13.712
300
R²= 0.9391
200
100
0 0 100 200 300 400
什么是AimPlex多因子检测技术？
AimPlex多因子检测技术： 利用不同尺寸、不同荧光强度的多个 微球群实现多因子的检测 利用该技术，配合任何一台配备 488nm激发光的流式细胞仪，即可实现 24个指标的同步检测。
AimPlex技术原理
一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，与待 测样本孵育后，加入检测抗体，形成“三明治”复合物
----检测细胞表面蛋白或胞内蛋白
R&D
xMap
Bioplex
Millplex
CBA
流式
Flowcytomix
基础
上
AimPlex
Luminex平台
多因子检测与疾病研究
更少样本
肿瘤生物学 免疫相关
代谢 心血管疾病
更短时间
干细胞研究 神经生物学
肿瘤移植 细胞凋亡
高通量
多因子检测涵盖了很多研究领域
多因子检测产品广泛应用于疾病的研究
选择灵活
– 研究人员可以根据实验需要，自由组合检测指标
耗时短
– 整个过程只需3个多小时
要求低
- 适用于所有含488激发光的流式细胞仪
宽范围，高灵敏
-更宽检测范围，高灵敏度，高特异性，高重复性
MFI
更宽的检测范围
药明康德客户需求：检测小鼠肝癌模型的AFP浓度
Full Range Std Curve
屑病等)
开发研究 大学 政府专业管理机构 医学中心
药物研发 生物技术企业 药物公司
临床研究 医院 医学中心
早期诊断 临床实验室 大学检测测试中心
实验室诊断 医院 专业检测机构 所有流式细胞仪客户
多因子检测应用领域
• 基础医学、生物学研究
• 基础免疫学研究 • 细胞生物学如信号传导、凋亡 • 癌症研究、传染病等 •药物开发和疗效研究
AimPlex and Luminex产品对比
AimPlex (pg/mL)
AimPlex (pg/mL)
800
IFNγ
y = 0.5948x + 8.0123
600
R²= 0.9716
400
200
0
0
500 1000 1500
Luminex (pg/mL)
TNFα
4000
y = 1.0737x + 10.264
Human Th1/Th2 Standard: 42 pg/ml
Human Th1/Th2 Standard: 123 pg/ml
Human Th1/Th2 Standard: 370 pg/ml
Human Th1/Th2 Standard: 1,111 pg/ml
Human Th1/Th2 Standard: 3,333 pg/ml
Human Th1/Th2 Standard: 10,000 pg/ml
Human Th1/Th2 unknown 1
Human Th1/Th2 unknown 2
AimPlex优势
高通量，多指标
– 同时检测一个标本多达24个指标
需要标本量少
– 节省样品（25 µL）、试剂、实验空间、仪器设备
3000
R²= 0.9292
2000
1000
0
0
1000 2000 3000
Luminex (pg/mL)
AimPlex (pg/mL)
AimPlex(pg/mL)
IL-10
800
y = 0.6238x - 3.149
600
R²= 0.9699
400
200
0
0
500 1000 1500
Luminex (pg/mL)
10000.00
1000.00
100.00
10.00
1.00 1.00 10.00 100.00 1000.0010000.01000000.00 pg/mL
Lower concentration range standard curve for better calculation of samples with very low AFP concentration
AimPlex结果的提取和分析
流式细胞仪：
几乎所有流式细胞仪都可以使用，只要 • 具有488nm激发光源 • FCAP Array 3.0 软件可计算 被测样本中待检物的浓度
标准曲线分析
FCAP array 3.0 Software
Standard Curves - Human 7-Plex
100000
Bead
Antibody 1 Cytokine
Antibody 2 (Biotin + Streptavidin PE)
➢ 流式细胞仪检测荧光，从而实现对蛋白抗原的检测；
➢ 结合抗原标准品的标准曲线，可实现对蛋白抗原的定量检测。
不同大小，不同 荧光强度的捕获 微球，在FCM FL4检测
5
不同的目标蛋白
• 肿瘤 (如肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫颈癌等) • 心血管疾病 (如高血压、动脉粥样硬化) • 糖尿病、肥胖症 • 自闭症、老年痴呆症 • 自身免疫性疾病 (系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、哮喘、
过敏反应等) • 炎症感染 (如结肠炎、克罗恩氏病、败血症等) • 传染性疾病 (如艾滋病、肝炎等) • 其它 (如多发性硬化症、营养不良、青光眼、阻塞性肺病、银