实验八 硝酸还原酶活性的测定

3．绘制标准曲线
测定 色法 低于 测定 NO-2 的 磺 胺 比 色法 很灵 敏 ， 可 以 检 出 低于 ug/ml的 含量， 可于0 ug/ml浓度范围内绘制 1ug/ml 的 NaNO2 含量 ， 可于 0 ～ 5ug/ml 浓度范围内绘制 标准曲线。 标准曲线。 吸取不同浓度的溶液（例如5、4、3、2、1、 0.5ug/ml） 1ml于试管中 ， 加入磺胺试剂2ml及一萘胺 ug/ml） ml 于试管中， 加入磺胺试剂 2ml 及一萘胺 于试管中 试剂2ml。混合摇匀，静置30分钟（ 30分钟 试剂2ml。混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水 浴中保温30 分钟） 立即于分光光色计下进行比色， 30分钟 浴中保温 30 分钟 ） 立即于分光光色计下进行比色 ， 波长520nm） 读取光密度。 520nm （波长520nm），读取光密度。 以光密度为纵坐标， 浓度为横坐标， 以光密度为纵坐标，NO-2浓度为横坐标，于毫米方 格纸上绘制光密度——浓度曲线。 浓度曲线。 格纸上绘制光密度 浓度曲线
KNO3）；磺胺试剂、 ）；磺胺试剂 0.2mol/L KNO3）；磺胺试剂、 苯胺试剂， a-苯胺试剂，NaNO2
仪器: 722型分光光度计、真空泵（或注射器）、 型分光光度计、 仪器: 722型分光光度计 真空泵（或注射器）、
保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、 保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、 三角瓶、移液管、烧杯、 三角瓶、移液管、烧杯、洗耳球
一星期后取出材料，用吸水纸吸干子叶上的溶液， 一星期后取出材料，用吸水纸吸干子叶上的溶液， 取出材料 然后按叶绿素含量测定的方法(P58-60) 然后按叶绿素含量测定的方法(P58-60)，测定各处理组子叶中 (P58 所含的总叶绿素含量（ 叶绿素／ FW） 所含的总叶绿素含量（ mg 叶绿素／ g FW）。
NO2－含量的测定用磺胺（对氨基苯磺酸胺 含量的测定用磺胺（
sulfanil—amide）比色法，这种方法非常灵敏。 sulfanil amide）比色法，这种方法非常灵敏。 amide
三、实验材料、试剂与仪器 实验材料、
材料: 木薯叶或菠菜叶子、蓖麻叶、 材料: 木薯叶或菠菜叶子、蓖麻叶、 试剂: 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）、 磷酸缓冲液（ 试剂: 0.1mol/L磷酸缓冲液 pH7.5）、
Thanks for your attentions!
2． NO2－含量的测定
保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管 保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管 30分钟结束时 1ml 先加入磺胺试剂2ml 后加入一萘胺试剂2ml 2ml， 2ml， 中，先加入磺胺试剂2ml，后加入一萘胺试剂2ml，混 合摇匀，静置30分钟，用分光光计进行比色测定， 30分钟 合摇匀，静置30分钟，用分光光计进行比色测定，比 色时用520nm波长，记下光密度， 色时用520nm波长，记下光密度，从标准曲线上查得 520nm波长 NO2－含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产 NO2－含量，然后计算酶活性， 生的NO 表示之。 生的NO2－表示之。
取 4 套培养皿分别加入 0 、 5 、 10 、 20 ppm 的 6 –苄基氨基嘌呤溶液各 20 mL 。 苄基氨基嘌呤溶液各 各培养皿中放入苗龄和长势相同的萝卜子叶 加盖后放在25 黑暗的地方培养。 0.5g ，加盖后放在25 ～ 30 ℃黑暗的地方培养。
2.叶绿素含量的测定: 叶绿素含量的测定:
第八周植生实验内容
实验八、 1. 实验八、硝酸还原酶活性的测定 活体法) (活体法) 2.实验九的预备实验 2.实验九的预备实验 细胞分裂素对萝卜子叶的保绿作用
实验八
硝酸还原酶活性的测定
八
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一、实验目的
学会植物组织中硝酸还原酶活性 的测定方法。 的测定方法。
二、实验原理
硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶， 硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶， 与作物吸收和利用氮肥有关， 与作物吸收和利用氮肥有关，它作用于NO3－还原 为NO2－ 。 NO3－＋NADH＋H＋→NO2－＋NAD＋H2O ＋ ＋ 可以从组织内渗透到外界溶液中， 产生的NO2－可以从组织内渗透到外界溶液中， 并积累在溶液中， 并积累在溶液中，测定反应溶液中NO2－的含量的 － 高低，即表明酶活性的大小。 高低，即表明酶活性的大小。
• 1. 本实验的设计有何优﹑缺点 ? 本实验的设计有何优﹑ • 2. 您还知道硝酸还原酶的活性的其他 测定方法吗？ 测定方法吗？
第八周植生实验内容
2.实验九的预备实验 2.实验九的预备实验 细胞分裂素对萝卜子叶的保绿作用
九
实验步骤
1.溶液的配制和实验材料的处理: 溶液的配制和实验材料的处理:
注射器内, 用手指堵住注射器出口小孔， 注射器内,，用手指堵住注射器出口小孔，然后用 力拉注射器使之真空， 力拉注射器使之真空，如此抽气放气反复进行多 次，即可使叶圆片中的空气抽去，并沉于溶液 即可使叶圆片中的空气抽去， ），将三角瓶置于30℃温箱中 使不见光， 将三角瓶置于30℃温箱中， 中），将三角瓶置于30℃温箱中，使不见光，保 温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml 30分钟 1ml， 温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml，以测 NO2－含量。 定NO2－含量。 注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用， 注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用， 以积累碳水化合物， 以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含 量低，会使得酶的活性降低， 量低，会使得酶的活性降低，此时则可在反应溶 液中加入30μmol/L 磷酸甘油醛或1.6 液中加入30μmol/L 的 3—磷酸甘油醛或1.6 磷酸甘油醛或1.6—— 二磷酸果糖，能显著增加NO2 的产生。 NO2－ 二磷酸果糖，能显著增加NO2－的产生。
NaNO2 NaNO 2 光密度值标准曲线 y = 0.1852x 1 0.8 光密度值 0.6 0.4 0.2 0 0 2 4 6 NaNO2浓度（ug/ml) 光密度值 线性 (光密度值) R2 = 0.9949
五、实验作业
计算所测材料硝酸还原酶的活性。 计算所测材料硝酸还原酶的活性。
七、思考题
四、方法步骤
1．配液、取材和抽气 配液、
将新鲜叶片（蓖麻、烟草、木茨叶等）水洗， 将新鲜叶片（蓖麻、烟草、木茨叶等）水洗，用吸水纸吸 干水分，然后用1cm的钻孔器钻取的圆片， 1cm的钻孔器钻取的圆片 干水分，然后用1cm的钻孔器钻取的圆片，在天平上称取等 量的叶圆片两份，每份0.3 0.3克 量的叶圆片两份，每份0.3克，分别置于含有下列溶液的三 角瓶中。 角瓶中。 （1）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml。 0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml。 磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml 5ml。 （2）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。 0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+0.2mol/L 磷酸缓冲溶液 然后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气， 然后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气 后，叶圆片即沉于溶液中，（如果没有真空瓶，也可以用 叶圆片即沉于溶液中，（如果没有真空瓶， ，（如果没有真空瓶 20ml注射器代替 将反应液及叶片一起倒入） 注射器代替， 20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入）
最新NaNO2光密度标准曲线 最新
NaNO2 NaNO 2 光密度值标准曲线 y = 0.1852x 1 0.8 光密度值 0.6 0ห้องสมุดไป่ตู้4 0.2 0 0 2 4 6 NaNO2浓度（ug/ml) 光密度值 线性 (光密度值) R2 = 0.9949
亚硝酸钠的含量=O.D值/0.1852 值 亚硝酸钠的含量