第7章：发酵工业染菌及其预防

C.维持灭菌温度 连消塔仅加热30秒左右，灭菌不彻底。 加热的料液在“维持罐”需再停留5~7min，可 达彻底灭菌。维持罐罐压应在4×105Pa左右。 维持不需加热，但罐体外侧要加绝热材料，以防 培养基冷却。 结构：料液“下进上出”型密闭容器。 罐之体积：H/D=1.2~1.5
D.冷却：4种方式：
2.种子带菌检查 必要性：接种用种子需“多次扩大培养”→易发 生污染，对每级种子均需加强检查。 方法：每次接种前进行镜检，观察有无形态异常 细胞存在，接种后留下少量种子悬液，进行肉汤培 养或平板划线培养，检查种子是否带杂菌；最好用 稀释平皿涂抹法计数，以便检查杂菌污染程度。 3.发酵设备与管件污染预防 指设备和管件因腐蚀或其它原因形成微小漏孔后 发生的渗漏现象。难度大！最后确定，其他因素没 有问题时，可能的原因是设备渗漏！
3.加热灭菌效果的评价指标
K t 10 Q10 Kt
式中Kt℃及K（t+10）℃分别为t℃及温度上升 10℃时微生物的死亡速率常数。 Q10愈大，对热愈敏感，灭菌效果愈好 嗜热脂肪芽孢杆菌的Q10在干热、湿热灭菌中分 别为2.86、14.28，表明湿热灭菌效果优于干热，提 高5倍。
二.培养基湿热灭菌 1.正、负效应同时发生 正效应：消灭杂菌； 负效应：营养成分破坏，其中AA、维生素及糖 类尤甚。 培养基灭菌时必须达到杀灭芽孢的程度。 培养基中养分的破坏程度随“灭菌温度”与 “时间”而异。 如100℃×400min，99.3%养分破坏； 120℃×4min，27%养分破坏； 150℃×0.01min，养分不足1%被破坏。 →“高温短时”是理想的灭菌法。
5.使游离噬菌体失活 热酸、热碱均能使发酵罐上的游离噬菌体失活。 漂白粉：0.2%；甲醛：1%单独或联合使用，可杀死 环境、设备中的游离噬菌体，效果较好。 游离噬菌体广泛存在于空气中，在空压机吸气口加 装热水喷淋设施，经80℃左右热水喷淋，可清理杀灭 空气中游离噬菌体。
第7章 发酵工业杂菌污染与防治
灭菌对象
发 酵 罐
灭菌的方法
物理法
培养基
对数残 留定律
化学法
发酵辅助设备
补料设备 管道
空气过滤器
发酵工业染菌及其防治 染菌原因 诊断方法 污染防治
加 热 干 湿 热
静 介 射 电 质 线 除 过 UV 菌 滤
惯性截 留定律
第7章
发酵工业的染菌与防止
发酵工业的杂菌： 除生产菌种以外的其它微生物均称为杂菌。 发酵工业为纯菌培养，→要消灭一切杂菌，使 发酵体系中仅有一种微生物生长。 杂菌的危害：两点 ①影响产品的产量、提取率和产品质量 污染轻的能勉强维持发酵，但杂菌污染时发酵 液发粘，菌体自溶，很难过滤→产品提取率与产量。 ②倒罐 严重污染时发生 →防污染对发酵工业至关重要
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
日本工业技术院发酵研究所抗生素发酵染菌原因
项 目 百分率（%） 9.64 0.19 0.79 10.96 项 目 百分率（%） 0.39 1.45 2.09 1.54
种子带菌 接种时罐压跌零 培养基灭菌不彻底 空气净化不彻底
接种管穿孔 阀门渗漏 搅拌轴密封渗 漏 罐盖漏
泡沫冒顶
夹套穿孔 盘管穿孔
0.48
喷淋式：将水均匀喷淋在水平排管上，Medium由排 管下部进入，上部排出，流速0.3m/s；传热系数300 千卡/m2,h,℃。 套管式：内管走Medium，外管为冷凝水或待预热 Medium。缺点：耗钢材多，内管有漏洞时不易被发 现而引起污染。优点：热利用合理，传热系数大（400 千卡/m2,h,℃）。 板式换热器： 类似于暖气片，传热系数2000千卡/m2,h,℃。 真空闪发冷却器：大容器，有一定真空度；水急剧 汽化需带走大量热，→温度快速下降，水汽由真空泵 抽出。
2.对数残留定 在灭菌条件下，活细胞的数量随时间以对数速率减少， 即活菌的减少速率与任一瞬间的活菌数N成正比：
dN dt
kN
式中N、t分别为残留的活菌、灭菌时间（秒），K为速率 常数（1/秒），K与灭菌温度及菌的种类有关。
t N 2 . 03 log o K Ns
No、Ns分别为灭菌开始及结束时活菌的个数 在上述公式中，达到彻底灭菌（NS=0）所需时间t=∝， 在实际生产中是不可能的，通常取NS=0.001（1000次灭菌有 一次失败机会）。 logNO/NS—t的关系是一直线，其斜率为K；K与菌株及 灭菌温度有关
1.溶解氧水平：溶氧电极 溶解氧水平异常，可能有细菌、噬菌体污染： 在线检测 2.发酵液pH：pH计 某些杂菌生长繁殖过程中产酸，使发酵液pH异常， →故pH异常：污染（臭味，异味）：在线检测 3.排气组分：感官法 发酵液污染杂菌，排气组分异常： 4.发酵过程中酶的变化：生化试验法，快速！ 某些杂菌能产生特异性酶，故污染与否同通过测定 该酶存在与否判断是否存在污染：生化反应
①使Pr更易发生不可逆凝固变性： 水存在，鸡蛋蛋清煮熟后变性 ②使热的传导、穿透性增强： 机理：水蒸汽在传递中发生冷凝，形成压力差 湿热灭菌应注意的问题： 蒸汽压与实际温度之关系：！！ 蒸汽压与温度间存在固定的关系： →调节蒸汽压就可控制温度。 但在发酵罐或灭菌锅内有残存空气时，压力与温度 间的关系改变：相同压力下的对应温度降低 。 注意：如P=1.05kg/cm2，完全排除空气及不排空 气时的压力分别为121℃及100℃。
3.分批（实罐）灭菌 冲洗输料管道；将配好的培养基打入发酵罐（种 子罐、补料罐）；搅拌灭菌。操作分两步： A.培养基预热：！先将培养基预热至80～90℃ （盘管），再导入蒸汽升温到120～130℃。 预热之目的： a.防止冷凝水大量产生，稀释培养基：培养基与 蒸汽温差大，易引起蒸汽大量冷凝！ b.防止直接导入蒸汽造成大量泡沫：→物料外溢。 预热之法：打开罐之各排气阀；蒸汽导入“夹层 或盘管”，待料温升至80～90℃，再关闭各排汽阀， 直接通入蒸汽。
2.注意菌种保藏 保持环境清洁，防止噬菌体污染； 升高空气进气口，减少噬菌体污染机会。 3.加强厂房周围环境噬菌斑监测 环境检测时如发现宿主平板中噬菌斑增加，发酵 罐内可能受噬菌体侵染。 方法：宿主平皿在工厂不同位置放置一定时间， 培养，检查有无透明斑。 空气中噬菌体数量增加，污染概率增大。
4.噬菌体抑制剂 ①络合剂： 核酸、蛋白变性失活 三聚磷酸钠：0.2%-0.3%；钼酸0.1% -0.2%；柠檬 酸：0.2%-0.5%；草酸盐：0.2% -0.5%； ②非离子去污剂： 聚乙烯乙二醇单脂，聚氧乙烯烃醚，吐温20，吐温 60。对抑制噬菌体吸附或在细胞内繁殖显著效果。 这些药物在适当浓度下，并不影响细胞的正常生长。 ③抗坏血酸，谷胱甘肽，L一半胱AA精AA，赖AA： 注意事项：慎重使用！
根除杂菌之途径： ①消灭原料及发酵系统中的一切杂菌： ②防止供气、补料、接种带入杂菌：
本章重点介绍： ①污染的原因及现象： ②污染的防止： ③加热灭菌原理及技术：
灭菌： 用物理或化学方法杀死物料及设备系统内的一 切微生物。 消毒： 用物理或化学方法杀死病原微生物营养细胞。 杀菌不彻底，尚留有芽孢。 灭菌方法：4 ①加热灭菌； ②化学灭菌； ③射线灭菌； ④介质除菌。
连续灭菌之优点： A.高温短时，养分破坏少； B.灭菌与发酵分开进行，发酵罐利用率高； C.蒸汽负荷均匀。 缺点： 设备多； 操作复杂； 污染机会多。
§7.2 染菌原因 一.污染原因 发酵生产环节多，污染原因复杂。一般原因：5种 1.空气系统：问题多，过滤不彻底等。 2.设备渗漏： 夹层穿孔；管道穿孔；阀门渗漏；搅拌轴密封泄 漏。 3.种子带菌： 4.操作不当：接种，取样，补料等 5.检测设备（电极、仪表）污染：
§7.1 加热灭菌理论与技术 一.加热灭菌的原理与方法 1.干热灭菌：作用： ①氧化：生物大分子 ②Pr变性： ③电解质浓缩： 适用范围：适用玻璃器皿等需保持干燥状态物 料的灭菌。 常用干热灭菌条件：160～170℃×2-3h。 2.湿热灭菌：作用： ①Pr热变性，酶失活： ②Pr、核酸分子内氢键在高温下发生不可逆破 坏，→生理功能丧失。 湿热灭菌效果优于干热灭菌：原因
12.36 5.89
其他设备泄漏
操作问题 原因不明
10.13
10.15 24.90
二.污染诊断 可据染菌规模、时间及菌体形态作出初步判断 1.发酵前期 ①污染芽孢菌： 两种可能：物料灭菌不彻底；种子带菌： A.有芽孢：培养基灭菌不彻底→查培养基； B.种子带菌：查种子 处理：检查培养基与种子液中是否有杂菌→污染 原因 ②污染非芽孢细菌： →种子带菌、空气带菌→查种子、空气 检查“空气样：空气净化系统的问题一般出现在 后期，严重时出现在前期。过滤介质失效程度与操作、 设备和介质种类等有关；设备渗漏。
C.泡沫 操作不当，泡沫大量形成。泡沫中的空气和泡沫 的膜有隔热作用，热量不易穿透，潜伏的芽孢不易 杀死。 四.快速、准确发现染菌的方法 快速检查法：4种 目前采用镜检，酚红肉汤培养法等手段监测发酵 是否染菌。 现行方法因灵敏度不高，有的需很长时间，难以 快迅准确地作出判断，延误了对染菌罐的及时处理。 快速、准确地检测染菌很重要。 染菌的快速检查方法：
4.保证灭菌彻底 分批灭菌中，采用罐压1kg/cm2，排空气彻底，料 温120℃，维持30min的常规操作规范，完全可以杀死 任何微生物。但灭菌中有时仍不能达到上述分批灭菌 的3点要求。 原因： A.死角：明显的设备死角易发现，但阀门等处一些 不易察觉的死角易被忽视→应对这类死角加以注意。
B.固形物堆积 有些固形物（特别是麸皮、黄豆饼粉等易粘着在罐 壁等处）在灭菌过程中虽经受干热作用，但这些物质 由于传热慢，堆积物里杂菌不易被杀死。 此外，物料结块灭菌不彻底。 消除固体物料灭菌不彻底的措施： 培养基完全液化。 方法： ①淀粉质类物质中的淀粉：用酶法液化； ②饼粉类蛋白物料：蛋白酶液化； ③取代CaCO3：利用pH指示联动添加酸、碱；
4.连续灭菌 高温短时；连续；养分破坏少。 配料预热（60~75℃）→“连消”→维持→冷却→入 罐 A.预热：料液加热至60~75℃。 B.连续灭菌：“高温蒸汽+料液”迅速接触，混合， 设备→料液升温至126~130℃。 连消塔：高2~3m，料液在塔中加热20~30s。 结构：多孔蒸汽导入管+外套管。 多孔管之孔径：5~8mm；孔数，取决于蒸汽导入管 的管径：小孔之总面积≈蒸汽导入管的截面积。 进汽量=排出量。
§7.3 噬菌体污染
一.噬菌体污染的特征 1.糖氮等营养成分消耗迟缓： 菌体繁殖减慢或停止，镜检细胞数不增加或很慢 2.pH异常： 3.产生大量泡沫，有时发酵液呈粘胶状，可拔丝： 4.发酵液色味改变： 5.细胞裂解： 污染严重时出现
二、防治噬菌体的常用方法：5点 1.选育抗噬菌体菌株 这是有效的防止措施之一。但新菌株使用一段时 间后，仍然会出现新的噬菌体。 新噬菌体的来源： ①形成噬菌体的新品系； ②生产菌株中混有溶原性菌株。有些温和噬菌 体发生突变和重组形成烈性噬菌体。 要定期更换抗噬菌体菌株
2.中、后期污染：芽孢菌/非芽孢菌 A.空气系统: 可能性大 B.物料: →查补料
三.防止污染的措施 1.待接种培养基无菌试验 灭菌待接种培养基需接受无菌试验 目的：检查灭菌是否彻底 指示微生物：芽孢杆菌，该菌耐热能力强， →检查芽孢存活：证明灭菌是否完全
无菌试验的特殊要求： 因为受热而未被杀死的菌体结构的某些部位受了 损伤，在丰富的培养基和适宜的条件下才可以生长。 受热损伤细胞复活条件：丰富的营养（ “酵母膏” 等 ）；合适的其它5种条件。 ①丰富的营养；营养条件尤为重要 ②合适的条件（pH、通气、离子浓度、时间）
B.培养基灭菌 将蒸汽直接从进气口、排料口、取样口直接导入罐 内，使罐温升至120～130℃，罐压维持 1.0kg/cm(105Pa)，保温30min
注意事项：5点 a.蒸汽入口要通畅，搅拌要剧烈： →物料灭菌均匀、彻底； b.排气量要较小：以节约蒸汽 c.灭菌快结束时要导入无菌空气保压：！ 打开无菌空气阀门，再开蛇形管或夹层冷却水，以 防罐压快速下降形成负压，→吸入外界带菌空气，→ 污染； d.打开无菌空气前，应使罐压降低至小于过滤器压力： 否则，发酵液“倒流”进入过滤器内；！！！ e.灭菌时总蒸汽压： ＞3.0×105Pa，使用压力＞2.0×105Pa。