微生物的分离、培养和菌种保藏
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5克）置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤最大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。
微生物菌种的保藏方法
微生物菌种的保藏方法1微生物菌种的保藏微生物菌种的保藏是生物学研究的重要环节，它也是生物资源的基础。
微生物的保藏需要充分的考虑长期保藏的要求，能有效防止细菌的腐败，缩短菌株检疫和检测所需的时间，还可以提高细菌新特征的研究成果。
但是，由于不同物种之间的差异性，微生物菌种的保藏可能涉及各种复杂的方法，需要更加正确和有效的保藏来保护和维护菌株。
1.1定期替换培养基微生物菌种的保藏通常使用加入防腐剂的培养基进行贮藏，但是由于长时间的贮藏，培养基的成分会逐渐减少，菌株也会逐渐衰老，这可能会影响到菌株的存活率和活跃度。
所以，贮藏前应加入新鲜的培养基和抗生素，定期替换新鲜培养基，以保证菌株的流动性。
1.2贮存条件的控制正确控制贮存条件，如温度、湿度、控制空气的酸碱度等，可以使菌株的活跃性或存活率保持最佳状态。
一般来说，细菌能够在室温（25度）下长期贮存，但是会减慢其增殖和繁殖的速度，同时还要注意湿度，太过潮湿会使细菌存活率降低，尤其是嗜水性细菌；而太过干燥则会造成菌株衰老，影响菌株的存活率并降低其活力。
1.3贮藏容器的选择贮藏容器也是微生物菌种保藏的重要组成部分，不同种类的细菌需要不同种类的容器来保存。
一般来说，普通细菌能够在塑料袋或瓶中长期贮存，只需每隔一段时间就更换新的瓶或袋，但对于致病细菌则必须使用带有封闭口的易破袋。
1.4贮藏环境的更新贮藏环境的更新也是保藏细菌的重要环节。
定期更换菌种本身的培养环境，例如移动菌瓶到新的室温，或将菌瓶置于新的室温环境中，可以有效提高菌种的活跃性，同时也可以更换新的培养基和抗生素，定期更新贮藏环境，有效规避细菌衰老的问题，确保细菌的存活率和增殖率。
以上就是微生物菌种的保藏方法，主要涉及到定期替换培养基、贮存条件的控制、贮藏容器的选择以及环境的更新等，只有正确地运用它们，才能确保菌株的存活率和活动性。
食品微生物8 微生物分离、纯化与保藏技术
（一）菌种保藏的目的
保持其原有性状和活力的稳定； 确保菌种不死亡、不变异、不被污染；
微生物检验基础技能训练模块 ——
8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
（二）菌种保藏依据：
根据菌种的生理、生化特点，人为地创造低温、干燥、 缺氧、缺乏营养条件，使菌种的代谢活动和生长繁殖处 于受抑制的休眠状态。 保藏菌种的选取：选取优良的纯菌种，最好是用其分生孢 子或芽孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条件下保藏。
菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
沙土管保藏流程：
菌种 斜面产孢 孢子悬浮液（≥106/ml ） 减压干燥
加入沙土管（ 0.3～0.5ml/管） 密封 4℃低温保藏
微生物检验基础技能训练模块 ——
8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
砂土管保藏法的特点
包藏初期，菌死亡率高，后逐渐减慢，存活下来的孢子在以后 保存期间稳定性较好。 适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌 对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。
(二)通过寄主体进行复壮
对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体病毒 等，由于长期使用，其毒力下降，导致杀虫效率降低及 衰退现象。 可以用菌种去感染菜青虫幼虫等，然后从致死的虫体上 重新分离，经过几次重复感染与分离，就可以逐步恢复 和提高毒力。
微生物检验基础技能训练模块 ——
8 微生物分离、纯化和保藏技术
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
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8 微生物分离、纯化和保藏技术
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8 微生物分离、纯化和保藏技术
微生物的分离培养和菌种保藏
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菌种保藏技术的改进
现有的菌种保藏技术存在一些局限性， 如长期保藏过程中菌种活力的下降等， 如何改进这些技术以提高菌种的保藏 效果是另一个挑战。
培养基和培养条件的优化
不同微生物对培养基和生长条件的需 求各异，如何优化这些条件以适应各 种微生物的生长是一个重要问题。
伦理和法规问题
在微生物分离培养和菌种保藏过程中， 可能涉及到伦理和法规问题，如人类 微生物、病原体和转基因微生物的管 理等。
未来的发展方向
开发新的培养方法和技术
随着技术的发展，未来将开发出更多新的培养方法和技术，以满足各 种微生物的培养需求。
提高菌种保藏效果
未来将致力于改进菌种保藏技术，提高菌种保藏效果，延长菌种寿命。
加强微生物多样性保护
未来将更加重视微生物多样性保护，采取有效措施保护珍贵的微生物 资源。
加强伦理和法规建设
选择性分离法
利用培养基或试剂的选择性抑 制某些微生物的生长，从而分 离出所需的特定微生物。
温度、酸碱度分离法
通过调节培养基的温度、酸碱 度等条件，使适应特定条件的
微生物得到分离。
微生物分离的步骤
1 2
采集样品
根据需要选择合适的微生物样品，如土壤、水、 空气等。
样品处理
将采集的样品进行适当的处理，如稀释、研磨等。
在医学和药学中的应用
抗生素耐药性研究
分离培养耐药性微生物，研究其耐药机制，有助于开发新的抗生 素药物。
疫苗制备
通过分离培养病原微生物，制备疫苗，预防和控制传染病。
药物筛选
微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏实验
实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1.了解微生物的分离纯化方法。
2.学习检测水中大肠菌群的方法。
3.学习微生物的保藏及鉴定方法。
4.熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2.平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。
3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、实验器材及试剂1.水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。
3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1.第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL，并加入产气管。
配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。
2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。
于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。
3）称取一定量的液体石蜡，约为锥形瓶的三分之一。
于121℃高温高压灭菌20分钟。
生物安全实验室病原微生物菌(毒)种和生物样本的保存(保藏)
生物安全实验室病原微生物菌（毒）种和生物样本的保存（保藏）实验室进行实验活动时，经常需要保存病原微生物菌（毒）种及样本。
无论是短期还是长期保存，都应遵循安全、存活、生物学特性不变以及避免差错等原则。
一、保藏管理《条例》规定：“国务院卫生主管部门或者兽医主管部门指定的病原微生物菌（毒）种保藏中心或者专业实验室（以下称保藏机构），承担集中储存病原微生物菌（毒）种和样本的任务。
”保藏机构应当依照国务院卫生主管部门或者兽医主管部门的规定，储存实验室送交的病原微生物菌（毒）种和样本，并向实验室提供病原微生物菌（毒）种和样本。
《传染病防治法实施办法》规定："一、二类病原微生物菌（毒）种的供应由国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。
三类菌（毒）种由设有专业实验室的单位或者国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。
”2009年7月16日，卫生部颁布了《人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法》（原卫生部令第68号），《办法》规定保藏机构是指由原卫生部指定的，按照规定接收、检定、集中储存与管理病原微生物菌（毒）种或样本，并能向合法从事病原微生物实验活动的单位提供病原微生物菌（毒）种或样本的非营利性机构。
病原微生物菌（毒）种保藏机构应具有符合要求的生物安全实验室，包括既符合生物安全要求，又能够保证所保藏病原微生物菌（毒）种质量的设施、设备、技术操作人员和规章制度。
《浙江省病原微生物实验室生物安全管理办法（试行）》规定实验室设立单位应建立病原微生物菌（毒）种和样本保藏保管制度，落实安全责任部门和专人进行管理。
有关机构按照规定从事临床诊疗、疾病控制、检验检疫、教学和科研等工作，在确保安全的基础上，可以保管其工作中经常使用的病原微生物菌（毒）种或样本，其保管的病原微生物菌（毒）种或样本名单应当报当地卫生主管部门备案。
重点落实对高致病性病原微生物菌（毒）种和样本的安全保卫措施，加强安全管理与控制，设立专库专柜，单独储存，做好病原微生物菌（毒）种和样本进出和储存的记录，建立档案制度。
菌种保藏的几种方法
菌种保藏的几种方法
1. 冷冻保藏：把微生物悬浮在特定培养基中，置于-80℃或以下的低温条件下，使其失去酵母菌能够进行分裂和繁殖的能力。
2. 干燥保藏：将微生物分散悬浮在一定浓度的特定培养基中，然后用离子交换树脂吸附、电泳或超声波处理，使其失去水分而形成干燥有机物，再用热风烘干或真空烘干，将其存放在4-10℃的干燥室中进行保存。
3. 液氮保藏：采用特定的培养基将菌种分散悬浮，用离子交换树脂吸附、电泳或超声波处理，形成无水有机物，再将其放入液氮容器中，放入液氮中冷冻保存，液氮温度为-196℃，此温度可有效杀灭菌种中的生物活性，以达到保藏目的。
微生物的分离、培养和菌种保藏 PPT课件
實驗程式7
（微生物的分離—平板塗抹法）
實驗程式8
（微生物的分離—平板劃線法）
每組取無菌培養皿2付，在皿底貼上標籤，注明事項。取已熔化 的牛肉膏蛋白腖培養基，倒入平皿，製成平板。
凝固後，用接種環取相應的 菌液一環（10－5或10－6）在平板上 劃線（教師作示範）。 1.連續劃線法：將挑取有樣品的接種環在平板培養基表面作連續 劃線（圖－5）。完畢後，倒置於28～300C溫室培養。 2.分區劃線法：用接種環以無菌操作挑取土壤稀釋液1環，先在 培養基的一邊作第一次平行劃線3—4條，再轉動培養皿約600C 角，並將接種環上剩餘物燒掉，待冷卻後通過第一次劃線部分作 第二次劃線會，同法依次作第三次和第四次劃線（見圖－5）。 劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置於28～300C溫室培養。
液體接種法：包括從斜面菌種接入培養液，或從液體菌 種接入液體培養液，兩種情況都可以用接種環接種。但 在培養量比較大的情況下，液體接種宜採用移液管接種， 同時要求無菌操作。
穿刺接種法：用接種針經火焰滅菌後，沾取少量菌種， 垂直地穿入試管固體培養基中心至底部，然後沿著原接 種線將針拔出，要做到手穩、動作輕巧迅速，最後塞上 棉塞。再將接種針上殘留的菌體在火焰上燒掉。
2. 用無菌的脫脂牛奶將新鮮斜面菌種製成牛奶菌種懸液，無菌 操作裝入安瓿管中（裝量不超過其體積的1/3)。 3. 預凍：將分裝好的安瓿管在－25～－400C之間的乾冰酒精 中進行預凍，1h後即可抽氣進行真空乾燥。 4.真空乾燥：預凍後放入真空乾燥箱中，開啟真空泵進行乾燥。 5.封管前將安瓿管裝入多歧管上，開啟真空泵，當真空度達到 0.01mm汞柱後用火焰熔封。 6.做好的安瓿管放入冰箱中保藏。
實驗程式17
（微生物培養中的氧氣條件－厭氧培養）
生产中常用菌种的分离、选育和保藏
生产中常用菌种的分离、选育和保藏在生产中，分离、选育和保藏常用菌种是非常重要的步骤，这些菌种可以用于各种不同的应用，如发酵过程中的生物转化、抗生素的生产以及食品工业中的乳酸发酵等。
以下是常用菌种的分离、选育和保藏的基本步骤：1. 分离：分离菌种是指从自然环境中分离出纯种菌株的过程。
首先，需要选择合适的样品来源，如土壤、水样或食品样品等。
然后，将样品进行稀释、接种到固体培养基上，培养出菌落。
最后，从菌落中挑选单一菌株，并进行纯化培养，得到纯种菌株。
2. 选育：选育是指对已有菌种进行进一步培养和筛选，选出优良品系。
在选育过程中，可以根据所需特性进行筛选，如产量高、抗性强或代谢产物优良等。
通过连续传代培养和筛选，可以逐步培育出符合要求的优良品系。
3. 保藏：保藏是为了长期储存和保存已经分离和选育得到的菌种。
常用的保藏方法包括冷冻保存和冷冻干燥等。
冷冻保存是将菌种保存在低温 (-80℃或液氮温度下)，可以长期保存并保持菌株的生物学性状。
而冷冻干燥则是在低温下将菌种先冷冻，然后通过真空蒸发使其脱水，最后用密封容器保存。
冷冻干燥具有长期保存时间和较小的储存体积的优点。
在菌种的分离、选育和保藏过程中，需要注意的是严格遵守无菌操作规范，以防止杂菌污染。
另外，应该建立相应的菌种信息管理系统，记录并标注每个菌株的来源、特性以及保藏条件等重要信息，以便日后使用和查询。
菌种的分离、选育和保藏在生产中扮演着极其重要的角色。
下面将进一步探讨这些过程，并介绍一些常用的菌种及其应用领域。
在分离菌种的过程中，重要的是选择适当的样品来源。
不同的环境中存在着各种微生物，如土壤、水体、植物、动物及其制品等。
通过采集不同来源的样品，可以获得不同类型和特性的微生物，从而得到多样性的菌株资源。
在接种前，样品经过稀释，使微生物适当分散。
然后将稀释液均匀接种于固体培养基上，并进行孵育。
在培养过程中，微生物通过分裂繁殖形成菌落，而每个菌落代表一个菌株。
微生物的菌种保藏
培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培
养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，
垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。
— 1—
• 菌种保藏方法
微 生
3.砂土管保藏法
物
将砂与土分别洗净、烘干、过筛，
的 菌 种
装于小试管中，砂土的高度约1cm， 121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3
保 藏
次。50℃烘干后经检查无误后备用。 将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子
— 1—
斜面低温保藏法操作步骤
1.斜面低温保藏法 2.固体穿刺保藏法 3.液体石蜡保藏法 4.沙土管保藏法 5.甘油保藏法
— 2—
• 菌种保藏方法操作步骤
微
生
1.斜面低温保藏法
物 的 菌
（1）贴标签 将注有菌株名称和日期的标签贴于试管斜面的正下方。 （2）接种 将待保藏的菌种用斜面接种法移接至注明菌名的试管
悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也
可直接刮下孢子与载体混匀，而后置
于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰
熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥
器中，在室温或4℃冰箱内保藏。
— 1—
• 菌种保藏方法
微
生 物 的
4.甘油悬液保藏法 此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本
菌 种 保
法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用－20℃， 保藏期约为0.5～1年，而采用－70℃，保藏期可达10年。
— 2—
• 菌种保藏方法
微
生 物 的
1.斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长
菌 种 保
完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定 时间再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。
菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。
(一)常规保藏方法1 目的1.1 了解菌种保藏的基本原理1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。
2 原理菌种保藏的方法很多。
其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。
使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。
依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。
一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。
3 材料3.1菌株待保藏的适龄菌株斜面3.2培养基肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。
3.3 试剂10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。
3.4 器具用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l 毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。
4 流程斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏5 步骤5.1斜面保藏5.1.1流程标记试管→接种→培养→保藏5.1.2步骤5.1.2.1贴标签取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。
在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。
在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.1.2.2斜面接种将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。
5.1.2.3培养置37恒温箱中培养48小时。
5.1.2.4保藏斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。
这种方法一船可保藏三个月至半年。
5.2半固体穿刺保藏5.2.1流程标记试管→穿刺接种→培养→保藏5.2.2 步骤5.2.2.1贴标签取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.2.2.2穿刺接种用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。
【高中生物】菌种保存和微生物常识
（生物科技行业）菌种保存和微生物常识菌种保存和微生物常识1、常用培养基的制备、灭菌与消毒营养：从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，满足生长和繁殖需要的一种生理过程。
是生命活动的物质基础，是生命活动的起点。
营养物：具有营养功能的物质。
也包括光能。
提供生物的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。
营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料。
要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。
2、选用和设计培养基的原则、方法及制备过程原则：目的明确、营养协调、经济节约物理化学条件适宜方法：生态模拟、查阅文献精心设计、试验比较步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查培养基种类：一、按成分的不同分天然培养基、合成培养基、半合成培养基二、按培养基的物理状态分固体培养基、液体培养基、半固体培养基三、按培养基用途基础培养基、选择培养基、加富培养基鉴别培养基消毒与灭菌：消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。
方法：一、物理的方法：加热、过滤、辐射二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。
主要破坏细菌代谢机能。
如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。
加热法：（1）干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。
1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。
2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。
原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。
3、注意事项：1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；2）温度控制在<180°；3）物品不能太挤；4）温度降至70°时才开箱门。
（2）湿热法：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。
实验六七食品微生物培养基的制备和灭菌微生物的分离培养和菌种保藏
实验六微生物培养基的制备和灭菌实验项目性质：综合实验所属课程名称：《微生物学实验》实验计划学时：5学时一、实验目的1.了解并掌握培养基的配制、分装方法；2.掌握各种实验室灭菌方法及技术。
二、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。
另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。
加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。
但多次反复融化，其凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。
一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
三、实验材料1、器皿及材料天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。
2、药品试剂蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。
3、流程称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。
四、实验步骤1 培养基的制备1.1 称量药品根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。
蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
1.2 溶解用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。
待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。
微生物菌种保藏的原理和方法
微生物菌种保藏的原理和方法微生物菌种保藏是指将微生物菌种保存在一定的条件下，以确保其持久的存活和繁殖能力。
微生物菌种的保藏可以用于科学研究、工业应用和生物资源保护等领域。
本文将介绍微生物菌种保藏的原理和方法。
微生物菌种保藏的原理主要包括冷冻保藏、干燥保藏和液氮冷冻保藏等。
冷冻保藏是将微生物菌种保存在低温条件下，常见的温度为-70℃或-80℃。
低温可以减缓微生物的新陈代谢过程，降低细胞内酶的活性，从而延缓细胞的老化和死亡。
冷冻保藏的关键是要使用适当的保藏液，如冻干保藏液、甘油保藏液等，以保护细胞在冷冻过程中的完整性和活力。
干燥保藏是将微生物菌种保存在无水或低水分条件下。
干燥可以通过脱水或真空干燥等方法实现。
干燥保藏的原理是通过降低细胞内水分含量，使微生物处于休眠状态，从而延缓细胞的代谢活动和老化过程。
干燥保藏的关键是要选择适当的干燥剂，如硅胶、脱水剂等，以吸附和吸收细胞内的水分。
液氮冷冻保藏是将微生物菌种保存在液氮温度下，常见的温度为-196℃。
液氮冷冻保藏的原理是通过极低的温度和极低的氧气浓度，使微生物处于极度低温和低代谢状态，从而延缓细胞的老化和死亡。
液氮冷冻保藏的关键是要使用适当的冷冻容器，如液氮罐、冷冻管等，以确保微生物菌种的长期保存。
微生物菌种保藏的方法包括冻干法、冷冻法、液氮冷冻法等。
冻干法是将微生物菌种培养物冻干后保存。
冻干法的步骤包括培养微生物菌种、制备冻干保藏液、将菌种混合冻干保藏液后冻干、密封保存。
冻干法保存的菌种可以长期保存，并且对于某些对冷冻保存敏感的微生物有一定的保护作用。
冷冻法是将微生物菌种保存在低温条件下。
冷冻法的步骤包括培养微生物菌种、制备冷冻保藏液、将菌种混合冷冻保藏液后冷冻、保存在低温条件下。
冷冻法保存的菌种可以长期保存，并且对于某些对冷冻保存敏感的微生物有一定的保护作用。
液氮冷冻法是将微生物菌种保存在液氮温度下。
液氮冷冻法的步骤包括培养微生物菌种、制备液氮保藏液、将菌种混合液氮保藏液后保存在液氮温度下。
细菌的分离纯化生化试验以及保种
观察。
2、染色观察
• 固定的目的：
• 杀死细菌并使菌体粘附于坡片上。 • 增加细菌对染料的亲和力。
• 常用的方法有酒精灯火焰加热和化学固定二种。
染色观察
简单染色法 正染色 鉴别染色法 死菌 细菌染色法 革兰氏染色法 抗酸性染色法 芽孢染色法 姬姆萨染色法
负染色：荚膜染色法等 活菌: 用美蓝或TTC（氯化三苯基四氮唑）等 作活菌染色
项目总览
1、细菌的分离 2、生化试验 3、药敏试验 4、保存
制作: 宋云杰 指导: 薛永康
原理：在固体平板培养基上，用划线的方法或 用稀释涂布的方法将混杂菌群的微生物各个分 开，通过挑选单菌落而分离微生物。
特点： 快速、方便。 分区划线： 适用于浓度 较大的样品； 连续划线： 适用于浓度 较小的样品；
药敏片的制作
取定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸 片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中， 瓶口以单层牛皮纸包扎。经15-20分钟高压消毒后， 放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。 抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素 瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片 充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同 时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜， 干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮， 置阴暗干燥处存放，有效期3-6个月。 药液的制备（用于商品药的试验）：按商品药的 使用治疗量的比例配制药液。
生化试验指导方案
生化试验结果记录
• • • •
1、注意无菌操作 2、防止杂菌的污染 3、配试剂时要准确精准 4、注意留取空白对照
通过药敏试验可以得到所检测细菌敏感 的药物，用于疾病的准确治疗。在选择 合适的药物后，还要注意轮换用药，减 少同一种药物使用的频率，从而减少细 菌耐药性产生的机率。 注意事项： 1.药敏纸片的制作。 2.《药敏试验的操作执行标准》美国临 床试验协会。2008年版
中国医学微生物菌种保藏管理办法
病原微生物菌（毒）种和样本的重要性段丽莉. 菌种保管应有专人负责，保存于冰箱中，房门专人加锁，确保菌种安全。
保管人员变动时，必须严格交接手续。
2、菌种应有严格的登记，包括形态，分离日期，鉴定日期，签发者，主要鉴定性能（包括形态、染色、抗原结构、动物致病力等），并注明使用、转移、销毁情况及原因。
3、各种菌种应按规定时间接种，一般在接种三次后作一次全面的鉴定，注意菌种有无污染及变异，如发现变异时，应及时更换。
4、菌种保存范围及向外单位转移，应按国家卫生部规定执行。
5、所有存在菌种应具备清单。
编写：审核：批准：批准日期：主要内容病原微生物菌（毒）种和样本是国家重要生物资源，是保障生物安全和国家经济安全与稳定的重要战略资源。
是人类传染病预防、诊断和治疗以及医学科研和教学事业的基础和重要支撑条件，也是保障食品安全、生物安全以及抵御生物恐怖袭击的前提条件。
病原微生物菌（毒）种和样本病原微生物菌（毒）种和样本由于其本身所具有的特殊性，在其采集、携带、运输、保藏管理和使用过程中必须强调生物安全，必须符合国家传染病防治、医学微生物菌（毒）种管理有关法规的规定。
其管理不仅强调在硬件设备上要符合微生物安全防护的要求，更重要的是强调所有管理人员、工作人员在日常工作中要有常备不懈的防护意识和守法观念。
菌（毒）种分类按照微生物结构、组成分为三大类：原核细胞型微生物：细菌、支原体、立克次体、衣原体、螺旋体和放线菌。
真核细胞型微生物：真菌非细胞型微生物：病毒中国医学微生物菌种保藏管理办法第二条菌种的分类菌（毒）种的分类根据其危险性决定的对实验室感染的可能性；人体感染后发病的可能性；发病后症状轻重及愈后情况；有无致命危险及有效的防止实验室感染方法；用一般的微生物操作方法能否防止实验室污染；我国有否此种菌种及曾否引起流行人群免疫力等情况。
依其危险程度的大小，我国的菌(毒)种分为四类。
中国医学微生物菌种保藏管理办法第二条菌种的分类一类：实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌（毒）种。
菌种操作规程
菌种操作规程菌种操作是微生物实验室中非常重要的一项工作，它涉及到菌种的储存、分离、培养和传代等操作。
以下是一份常见的菌种操作规程，以确保实验室操作的安全性和结果的准确性。
一、菌种的储存1. 菌种的储存通常采用液氮冷冻或低温冰箱冷冻的方式。
2. 菌种的储存容器应该选择无菌的冻干管、冻存瓶或冷冻管，并在储存前进行无菌处理。
3. 在冷冻储存前，应制备菌种的冻存物质，如15%甘油溶液，以确保菌种冷冻过程中的生存率。
二、菌种的分离1. 菌种的分离通常采用扩散法、涂布法或稀释法等方法。
2. 在进行菌种分离前，实验室的工作台、培养皿和所需工具应进行彻底的消毒和无菌处理。
3. 分离出的纯菌落应进行单克隆处理，避免混菌的情况。
三、菌种的培养1. 发放和接收菌种时，应注意标签的准确性，并确认菌种的来源和鉴定信息。
2. 菌种的培养应选择适当的培养基和培养条件，以促进菌种的生长和代谢。
3. 在进行菌种培养时，应注意无菌操作，避免菌种的污染。
四、菌种的传代1. 菌种的传代应选择适当的传代方法，如子代分离、液体培养或固体培养等。
2. 传代菌种前，应将培养皿等实验器具进行干燥消毒，并进行无菌处理。
3. 在进行菌种传代时，应注意选择合适的传代时间和传代次数，避免菌种的突变和变异。
五、菌种的保管1. 菌种的保管应采取适当的方法，如冷冻保存、液氮冷冻保存或继代保存等。
2. 在进行菌种保管时，应注意保存容器的密封性和标识的清晰性。
3. 对于保存已久的菌种，应定期进行复苏培养，以维持菌种的活力和纯度。
六、菌种的管理1. 每次使用菌种前，应查验菌种的保藏情况和标签信息，并进行必要的鉴定。
2. 菌种管理应建立清晰的档案记录，包括菌种的来源、分离日期、储存方式和使用情况等。
3. 菌种的使用应按照实验室的安全操作规程进行，避免对环境和人员的污染。
对于菌种操作的规程，实验室应制定具体的操作细则，并根据实验室的实际情况进行调整和完善。
同时，实验室操作人员应接受相关培训，掌握正确的操作技巧和安全意识，以确保菌种操作的准确性和安全性。
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微生物培养中的氧气条件－厌氧培养
美兰氧化还原指示剂： 0.006N NaOH 0.015% 美兰溶液 6％ 葡萄糖溶液 上列三种溶液在使用时 等量混合，加热使美兰 退色，迅速放入厌氧罐 中。
微生物培养中的氧气条件－厌氧培养
微生物培养中的氧气条件－厌氧培养
生物学方法：利用植物呼吸作用，造成厌氧条件，常用的方 法是在密封的干燥器底部放入发芽种子，因种子的呼吸作用 增强，吸收氧气，创造厌氧条件。此法简易，但厌氧程度低。 化学方法：利用焦性没食子酸吸收容器中的氧气。在容器的 一边放一包用吸水紙包好的焦性没食子酸，在另一边放入碱 液，容器密封后，让碱液流向焦性没食子酸一边，两者反应 时吸收容器中的氧气，创造厌氧条件。 物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器内的空气或再充入其 它惰性气体，以保证厌氧条件。抽气前，容器内放入指示剂 和培养物。一般为达到严格厌氧目的，常采用物理和化学相 结合并用的方法。
实验程序5
（四大类微生物菌落形态的比较和识别）
区分和识别各大类微生物通常包括菌落形态（群体形态） 和细胞形态（个体形态）两方面的观察。 菌落形态： 菌落表面湿润：细菌——薄而小，酵母菌——厚而大。 菌落表面干燥：放线菌——密而小，霉菌——松而大。 气味 细胞形态： 细菌——小而分散 酵母菌——大而分散 放线菌——丝状细 霉菌——丝状粗
图－1
土壤稀释液的制备和稀释液的取样
微生物的分离—平板涂抹法 每组取无菌培养皿2付。在皿底贴上标签，注明分离 菌名、稀释度、组别、班级。 凝固后，另取一支吸管吸取10－3或10－4的土壤稀释 液0.2mL放在平板上。 用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。倒 置于28～30℃条件下培养6～7d，观察放线菌菌落 形态及计数菌落，并计算出每g土壤中放线菌的数量 （方法同上）。 挑取单个菌落，接种于相应的斜面培养基上，如果 不纯，再移植纯化，至最后得到纯培养为止。
4.伏-普二氏试验(V.P 试验) 将被检菌接种到葡萄 糖蛋白胨水培养基中， 37℃培养48h。
实验程序
微生物的分离 微生物的接种方法（示范） 微生物培养中的氧气条件 微生物的菌种保藏方法 四大类微生物菌落形态的比较和识别
实验程序1
（微生物的分离）
用平板涂抹法分离土壤中的放线菌 用平板划线法分离污水中的细菌
微生物的分离—稀释平板法
制备土壤稀释液：(无菌操作过程见教师示范） 1. 称取土壤0.5g，放入50mL无菌水的三角瓶中，振荡 10min，即为稀释10－2的土壤悬液。 2. 另取装有4.5mL无菌水试管4支，用记号笔编上10－3、10 －4、10－5、10－6。取已稀释成10－2的土壤液，振荡后静止 0.5min，用无菌吸管吸取0.5mL土壤悬液加入10－3的无菌水 的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成 10－3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10－4 、10－5、10－6 土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，应用一支吸管由浓到稀，稀释到底， 稀释方法见图-1。
实 验
结 束
实验八
细菌鉴定中常用的 生理生化反应
实验目的和内容
a. 了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常 用的生理生化反应的测定方法； b. 通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利 用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样性； c. 了解细菌在不同培养基中的不同生长现象及其代 谢产物在鉴别细菌中的意义；
砂土管保藏法：(可用于保藏产孢子的放线菌、霉菌和产芽孢的 细菌）。 1.砂土管的制备：取河沙若干，用40目过筛，出去大颗粒，加 10%HCl后煮沸30min，除去有机质（也可用10%HCl浸泡2—4h)。 最后倒去酸水，用自来水冲洗至中性，烘干备用。另取0.3m以 下非耕作层的瘦黄土若干，晒干磨细，过120目筛。 2.按 土：砂＝1：4 的比例均匀混合，装入指形管中，以1cm 高为宜，塞上棉塞，160～170℃干热灭菌2h。 3.在新鲜菌种斜面上加入3mL左右的无菌水，用无菌接种环制 成菌悬液，用无菌吸管吸取0.2～0.3ml的菌悬液放入每个砂土 管中，用接种环拌匀，并贴上标签，注明菌名。 4.菌液加好后，立即进行抽真空干燥，要求在24h内抽干，尤其 是夏天要求较短时间内抽干。摇散砂土，放干燥器内冰箱保藏。
无菌操作简介
微生物的接种方法—液体接种和穿刺接种
液体接种法：包括从斜面菌种接入培养液，或从液体菌 种接入液体培养液，两种情况都可以用接种环接种。但 在培养量比较大的情况下，液体接种宜采用移液管接种， 同时要求无菌操作。 穿刺接种法：用接种针经火焰灭菌后，沾取少量菌种， 垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后沿着原接 种线将针拔出，要做到手稳、动作轻巧迅速，最后塞上 棉塞。再将接种针上残留的菌体在火焰上烧掉。
实验仪器,材料和用具
培养基
1葡萄糖发酵培养基(糖类发酵试验) 2乳糖发酵培养基(糖类发酵试验) 3甲基红(葡萄糖蛋白胨水培养基) 4V.P试验(葡萄糖蛋白胨水培养基) 5柠檬酸盐利用试验（柠檬酸盐利用试验） 6吲哚试验(蛋白水培养基) 7硫化氢试验(硫化氢培养基) 8淀粉培养基(淀粉水解试验)
实验步骤
实验程序4
（微生物的菌种保藏方法）
菌种保藏是微生物学工作中的重要一环，微生物菌种保藏的 目的要求达到以下三点： 1.保持原种性状,延缓或防止退化。 2.保持活力而不死。 3.保证纯培养，防止污染。 微生物菌种保藏的关键是使微生物代谢作用缓慢，处于休眠 状态。为此，要求降低其体内酶的活性。一般采用低温、干 燥和缺氧条件来实现。 菌种保藏的方法有: 冰箱斜面保藏、石蜡封藏法、砂土管保 藏法、冷冻低温干燥法和液氮保藏法等。
实验仪器,材料和用具
实验仪器
37℃恒温培养箱、20℃恒温培养箱（室温代替）。 大肠杆菌、枯草杆菌这二种菌种的斜面各1支。 甲基红试剂、V．P试剂、吲哚试剂、格里斯试剂(硝酸 盐利用试验)、卢戈氏碘液(淀粉水解试验)
微生物材料
试剂
实验仪器,材料和用具
实验用具
试管：每份每个试验2支试验，8个试验共16支。 无菌平皿：每份2个 杜氏小管：每份4个。 接种环、酒精灯、试管架、记号笔。
四大类微生物菌落形态的比较和识别
思考题
什么叫无菌操作？ 平板培养时为什么要把培养皿倒置？ 好氧培养和厌氧培养的原理和方法有何异同？ 试述菌种斜面冰箱保藏、石蜡封藏和砂土管 保藏等方法的原理。
试验报告
平板涂布法 划线分离法原理操作 微生物菌落特点，描述一个菌落 菌种保藏的要求，及菌种保藏的主要方法
高氏培养基用于涂布平板（梯度稀释法取 0.2ml，用推棒推匀）（浅色培养基） 牛肉膏培养基用于划线分离（分离所使用 的污水在试管架的试管中）
实验程序2
（微生物的接种方法—斜面接种法）
左手平托两支试管，拇指按住试管底部。外侧使是菌 种试管，内侧是待接的空白斜面。（两支试管的斜面 同时向上），右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔 出。 右手拿接种环，在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将 有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。 将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指和掌 心将两支试管的棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中， 然后让试管口缓缓过火焰。 将已灼烧过的接种环伸入外侧的菌种试管内。先冷却， 而后再用环沾取一定量的菌苔，将沾有菌苔的接种环 抽出试管。
微生物的分离—平板划线法
每组取无菌培养皿1付，在皿底贴上标签，注明事项。取已熔化 的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿，制成平板。 凝固后，用接种环取相应的 菌液一环（10－5或10－6）在平板上 划线（教师作示范）。 1.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续 划线。完毕后，倒置于28～300C温室培养。 2.分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在 培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约600C 角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作 第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖 上皿盖，倒置于28～300C温室培养。 挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最 后得到纯培养。
微生物的菌种保藏方法
斜面冰箱保藏法：将菌种接在新鲜斜面培养基上，定温培养长 出丰满菌苔后，一般形成芽孢的细菌要形成芽孢，形成孢子的 微生物要长出孢子，贴上标签，放在试管架上，在棉塞部位用 尼龙紙或防水紙包好，放入4℃ 冰箱中保藏。一般每隔3个月 至半年用新鲜培养基移植1次。方法简便，实验室均采用。 缺点：移接代数太多，易产生变异、退化。 石蜡封藏法：在已长好的斜面菌种上加入无菌液体石蜡油，高 出斜面1cm直立试管放入冰箱保藏，适用保存细菌和放线菌。 石蜡的处理：250mL三角瓶装100mL液体石蜡，1.05kg/cm3 高压灭菌30min，然后放在105℃ 左右的烘箱中1h，使水分蒸 发掉。
微生物的分离、培养和菌种保藏
微生物的分离、培养和菌种保藏
目的要求 实验材料 试验程序 思考题
目的要求
初步掌握微生物的分离、培养和菌种保藏 的基本方法。 练习微生物接种、移植和培养的基本技术， 掌握无菌操作技术。
实验材料
样品：新鲜土壤。 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏1 号培养基。 无菌水：装有50mL无菌水三角瓶（配土壤悬液使 用）、装有250mL无菌水三角瓶（梯度稀释使 用）、4支空的无菌试管。 其它：取液器(5000 μl, 1000 μl, 各一支);无菌培 养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、天平、记号笔、 接种环、酒精灯、火柴、水浴锅。
迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管的底部， 轻轻向上划线（直线或曲线）。 接好种的斜面试管口再次过火焰，棉塞底部过火焰后立即 塞入试管内。 将沾有菌苔的接种环在火焰上烧红灭菌。先在内焰中烧灼， 使其干燥后，再在外焰中烧红，以免菌苔骤热，使菌体爆 溅，造成污染。 放下环后，再将棉塞旋紧，在试管斜面上距试管口2～ 3cm处贴上标签。 28～37 ℃ 恒温培养。