第五章.基因工程

1．粘性末端DNA片段的连接和单切点的 磷酸化 2．平末端DNA片段的连接 （1）T4DNA连接酶法 （2）同聚物加尾法 （3）用化学合成的衔接物连接DNA分子
第三节

其他工具酶
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶） 三、T4DNA聚合酶 四、逆转录酶 五、末端脱氧核苷酰转移酶 六、核酸酶S1 七、核酸酶BAL31 八、外切核酸酶Ⅲ 九、T4多聚核苷酸激酶 十、碱性磷酸酶 十一、 甲基化酶
分类： Ⅰ Ⅱ Ⅲ
Ⅰ ：识别和切割位点不固定，随机性。 Ⅲ ：核酸内切酶活性和甲基化活性是 不分开的。 Ⅱ：能在识别位点处切割DNA，切割位 点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性 是分开的。常用。
四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性
识别序列 ：1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序 列 2.回文结构：两个顺序相同的拷贝 在DNA链上呈反向排列。 EcoRⅠ 5 ’-G AATTC-3 ’ 3 ’-CTTAA G-5 ’
可催化DNA片段上的3’-OH端加接脱氧核 糖核苷酸。 常用于同种碱基多聚体接尾反应 核素标记DNA片段的3’端

六、核酸酶S1
可以降解单链DNA和RNA (1)将DNA切成平末端。有些限制性内切核酸酶 可以将DNA切成粘性末端，经过核酸酶S1降解 可切除DNA末端的单链。生成平末端DNA。 (2)切除cDNA中单链发夹状结构。反转录反应 合成的cDNA，可能形成单链发夹状结构，为 了得到平末端cDNA可用核酸酶S1 分解，生成 无发夹结构的cDNA。 (3)可用核酸酶S1 分析DNA· RNA杂交分子的结 构。
二、基因工程的基本程序 a b 剪切 b
载体质粒
A 外源DNA片段 A b 引入宿 主细胞 选出含有重 组DNA的细 胞扩增表达
外源DNA插入
第五章
分子克隆常用的工具酶
第一节 限制性核酸内切酶与DNA 分子的体外切割 第二节 DNA连接酶和DNA分子的 体外连接 第三节 其他工具酶
第一节
限制性核酸内切酶与DNA 分子的体切割

（1）标记粘性末端. -32P—dNTP 标记平末端 -32P—dNTP （2）将5’端伸出的末端填平 （3）可用来反转录合成双链cDNA。 （4）补平粘性末端。

三、T4DNA聚合酶

具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。 其外切酶活性比E.coli DNA聚合酶I的活 性高200倍。 取代反应
经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型
பைடு நூலகம்
1.粘性末端 (1)3’-OH单链延伸的粘性末端.如：Pst Ⅰ 5’-CTGCA G-3’ 5’-CTGCA G-3’
3’-G ACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’
(2)5’-P单链延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ 5’-G AATTC-3’ 5’-G AATTC-3’
T4多聚核苷酸激酶
能将ATP上的γ位磷酸转移到单链或双链DNA或RNA的5′OH上，可将γ-32P-ATP中的32P连接到5′端的5′-OH上，以完成寡 聚核苷酸的核素标记。
八、外切核酸酶Ⅲ
它的功能是将带有3 ’-OH末端的双链DNA从 3 ’到5 ’端方向切除，产生5 ’单核苷酸
3’-CTTAA G-5’ 3’-CTTAA G-5’
2.平末端 如:SmaⅠ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’
两种特殊的限制酶
(1)同尾酶 识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的
两种酶。如：BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ
(2)同裂酶
识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两 种酶 。如:Mbo Ⅰ和Sau3AⅠ共同识别序列GATC ，但对 GmeATC切点,前者不能切，后者能切。
十一、

甲基化酶
常见的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶， 可使相应碱基甲基化。dam可在限制酶识 别的5′GATC3 ′或5′GAAT3 ′序列的5′腺嘌 呤N6位上引入甲基。dcm可在限制识别的 5′CCAGG3 ′或5′CCTGG3 ′序列的5′胞嘧 啶引入甲基。常用于使酶切位点中的碱 基甲基化而避免降解，保护酶切位点。
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

1.三种活性 （1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP时） （2）3’外切酶活性 （无dNTP时大亚基活性） （3）5’外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活性） 2.在基因工程中的应用 ：缺口平移标记技术。
二、DNA聚合酶Ⅰ大片段 （Klenow酶）
1.DNA聚合酶活性 （切除小亚基，保留大亚基） 2. 3’外切酶活性（无dNTP时） 3. 在基因工程中的应用
四、逆转录酶
逆转录酶可以RNA为模板，逆转录成cDNA 第一链，又称依赖RNA的DNA聚合酶。 1.聚合酶活性 RNA或DNA为模板 2. 3’外切酶活性 能使DNA-RNA杂合链中的 RNA降解。 应用： 1.RT-PCR 使mRNA逆转录成cDNA 2.制备探针。
五、末端脱氧核苷酰转移酶
十、碱性磷酸酶
该酶的功能是以单链或双链的DNA、 RNA为基质，将DNA或RNA片段5’端的 磷酸切除，产生5’-OH。 应用：

– (1)用该酶催化切除DNA或RNA5’端的磷酸,
然后加上γ-32P-NTP在DNA多聚核苷酸激酶 的作用下标记5’端。 – (2)用于避免单酶切后质粒自我环化。
命名
HindⅢ
H: Haemophilus 嗜血杆菌属 in: influenzae 流感 d: Rd株 Ⅲ：该菌株中第三个被分离到的限制酶
同尾酶BamHI和BglII
AGATCT TCTAGA BglⅡ A TCTAG GGATCC CCTAGG BamHI GATCC G T4连接酶 AGATCC （连接后的切点均不能被上述两种酶切） TCTAGG
第二节

DNA连接酶和DNA分子的 体外连接
一、DNA连接酶 DNA连接酶（Ligase）是一种能 够催化在双股DNA链的3′-OH和5′-P 之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互 补粘性末端或平端以及缺口修复，不 能连接单链DNA或裂口. 温度 二、DNA分子的体外连接
二、DNA分子的体外连接
核酸酶BAL31
从线形DNA分子两端（粘端/平端）以渐进方式切去单核 苷酸，以形成寡聚核苷酸或制造末端缺失。此外也有类似于SI 酶单链特异降解活性，可除去粘性末端或单链发夹结构。
外切核酸酶Ⅲ
能从线性DNA的3′-OH末端沿3 ′→ 5′方向切去单核苷酸， 制造3 ′端缺失，制备DNA模板或特异DNA探针。

限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链 DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切 割DNA双链结构的核酸内切酶。 一、寄主控制的限制与修饰作用如图2-1，图22 二、限制性核酸内切酶的制备方法 三、限制性核酸内切酶分类和命名 四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 五、影响限制性内切酶活性的因素






五、影响限制性内切酶活性的因素 1.DNA的纯度 2. DNA的甲基化 （1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌 （2）研究基因工程DNA的甲基化程度 （3）改变限制酶的识别特性 3.温度 4.分子结构 5.限制酶的缓冲液 星号活性 EcoRⅠ切 GAATTC EcoRⅠ*切 pupuATpypy 或AATT