第五章.基因工程

命名
HindⅢ
H: Haemophilus 嗜血杆菌属 in: influenzae 流感 d: Rd株 Ⅲ：该菌株中第三个被分离到的限制酶
同尾酶BamHI和BglII
AGATCT TCTAGA BglⅡ A TCTAG GGATCC CCTAGG BamHI GATCC G T4连接酶 AGATCC （连接后的切点均不能被上述两种酶切） TCTAGG
T4多聚核苷酸激酶
能将ATP上的γ位磷酸转移到单链或双链DNA或RNA的5′OH上，可将γ-32P-ATP中的32P连接到5′端的5′-OH上，以完成寡 聚核苷酸的核素标记。
八、外切核酸酶Ⅲ
它的功能是将带有3 ’-OH末端的双链DNA从 3 ’到5 ’端方向切除，产生5 ’单核苷酸
十、碱性磷酸酶
该酶的功能是以单链或双链的DNA、 RNA为基质，将DNA或RNA片段5’端的 磷酸切除，产生5’-OH。 应用：

– (1)用该酶催化切除DNA或RNA5’端的磷酸,
然后加上γ-32P-NTP在DNA多聚核苷酸激酶 的作用下标记5’端。 – (2)用于避免单酶切后质粒自我环化。
核酸酶BAL31
从线形DNA分子两端（粘端/平端）以渐进方式切去单核 苷酸，以形成寡聚核苷酸或制造末端缺失。此外也有类似于SI 酶单链特异降解活性，可除去粘性末端或单链发夹结构。
外切核酸酶Ⅲ
能从线性DNA的3′-OH末端沿3 ′→ 5′方向切去单核苷酸， 制造3 ′端缺失，制备DNA模板或特异DNA探针。
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

1.三种活性 （1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP时） （2）3’外切酶活性 （无dNTP时大亚基活性） （3）5’外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活性） 2.在基因工程中的应用 ：缺口平移标记技术。
二、DNA聚合酶Ⅰ大片段 （Klenow酶）
1.DNA聚合酶活性 （切除小亚基，保留大亚基） 2. 3’外切酶活性（无dNTP时） 3. 在基因工程中的应用






五、影响限制性内切酶活性的因素 1.DNA的纯度 2. DNA的甲基化 （1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌 （2）研究基因工程DNA的甲基化程度 （3）改变限制酶的识别特性 3.温度 4.分子结构 5.限制酶的缓冲液 星号活性 EcoRⅠ切 GAATTC EcoRⅠ*切 pupuATpypy 或AATT
第二节

DNA连接酶和DNA分子的 体外连接
一、DNA连接酶 DNA连接酶（Ligase）是一种能 够催化在双股DNA链的3′-OH和5′-P 之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互 补粘性末端或平端以及缺口修复，不 能连接单链DNA或裂口. 温度 二、DNA分子的体外连接
二、DNA分子的体外连接
可催化DNA片段上的3’-OH端加接脱氧核 糖核苷酸。 常用于同种碱基多聚体接尾反应 核素标记DNA片段的3’端

六、核酸酶S1
可以降解单链DNA和RNA (1)将DNA切成平末端。有些限制性内切核酸酶 可以将DNA切成粘性末端，经过核酸酶S1降解 可切除DNA末端的单链。生成平末端DNA。 (2)切除cDNA中单链发夹状结构。反转录反应 合成的cDNA，可能形成单链发夹状结构，为 了得到平末端cDNA可用核酸酶S1 分解，生成 无发夹结构的cDNA。 (3)可用核酸酶S1 分析DNA· RNA杂交分子的结 构。

（1）标记粘性末端. -32P—dNTP 标记平末端 -32P—dNTP （2）将5’端伸出的末端填平 （3）可用来反转录合成双链cDNA。 （4）补平粘性末端。

三、T4DNA聚合酶

具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。 其外切酶活性比E.coli DNA聚合酶I的活 性高200倍。 取代反应
分类： Ⅰ Ⅱ Ⅲ
Ⅰ ：识别和切割位点不固定，随机性。 Ⅲ ：核酸内切酶活性和甲基化活性是 不分开的。 Ⅱ：能在识别位点处切割DNA，切割位 点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性 是分开的。常用。
四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性
识别序列 ：1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序 列 2.回文结构：两个顺序相同的拷贝 在DNA链上呈反向排列。 EcoRⅠ 5 ’-G AATTC-3 ’ 3 ’-CTTAA G-5 ’
十一、

甲基化酶
常见的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶， 可使相应碱基甲基化。dam可在限制酶识 别的5′GATC3 ′或5′GAAT3 ′序列的5′腺嘌 呤N6位上引入甲基。dcm可在限制识别的 5′CCAGG3 ′或5′CCTGG3 ′序列的5′胞嘧 啶引入甲基。常用于使酶切位点中的碱 基甲基化而避免降解，保护酶切位点。
经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型
1.粘性末端 (1)3’-OH单链延伸的粘性末端.如：Pst Ⅰ 5’-CTGCA G-3’ 5’-CTGCA G-3’
3’-G ACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’
(2)5’-P单链延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ 5’-G AATTC-3’ 5’-G AATTC-3’
3’-CTTAA G-5’ 3’-CTTAA G-5’
2.平末端 如:SmaⅠ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’
两种特殊的限制酶
(1)同尾酶 识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的
两种酶。如：BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ
(2)同裂酶
识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两 种酶 。如:Mbo Ⅰ和Sau3AⅠ共同识别序列GATC ，但对 GmeATC切点,前者不能切，后者能切。
四、逆转录酶
逆转录酶可以RNA为模板，逆转录成cDNA 第一链，又称依赖RNA的DNA聚合酶。 1.聚合酶活性 RNA或DNA为模板 2. 3’外切酶活性 能使DNA-RNA杂合链中的 RNA降解。 应用： 1.RT-PCR 使mRNA逆转录成cDNA 2.制备探针。
五、末端脱氧核苷酰转移酶
二、基因工程的基本程序 a b 剪切 b
载体质粒
A 外源DNA片段 A b 引入宿 主细胞 选出含有重 组DNA的细 胞扩增表达
外源DNA插入
第五章
分子克隆常用的工具酶
第一节 限制性核酸内切酶与DNA 分子的体外切割 第二节 DNA连接酶和DNA分子的 体外连接 第三节 其他工具酶
第一节
限制性核酸内切酶与DNA 分子的体切割

1．粘性末端DNA片段的连接和单切点的 磷酸化 2．平末端DNA片段的连接 （1）T4DNA连接酶法 （2）同聚物加尾法 （3）用化学合成的衔接物连接DNA分子
第三节

其他工具酶
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶） 三、T4DNA聚合酶 四、逆转录酶 五、末端脱氧核苷酰转移酶 六、核酸酶S1 七、核酸酶BAL31 八、外切核酸酶Ⅲ 九、T4多聚核苷酸激酶 十、碱性磷酸酶 十一、 甲基化酶

限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链 Dຫໍສະໝຸດ BaiduA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切 割DNA双链结构的核酸内切酶。 一、寄主控制的限制与修饰作用如图2-1，图22 二、限制性核酸内切酶的制备方法 三、限制性核酸内切酶分类和命名 四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 五、影响限制性内切酶活性的因素