第四章 发酵工程

27
二 、沉淀法

沉淀法是指利用某些抗生素具有两性的性质，使其在等电点 时从溶液中游离沉淀出来或在一定PH条件下，能与某些酸、碱或 金属离子形成不溶性或溶解度很小的 复盐，使抗生素从发酵滤 液中沉淀析出，以及改变pH值等条件时，此种复盐又易分解或重 新溶解的特性，来提取抗生素的一种方法。
罐可用微孔压差法或打开接种阀在火焰的菌丝形态观察和生化
分析，以确保种子质量。
21
三、发酵


发酵的目的是使微生物产生大量的目的产物，是发酵工序的 关键阶段。发酵一般是在钢或不锈钢的罐内进行，有关设备和培 养基应事先经过严格灭菌，然后将长好的种子接入，接种量一般 为5％～20％.在整个发酵过程中要不断地通气，搅拌，维持一定 的罐温，罐压，并定时取样分析和无菌试验，观察代谢和产物含 量情况，有无污染。在发酵过程中会产生大量泡沫，所以往往要 加入消沫剂来控制泡沫。加入酸碱控制发酵液的pH值，多数品种 的发酵还需要间歇或连续加入葡萄糖及铵盐化合物，或补进其他 料液和前体以促进产物的产生。 发酵中可供分析的参数：通气量、搅拌转速、罐温、罐压、 培养基总体积、粘度、泡沫情况、菌丝形态、pH、溶解氧、排气 中CO2含量以及培养基中的总糖、还原糖、总氮、氨基氮、磷和 产物含量等。一般根据品种的需要与可能，测定其中若干项目。 发酵周期因品种不同而异，大多数微生物发酵周期约为2～8d， 但也有少于24h或长达两周以上的。
24
第五节 发酵工艺控制（1）





一、培养基的影响及其控制 1、碳源 2、氮源 3、无机盐和微量元素 4、水 二、温度的影响及其控制 1、影响发酵温度变化的因素 ⑴生物热⑵搅拌热⑶蒸发热⑷辐射热 2、温度的选择也控制 ⑴最适温度的选择 ⑵温度的控制
25
第五节 发酵工艺控制（2）
22
四、产物提取


发酵完成后得到的发酵液是一种混合物，其中含 有表达的目的产物外，还有残余的培养基、微生物代 谢产物的各种杂质和微生物的菌体等。 提取过程包括以下三个方面： ①发酵液的预处理和过滤; ②提取; ③精制.
23
第四节 发酵方式


在制备大量微生物菌体或其代谢产物时，可采用 不同的发酵方式。微生物的发酵方式可分为分批发酵、 补料分批发酵和连续发酵。 一、分批发酵 二、补料分批发酵 三、连续发酵



三、溶解氧的控制 1、溶氧的影响 2、发酵过程的溶氧的变化 3、溶氧浓度的控制 四、pH的影响极其控制 1、pH对发酵的影响 2、pH的变化 3、发酵pH的确定和控制 ⑴发酵pH的确定⑵ pH的控制
26
第六节 发酵产物的提取
提取过程是指将发酵液中的微生物代谢产物初步抽提、 浓缩和纯化。提取方法一般有吸附法、沉淀法、溶剂萃取法、 离子交换法4种。 一、吸附法 利用适当的吸附剂（如活性炭白土氧化铝等），在一定 的pH条件下，使发酵液中的抗生素被吸附剂吸附，然后改变 pH，以适当的洗脱剂（一般为有机溶剂）把抗生素从吸附剂 上解吸下来，以达到浓缩和提纯的目的，这样的提取法称为 吸附法 。如早期提取青霉素、链霉素、维生素B12等都曾 用过吸附法。 吸附法的优点是操作简单，原料易解决，成本较低。
自然选育就是将正变菌株挑选出来，进行扩大培养。 自然选育可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产水平、 提高产物产量的目的。但是自然选育存在效率低和进展慢的缺点，将 自然选育和诱变育种交替使用，才容易收到良好的效果。
12

三、诱变育种（1）

用人工方法来诱发突变是加速基因突变的重要手段，它的突 变率比自然突变提高成百上千倍。突变发生部位一般在DNA上，因 此突变后形状能稳定遗传。 变异：微生物在生理和形态上的变化只要是可遗传的都称为变异。
10

一、菌种选育的物质基础

微生物的一切性状包括形态和生理都决定于菌体内的各种酶。 而DNA是支配着这许许多多酶有条不紊地行使其功能，使同一种微 生物的上下代酶的种类、功能都一样。决定遗传性状的DNA主要集 中在染色体上，只有少数游离在外。DNA分子结构的改变是诱变育 种的工作依据，染色体搭配的变化交换是杂交育种的依据。对DNA 分子结构和它复制过程的了解将更有利于充实诱变育种的理论根 据。另外，质粒也是遗产物质，它是染色体外的遗产结构。许多 质粒携带一些能影响宿主细胞类型的基因，例如用来控制抗生素
6
巴斯德

巴斯德，于1822年12月27日生于法国 1854年9月，法国教育部委任他为 里尔工学院院长兼化学系主任，在那里， 他对酒精工业发生了兴趣，而制作酒精 的一道重要工序就是发酵。巴斯德深入 工厂考察，把各种甜菜根汁和发酵中的 液体带回实验室观察。经过多次实验， 他发现，发酵液里有一种比酵母菌小得 多的球状小体，它长大后就是酵母菌。 过了不久，在菌体上长出芽体，芽体长 大后脱落，又成为新的球状小体，在这 循环不断的过程中，甜菜根汁就“发酵” 了。巴斯德继续研究，弄清发酵时所产 生的酒精和二氧化碳气体都是酵母使糖 分解得来的。这个过程即使在没有氧的 条件下也能发生，他认为发酵就是酵母 的无氧呼吸并控制它们的生活条件，这 是酿酒的关键环节。
的形成。
11
二、自然选育

不经人工处理利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程为自然 选育。自发突变的变异率很低。由于微生物可以发生自发突变，所以 菌种在群体培养过程中会产生变异个体。 正变菌株：变异个体中是一种是生长良好，生产水平提高，对 生产有利，这类菌株称为正变菌株。


负变菌株：是生产能力下降，形态出现异性，生产水平那下降， 导致菌种退化，这类菌株称为负变菌株。
16
三、诱变育种(5)


（二）诱变和筛选
诱变育种主要有诱变和筛选两步。 实用意义较大的初筛方法有一下几种：



①自身耐药突变株 ②结构类似物或前体类似物的耐受突变株 ③营养缺陷型及其回复突变株
17
四、原生质体融合



原生质体融合就是把两个亲株分别通过酶解去除细胞壁， 使菌体细胞在高渗环境中释放出由原生质膜包被着的球状体， 在高渗条件下混合两个亲株的原生质体，由PEG作为助融剂使它 们相互凝集发生细胞融合，接着两亲株细胞基因组由接触到交 换，从而实现遗传重组，在再生细胞中就有可能挑选到较理想 的重组子。 1、原生质体融合的一般程序 2、影响融合的因素 ⑴菌龄 ⑵培养基的成分 ⑶PEG⑷外界因素 3原生质体融合育种
巴斯德弄清了发酵的奥秘，从此开 始，巴斯德终于成为一位伟大的微生物 学家，成了微生物学的奠基人。
7
三、发酵工程的研究内容

发酵工程的内容包括菌种的培养和选育、 菌的代谢与调节，培养基灭菌、通气搅拌 、溶 氧、发酵条件的优化、发酵过程各种参数与动 力学、发酵反应器的设计和自动控制、产品的 分离纯化和精致等。 发酵工业的发展水平取决于三个要素：生 产菌种、发酵工艺和发酵设备。
第四章 发酵工程
1
什么是发酵工程
？

请大家看一看利用发酵工程生产的产品的一些实例：
2
3
4
第一节

概述
一、发酵工程 发酵工程（fermentation engineerin）又称微生物 工程，是利用微生物制造工业原料与工业产品并提供服务 的技术。

现代发酵工业已经形成完整的工业体系，包括抗生素、 氨基酸、维生素、有机酸、有机溶剂、多糖、酶制剂、单 细胞蛋白、基因工程药物、核酸类物质及其他生物活性物 质等的生产。
5
二、发酵工程发展的四个阶段




第一阶段，20世纪以前时期，人类利用传统的 微生物发酵过程来生产葡萄酒、酒、醋、酱、奶酪 等食品。 第二阶段，1900-1940年期间，随着微生物培养 技术的不断进步，新的发酵产品不断问世。新的产 品主要有酵母、甘油、乳酸、柠檬酸、丁醇和丙酮 等。 第三阶段，发酵工业大发展时期，青霉素工业 化成功推动了发酵工业的发展。主要标志有：深层 培养、生产大规模化，多种抗生素、氨基酸、核酸 发酵成功，甾体的微生物转化。 第四阶段，基因工程等高技术应有那个阶段。


14
三、诱变育种(3) 1、诱变机制


（2）染色体畸变
染色体畸变是遗传物质的缺失重复或重排而造成的染色体异常突变。 染色体畸变主要包括一条染色体内部所发生的畸变和非同源染色体之间 所发生的畸变，它有下列几种情况： ①易位②到位③缺失④重复



（3）染色体组突变
这类突变主要是指细胞核内染色体数目改变。

8
四、发酵工程的关键技术问题
1、微生物资源库和微生物功能基因组学技术 微生物菌种或酶是工业生物技术的基础。从自然界 中筛选所需要的菌种是目前工业生物技术的主要特点，大 部分成功的高产工业化菌株是从自然界筛选得到的野生型 菌株。 2、生物催化剂快速定向改造新技术 近年来发展起来的定向进化技术，大大加速了人类改 造酶原有功能和开发新功能的步伐。蛋白质定向进化技术 可以使蛋白质（酶）在自然界需要几百万年才能完成的进 化过程缩短到几年甚至几个月。 3、重要工业微生物的代谢工程 通过基因重组技术改变微生物的代谢途径，生产出传 统发酵工业无法获得的新产品。例如美国利用基因工程手 段，将五碳糖产乙醇和六碳糖产乙醇的代谢途径整合到一 个微生物中，能同时发酵利用五碳糖和六碳糖产乙醇。
20


二、种子的制备

种子是发酵工程开始的重要环节。这一过程是使菌种繁殖、
以获得足够数量的菌体，一边接种到发酵罐中。种子发酵可以
在摇瓶中或小罐内进行，大型发酵罐的种子要经过两次扩大培 养才能接入发酵罐。摇瓶培养是在锥形瓶内装入一定量的液体
培养基，灭菌后接入菌种，然后放在回转式或往复式摇床上恒
温培养。种子罐一般用钢或不锈钢制成，结构相当于小型发酵 罐，种子罐接种前有关设备及培养基要经过严格的灭菌。种子
9
第二节 优良菌种的选育

发酵工程产品开发的关键是筛选新的有用物质 的产生菌。从自然界分离得到的野生型菌种不论产量 上或质量上均不适合工业生产要求，因此必须通过人 工育种。优良菌种的选育不仅为发酵工业提供高产菌 株，还可以各种类型的突变菌株。 菌种选育包括自然选育、诱变育种、杂交育种 等经验育种方法，还包括控制杂交育种、原生质体融 合、基因工程等定向育种等方法。
15
三、诱变育种(4)



2、诱变剂及其作用方式 诱变剂：能诱发基因突变并使突变率提高到超过自发突变水 平的物理化学因子都称为诱变剂。 诱变剂的种类很多，可分为物理、化学，生物三大类。 （1）物理诱变剂 主要有紫外线、x射线、γ 射线、快中子、α射线、β射线 和超声波等。其中以紫外线应用最广。 （2）化学诱变剂 在筛选工作中，人们发现从最简单的无机物到最复杂的有机 物中都可找到能引起诱变的物质，包括金属离子、一般化学试剂、 生物碱、抗代谢物、生长激素、抗生素及高分子化合物、杀菌剂、 染料等。
18
第三节

发酵的基本过程
发酵的基本过程为：菌种→种子制备→发酵→发酵液预处理→提取精制
19
一、菌种

发酵水平的高低与菌种的性能质量有直接关系，菌种的生 产能力、生长繁殖的情况和代谢特性是决定发酵水平的内在因 素。 这要求用于生产的菌种产量高、生长快、性能稳定、容易 培养。 目前国内外发酵工业中所采用的菌种绝大多数是经过人工 选育的优良菌种。为了菌种衰退，生产菌种必须以休眠状态保 存在砂土管或冷冻干燥管中，并且置于0～4℃恒温冰箱（库） 内。使用时可临时取出，接种后仍需冷藏。生产菌种一般都安 格规定其使用期，一般砂土管为1～2年。生产菌种应不断纯化， 淘汰变异菌落，防止衰退。
（一）诱变育种的方法和原理



变异和由环境变化而出现的变化有本质上的区别。
微生物诱变育种的目的是要使它向符合人们需要的方向变异。 通常用物理、化学、生物等因素进行对微生物诱变，导致DNA 结构上的变化。
Hale Waihona Puke Baidu
13
三、诱变育种(2)


1、诱变机制
由诱变导致微生物DNA的微细结构发生的变化，主要分为微 小损伤变化、染色体畸变即大损伤突变、染色体组突变三种类 型。 （1）微小损伤突变 微小损伤突变有碱基的置换和码组移动突变两种。碱基的 置换是一种真正的点突变，根据置换方式的不同可分为转换和 颠换两种。 转换：是DNA链上一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一 个嘧啶置换，这是常见的基因突变。 颠换：是指DNA链上一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另 一个嘌呤所置换。