单个核细胞分离
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单个核细胞的分离
实验目的
1．熟悉免疫细胞分离的常用方法。 2．掌握外周血单个核细胞分离方法的原理、 操作规程。
免疫器官 免疫细胞 免疫分子
免疫系统
外周血细胞成分
淋巴细胞 单核细胞 粒细胞 红细胞和血小板
不同细胞密度不同
人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090 血小板：1.030~1.035
密度梯度离心()离心
试剂与器材
• 1.标本 外周静脉血加2抗凝，或1000肝素抗凝 血。
• 2.淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺，比重 (1.077±0.001）有商品供应。
• 3液 • 4.台盼蓝染液 • 5.器材 水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。
操作方法
• 1.取静脉血放入抗凝管，摇匀，先作白细胞计数，然 后取1.5加入等量液，混匀。
细胞分离基本原理
不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同
•人外周血单个核细胞（ ，）包括淋巴细胞和 单核细胞,是免疫学实验中常用的细胞群。
【实验原理】
人外周血单个核细胞的体积、形态和 比重与外周血其他细胞不同。因此利用一 种介于1.075～1.090之间而近于等渗的聚 蔗糖-泛影葡胺（ 比重 1.077±0.001 ） 混合分离液作密度梯度离心，离心后不同 比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。从 而分离出。
实验讨论
• 1. 注意事项①将稀释的血液加分层液上 时，一定要细心，动作要轻，使分离液 与血液的界面清楚，避免冲散分层液面 或与分层液混合影响分离结果。
• ②分离人和不同种类动物外周单个核血细胞要 使用不同比重的分层液，分离人血所用分层液 的比重以1.077±0.001为好；小鼠为1.088,而 马则为1.090。
• 4.用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘 吸取该层单个核细胞，移入管，2000r 5离心 去血浆，
• 加 1混匀，2000离心5，弃上清液。
• 5.末次离心后，吸尽上清后，将细胞悬液体积 用还原至1，取一滴细胞悬液置血细胞计数板 内计数，计算单个核细胞的回收率。
×100%
单个核细胞回收率= 分离后细胞悬液×每毫升单个核细胞 数
分层液
• 聚蔗糖-泛影葡胺:商品名为 ,其密度为 1.077±0.001。
• 主要用于分离外周血中的单个核细胞，是 一种单次差速密度梯度离心的分离法。
• 其主要成分:2份浓度为6℅、密度为1.020 聚 蔗糖(商品名为 )与1份浓度为34℅、密度为 1.200 泛影葡胺水溶液混合。
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
• ③配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗， 有缓冲作用，并对细胞无毒性
方法评价
• 密度梯度离心法是一种分离单个核细胞的常用 方法，
• 用该方法不能除去其中的单核细胞。
临床意义
• 分离所得的单个核细胞可满足许多实验的需要， 可用于细胞的分类鉴定，及各种功能，也可用 于进一步纯化淋巴细胞，分离单个核细胞技术 是进行细胞免疫试验的重要技术之一。
全血数×全血中每毫升单个核细胞
数
单个核细胞数／1毫升细胞悬液)＝
4个大方格内细胞总数
───────── ×10 × 103×2(稀释倍数)
4
6.细胞活力检测
• 取2滴细胞悬液与1滴台盼蓝染液混匀，加盖玻 片，显微镜高倍镜观察。 细胞活力百分率=蓝色细胞数/100个单个细胞 数
结果判断
活细胞不着色，折光强，由于染料可渗入 死亡细胞被染成蓝色，体积略膨大。正 常情况下，活细胞应在95%以上。
• 2.取1.5 分离液置于灭菌离心管内，用毛细吸管将稀释 血液3沿管壁徐徐加入离心管，使稀释血液重叠于淋巴 细胞分离液上（分层液与稀释血液体积比例为1：2）， 二者之间有一明显的界面。
• •Fra Baidu bibliotek
• 3.用水平离心机以2000离心20，离心后管 内容物分为四层，上层为血浆（内含血 小板），中间层为分离液，底层为红细 胞和多形白细胞，在上、中层液体界面 处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层
实验目的
1．熟悉免疫细胞分离的常用方法。 2．掌握外周血单个核细胞分离方法的原理、 操作规程。
免疫器官 免疫细胞 免疫分子
免疫系统
外周血细胞成分
淋巴细胞 单核细胞 粒细胞 红细胞和血小板
不同细胞密度不同
人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090 血小板：1.030~1.035
密度梯度离心()离心
试剂与器材
• 1.标本 外周静脉血加2抗凝，或1000肝素抗凝 血。
• 2.淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺，比重 (1.077±0.001）有商品供应。
• 3液 • 4.台盼蓝染液 • 5.器材 水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。
操作方法
• 1.取静脉血放入抗凝管，摇匀，先作白细胞计数，然 后取1.5加入等量液，混匀。
细胞分离基本原理
不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同
•人外周血单个核细胞（ ，）包括淋巴细胞和 单核细胞,是免疫学实验中常用的细胞群。
【实验原理】
人外周血单个核细胞的体积、形态和 比重与外周血其他细胞不同。因此利用一 种介于1.075～1.090之间而近于等渗的聚 蔗糖-泛影葡胺（ 比重 1.077±0.001 ） 混合分离液作密度梯度离心，离心后不同 比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。从 而分离出。
实验讨论
• 1. 注意事项①将稀释的血液加分层液上 时，一定要细心，动作要轻，使分离液 与血液的界面清楚，避免冲散分层液面 或与分层液混合影响分离结果。
• ②分离人和不同种类动物外周单个核血细胞要 使用不同比重的分层液，分离人血所用分层液 的比重以1.077±0.001为好；小鼠为1.088,而 马则为1.090。
• 4.用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘 吸取该层单个核细胞，移入管，2000r 5离心 去血浆，
• 加 1混匀，2000离心5，弃上清液。
• 5.末次离心后，吸尽上清后，将细胞悬液体积 用还原至1，取一滴细胞悬液置血细胞计数板 内计数，计算单个核细胞的回收率。
×100%
单个核细胞回收率= 分离后细胞悬液×每毫升单个核细胞 数
分层液
• 聚蔗糖-泛影葡胺:商品名为 ,其密度为 1.077±0.001。
• 主要用于分离外周血中的单个核细胞，是 一种单次差速密度梯度离心的分离法。
• 其主要成分:2份浓度为6℅、密度为1.020 聚 蔗糖(商品名为 )与1份浓度为34℅、密度为 1.200 泛影葡胺水溶液混合。
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
• ③配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗， 有缓冲作用，并对细胞无毒性
方法评价
• 密度梯度离心法是一种分离单个核细胞的常用 方法，
• 用该方法不能除去其中的单核细胞。
临床意义
• 分离所得的单个核细胞可满足许多实验的需要， 可用于细胞的分类鉴定，及各种功能，也可用 于进一步纯化淋巴细胞，分离单个核细胞技术 是进行细胞免疫试验的重要技术之一。
全血数×全血中每毫升单个核细胞
数
单个核细胞数／1毫升细胞悬液)＝
4个大方格内细胞总数
───────── ×10 × 103×2(稀释倍数)
4
6.细胞活力检测
• 取2滴细胞悬液与1滴台盼蓝染液混匀，加盖玻 片，显微镜高倍镜观察。 细胞活力百分率=蓝色细胞数/100个单个细胞 数
结果判断
活细胞不着色，折光强，由于染料可渗入 死亡细胞被染成蓝色，体积略膨大。正 常情况下，活细胞应在95%以上。
• 2.取1.5 分离液置于灭菌离心管内，用毛细吸管将稀释 血液3沿管壁徐徐加入离心管，使稀释血液重叠于淋巴 细胞分离液上（分层液与稀释血液体积比例为1：2）， 二者之间有一明显的界面。
• •Fra Baidu bibliotek
• 3.用水平离心机以2000离心20，离心后管 内容物分为四层，上层为血浆（内含血 小板），中间层为分离液，底层为红细 胞和多形白细胞，在上、中层液体界面 处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层