单个核细胞分离
外周血单个核细胞的分离方法
外周血单个核细胞的分离方法哎呀，朋友们，今天咱们聊聊一个特别有意思的话题——外周血单个核细胞的分离方法。
你可能会问，啥玩意儿？简单来说，就是从咱们的血液里找出一种特别的细胞。
想象一下，这就像在一个巨大的水果市场里，找出你最爱的苹果那样。
1. 什么是外周血单个核细胞？1.1 首先，得跟你解释一下这东西。
外周血单个核细胞，顾名思义，就是咱们血液里的一种细胞，单核的，也就是没有太多复杂的结构。
这些细胞可是咱们身体的宝贝儿，它们能做很多重要的工作，比如免疫应答啊、修复组织啊，所以咱们得小心翼翼地对待它们。
1.2 好了，听上去有点复杂，其实操作起来也没那么难。
咱们只需要用一些科学的工具和方法，就能把这些细胞从血液里分离出来。
这个过程不仅能帮助研究人员更好地了解身体的各种反应，还能在医学上发挥大作用呢。
2. 如何进行分离？2.1 让咱们来聊聊具体的操作步骤吧。
首先，得抽取血液。
哎，这步最让人感到心慌，想象一下那根针头，还是尽量别多想了。
不过别担心，这步过了之后，就进入了最有趣的环节——分离。
血液被抽出来之后，就像把你最喜欢的食材从锅里捞出来一样，要把那些外周血单个核细胞找出来。
2.2 这个过程主要用到的工具叫做离心机。
离心机就像一个超级旋转的机器，把血液转得飞快。
在这高速旋转的过程中，血液里的各种成分会被分离开来，就像咱们在清理菜市场时，把苹果和香蕉分开一样。
离心之后，血液中的细胞就会被分成几层，最上面一层就是咱们的目标——外周血单个核细胞。
2.3 之后，拿到这些细胞，就得用到一些特殊的试剂进行进一步处理。
想象一下，你拿到了一大袋苹果，接下来要把它们洗净、切片，这样才行。
细胞也是一样，需要经过处理和清洗，才能保证它们的纯净和活力。
3. 实际应用3.1 分离出来的外周血单个核细胞可是用途广泛。
比如说，它们在医学研究中，能帮助科学家们了解各种疾病的成因，还能用来开发新的治疗方法。
就像你买了一台新玩具，得先拆开看看里面的零件一样，这些细胞就是研究中的“零件”，帮助咱们了解身体的奥秘。
复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：____________ 实验地点：_____________ 实验人：__________________ 1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1）健康小鼠2）手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3）70汇醇4）PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK5）0.2%台盼蓝6）细胞计数板、计数器7）离心机8）显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3 计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml3.4 计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为：324- 16/324 X 100%=95.1%在理论范围之内4 实验结果4.1 研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
分离单个核细胞的方法
分离单个核细胞的方法
分离单个核细胞是一种常用的实验技术，它可以用于细胞学研究、基因编辑等领域。
以下是一种简单的分离单个核细胞的方法：
1. 将含有细胞的培养皿用生理盐水洗涤一遍，去除培养液和杂质。
2. 用无菌吸管吸取一定数量的细胞悬液，将其移至离心管中。
3. 进行离心，速度一般为1000rpm，离心时间约5分钟。
4. 取出上清液，留下细胞沉淀。
5. 加入适量的胰酶，将细胞沉淀消化，使细胞单元分离开来。
6. 加入适量的培养基，用移液器分别将细胞单元吸取，将其分
别移至含有培养基的微型离心管中。
7. 进行离心，速度为1000rpm，离心时间约5分钟。
8. 取出上清液，留下单个核细胞沉淀。
以上就是一种简单的分离单个核细胞的方法，需要注意的是，实验过程中需要保持操作环境无菌，确保实验结果的准确性和可靠性。
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ficoll分离液分离外周血单个核细胞操作原理
ficoll分离液分离外周血单个核细胞操作原理一、前言外周血单个核细胞是指没有细胞核的血细胞，如红细胞、血小板等。
分离外周血单个核细胞是许多实验室和临床诊断中常用的一项操作。
而ficoll分离液则是分离外周血单个核细胞时常用的一种试剂。
本文将详细介绍ficoll分离液的原理及其在分离外周血单个核细胞中的应用。
二、ficoll分离液1. 概述ficoll分离液是由Ficoll（Ficoll-400）和盐水（PBS或Hanks平衡盐溶液）组成的一种密度梯度试剂。
它主要用于体外培养、淋巴细胞和其他白细胞的分离。
2. 原理ficoll分离液利用了不同密度的细胞在密度梯度中沉降速度不同的原理。
在密度梯度中，密度大的物质沉降速度快，而密度小的物质沉降速度慢。
当样品加入到ficoll分离液中时，样品中含有不同密度的各种成分，如红细胞、白细胞、淋巴细胞等。
这些成分会在密度梯度中沉降，最终形成一个由不同密度的层次组成的梯度。
在ficoll分离液中，Ficoll-400的密度大于外周血单个核细胞，但小于红细胞和粒细胞。
当样品经过离心后，外周血单个核细胞会沉降到ficoll分离液中的某一层次中，并被分离出来。
而其他成分则会沉降到不同的层次中。
3. 优点ficoll分离液具有以下优点：（1）样品处理方便：只需要将样品加入到ficoll分离液中进行离心即可。
（2）操作简单：只需要进行一次离心即可将外周血单个核细胞从其他成分中分离出来。
（3）高效：能够快速、高效地将外周血单个核细胞分离出来。
三、操作原理1. 实验材料（1）ficoll分离液；（2）外周血样本；（3）PBS或Hanks平衡盐溶液；（4）15ml或50ml的锥形试管；（5）离心机。
2. 操作步骤（1）将外周血样本加入到15ml或50ml的锥形试管中；（2）加入等体积的PBS或Hanks平衡盐溶液，轻轻混合；（3）将ficoll分离液缓慢加入到试管中，使其与样品充分混合；（4）将试管放入离心机中，以800~1000g的速度离心30分钟；（5）离心后，可以看到样品被分成了不同层次。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
单个核细胞的分离
单个核细胞的分离.txt女人谨记：一定要吃好玩好睡好喝好。
一旦累死了，就别的女人花咱的钱，住咱的房，睡咱的老公，泡咱的男朋友，还打咱的娃。
单个核细胞的分离：（密度离心法）（一）外周血中的单个核细胞的分离：1. 眼眶静脉丛采血：（无菌条件下操作）采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。
当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。
右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。
刺入浓度，小鼠约2～3mm。
当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。
若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。
若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。
左右两眼轮换更好。
体重20-25g的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml。
摘除眼球取血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。
用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。
采血完毕立即用纱布压迫止血。
每次采血量0.6-1mL。
2. 分离PBMC操作步骤：1）用抗凝管（内含抗凝液0.2ml）收集血液，摇匀，加入的Hank’s液或PBS等体积（1:1）稀释血液。
或用肝素溶液：生理盐水将肝素配成125-250U/mL的无菌液，4度保存。
每1mL全血加0.1mL 肝素溶液。
2）取淋巴细胞分层液2ml，放入15ml的离心管。
3）将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰。
（稀释血液与分层液体积比例约为2:1）。
pbmc分离注意事项
PBMC分离注意事项一、摘要PBMC（ Peripheral Blood Mononuclear Cells，外周血单个核细胞）分离是生物医学研究中常见的实验操作之一。
PBMC包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞等，在免疫学、肿瘤学、血液学等领域的研究中具有重要意义。
然而，在进行PBMC分离时，需要注意许多细节和操作要点，以确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将就PBMC分离的实验准备、操作过程和后续处理等方面的注意事项进行详细讨论，旨在提高实验操作效率和实验结果质量。
二、实验准备注意事项在开始PBMC分离之前，需要进行充分的实验准备工作。
以下是一些需要注意的事项：1.血液样本的采集和处理在进行PBMC分离之前，需要采集血液样本。
采血时应注意以下几点：首先，要选择适当的采血时间，如清晨空腹采血可以提高检测结果的稳定性；其次，应选择适当的采血方式，如静脉采血或动脉采血；最后，应使用适当的抗凝剂来处理血液样本，以避免血液凝固。
在采集血液样本后，应尽快将样本送往实验室进行处理。
2.实验器材和试剂的准备在实验前，需要准备好所需的实验器材和试剂。
应选择适当的离心管、吸管、细胞筛等实验器材，并确保这些器材的清洁度和无菌状态。
此外，需要准备适当的分离介质、洗涤液、培养基等试剂，并确保这些试剂的质量和浓度符合实验要求。
三、操作过程注意事项在PBMC分离的操作过程中，应注意以下事项：1.离心速度和时间的选择离心是PBMC分离的重要步骤之一。
在选择离心速度和时间时，应根据实验要求和实际情况进行权衡。
离心速度过高或时间过长可能导致细胞损伤或失活；离心速度过低或时间过短则可能导致分离不充分。
因此，需要根据分离介质的特性和所需细胞类型进行选择和调整。
2.操作过程的无菌化处理在PBMC分离过程中，应保持操作的无菌化处理。
所有实验器材和试剂应保持清洁和无菌状态，以避免污染和交叉感染。
此外，实验操作应在无菌操作台或超净工作台中进行，并穿戴适当的个人防护装备。
复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离和细胞计数
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：实验地点：实验人：1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1)健康小鼠2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3)70%乙醇4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）5)0.2%台盼蓝6)细胞计数板、计数器7)离心机8)显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min，弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml3.4计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为：324-16/324×100%=95.1%在理论范围之内4实验结果4.1研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。
单核细胞的提取方法
单核细胞是从血液中分离出来的，具体步骤如下：
1.采集5-7ml抗凝全血，注入无菌试管。
轻轻混匀后，以3000r/min离心
10分钟。
2.吸取约1.5ml红细胞层至另一无菌试管（避免含有血小板）。
3.将上一步所得的混合物再次以3000r/min离心10分钟。
4.弃去上清液，留下白色沉淀。
其中包含有白细胞、单核细胞和未成熟的多能干
细胞。
5.用无菌吸管或注射器将白色沉淀中的细胞分离出来。
6.将获得的单个核细胞计数并计算出每个样本中的细胞数量。
需要注意的是，单核细胞的提取需要严格遵守无菌操作规程，确保所有步骤都是在无菌环境下进行。
此外，由于单核细胞在体内的含量相对较少，因此需要使用高纯度的方法来获得足够数量的细胞用于实验和分析。
分离外周血单个核细胞的方法
分离外周血单个核细胞的方法分离外周血单个核细胞的方法其实没那么复杂，咱们来聊聊这个话题，保证让你轻松get！首先啊，单个核细胞就是我们血液中那些小家伙，像是白血球、淋巴细胞等等，它们可不是闲人，背后有不少大事儿等着它们去办。
分离这些细胞的目的是为了研究、治疗，或者是干脆为了好玩儿。
就像咱们在厨房里分离蛋清和蛋黄，听起来简单，但得有点儿讲究。
准备工作就要做好。
得有新鲜的外周血，这个非常重要哦，越新鲜效果越好。
你想啊，谁会想要那种放了几天的血液呢，肯定不行。
然后，你还得准备一些试剂，比如说淋巴细胞分离液，这个东西就像是我们的“神奇魔法水”，能帮助我们把想要的细胞和其他的杂质分开来。
想象一下，咱们就像是在捞金子，得把泥土和杂物先清理掉，才能找到闪闪发光的金子。
把外周血放进一个离心管里，像是在给它穿衣服。
这个时候，把管子放进离心机里，按下启动键，等待那些细胞的“表演”。
离心机开始转动，哇，像是舞台上的旋转木马，细胞们在里面“翩翩起舞”。
不同的细胞会根据自己的“重量”被分层，沉到底部的那些就是我们想要的单个核细胞。
别急，这个过程可得耐心等，通常要个十几分钟，时间不算长，但你得盯着，不然它们可就“出轨”了。
一旦时间到了，咱们小心翼翼地把管子拿出来，看到底部沉淀下来的细胞，心里那个激动啊，就像中奖一样！用移液管把上面的液体小心吸走，留下底下那一层细胞。
这个时候要稳，千万别让细胞跟着液体一起跑了，那就尴尬了。
吸完后，再加点洗涤液，把这些细胞洗一洗，赶走那些不速之客。
洗完之后，咱们要再次离心，重复这个过程。
就像是做面包，要不断地揉捏，让面团变得光滑。
经过几轮“洗礼”，最终剩下的就是我们的小明星了，单个核细胞。
你想啊，它们可都是为了健康、免疫力打拼的小战士，怎么能不让人心疼呢！把这些细胞进行计数和保存，当然也可以做进一步的实验。
实验结束后，记得给这些小家伙们找个好去处，不能随便丢掉，它们可是“亲密战友”呢！研究的时候，可以深入探讨它们的功能、特点，甚至在医学上用得上，帮助到更多人。
实验三外周血单个核细胞分离
人血液中各种细胞的密度如下：
红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 血小板：1.030-1.035
F/H= 1.077±0.001
实验步骤
1.用抗凝管抽取外周血2ml； 2.将装有2ml分离液的试管微微倾斜，用吸管
将抽取的抗凝外周血缓缓加入到分离液上 层，保持液面分层清晰； 3.水平离心机中离心，2000rpm，20min； 4.将离心好的试管轻轻拿出，用毛细吸管吸取 PBMC层细胞涂片； 5.将涂片进行瑞氏染色。
实验三 外周血单个核细胞分离
实验目的
掌握外周血单个核细胞分离的原理与操作 掌握外周血单个核细胞的概念
实验原理
人外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cell， PBMC）包括淋巴细胞 和单核细胞。
单个核细胞的体积、形态和比重与外周 血其他细胞不同。因此利用一种介于 1.075-1.090之间的聚蔗糖-泛影葡胺 （ficoll-hypaque）分离液作密度梯度 离心，离心后不同比重的血细胞在分离 液中呈梯度分布,从而分离出PBMC。
密度梯度离心法分离PBMC操作流程
密度梯度离心法分离PBMC操作流程密度梯度离心法（density gradient centrifugation）是一种常用的方法，用于将外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）从全血中分离出来。
该方法通过利用血细胞的不同密度来实现分离，从而获得单个核细胞。
以下是密度梯度离心法分离PBMC的详细操作流程：1.准备所需材料和设备：包括离心管、离心机、无细胞培养基、PBS缓冲液、密度梯度离心液。
2.使用无菌的方法处理全血样本，以防止可能的污染。
3.将含有全血的离心管放置在室温下静置一段时间，使其形成明显的三明治结构，由于样本中的红细胞比其他细胞密度更大，红细胞将沉积在管底部。
4.使用无菌的方法，将全血缓慢倒入预先准备好的无菌离心管中，注意不要把红细胞底层的部分连同上层血浆一同倒入，只取上清层部分。
5.将上清层的全血样本缓慢地转移至一个新的无菌离心管中。
6.向离心管中加入与全血样本体积相等的PBS缓冲液，充分搅拌混匀。
7.将密度梯度离心液缓慢地倒入离心管中，注意避免形成气泡。
8.将离心管放入离心机中，设定合适的离心参数，如离心速度和离心时间。
一般采用400-500g，离心时间为20-30分钟。
离心完成后，你将看到细胞在离心管中形成了几个不同层次。
9.使用无菌的方法，将上清层液体小心地转移至新的离心管中。
在转移过程中，避免吸入其他层次的细胞。
10.将离心管用无菌PBS缓冲液冲洗一次，以去除残余的密度梯度离心液。
11.将PBMC的悬浮细胞沉淀至离心管底部，去除上清液。
12.向沉淀细胞加入足够量的细胞培养基，轻轻搅拌使细胞均匀分散。
13.对PBMC进行细胞计数，以确定细胞数目和浓度。
14.根据实验需求，进行后续的细胞培养、染色、分析等操作。
需要注意的是，在操作过程中，需要注意无菌操作，以避免细胞的污染和损伤。
此外，离心参数和离心时间也需要根据具体实验要求进行调整。
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
单个核细胞分离及流式细胞术检测方法
单个核细胞分离及流式细胞术检测方法
1.取外周血20mL，转移至250mL无菌生理盐水瓶中，加20mL生理盐水混匀，按照体积比3：1加入羟乙基淀粉，即加入13.5mL羟乙基淀粉，充分摇匀后，室温静置15min。
此时加上操作，一共需要耗时25min。
2.吸取上层清亮溶液至50mL无菌离心管，20℃，1800rpm，离心5min，弃上清，最后用10mL生理盐水重悬细胞。
此时加上操作，共耗时25min。
3.吸取提前预热至室温的Ficou人淋巴细胞分离液10mL于50mL离心管中，将细胞悬液沿管壁缓慢加入到分离液中，室温，2000rpm离心25min。
此时加上操作，共耗时35min。
4.小心吸取中间白膜层置于另一无菌15mL离心管，加生理盐水补足体积至
13mL，吹打混匀，室温，1800rpm离心5min，弃上清液，然后再重复该步骤1次。
此时加上操作，共耗时20min。
5.用500微升生理盐水重悬，稀释100倍进行细胞计数，吸取合适数量的细胞进行流式标记（共分为23个流式标记管，至少需1.15×107细胞），每管50微升孵育体积，每种抗体加入1.5微升，全部加完后用中枪混匀，放于4度冰箱孵育30min，并每10min弹匀一次。
此时加上操作，共耗时80min。
6.取出孵育完毕的抗体，用PBS清洗两次（2000rpm离心5min），最后用200微升PBS重悬。
此时加上操作，共耗时40min。
7.将样品拿至流式检测室过筛网，上机检测。
此时加上操作，共耗时45min。
8.关机及出流式报告，30min。
单个核细胞分离试验
1.单个核细胞分离
1.采集静脉血用EDTA-K2抗凝管无菌采集静脉血2ml，立即轻轻摇匀，使血液抗凝。
2.稀释抗凝血用无菌吸管加入2ml等体积的Hanks液或磷酸缓冲盐溶液PBS 充分，使血液等倍稀释，降低红细胞的凝集，提高分离效果。
（此步骤可省去）
3.分离PBMC
（1）取淋巴细胞分离液3ml于灭菌离心管中，然后将离心管倾斜45度，将稀释的血液缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，注意勿使血液混入淋巴细胞分离液中。
（2）平衡后，于离心机中室温2000r/min离心20分钟。
离心后，最上层为血浆层，第二层即为单个核细胞层。
（3）用毛细吸管吸取最上层的血浆、血小板后弃去。
再用另一毛细血管吸取单个核细胞于新的无菌离心管中。
4.洗涤PBMC预估转移的单个核细胞的体积，加入3~5倍体积的磷酸缓冲盐溶液PBS，用吸管轻柔重悬细胞，离心，1500r/min离心10分钟，可去掉大部分混杂的血小板。
之后去掉上清，继续加入3~5倍的平衡盐溶液，用吸管轻柔重悬细胞，离心，1500r/min 离心10分钟，去上清后备用。
分离外周血单个核细胞的常用方法
分离外周血单个核细胞的常用方法
1 单个核细胞分离
单个核细胞是指人类外周血中的唯一细胞，在医疗和科学研究中有着重要的意义，因此，研究者需要以有效而可行的方式从其他细胞中单独分离出单个核细胞。
2 流式细胞术
流式细胞术是一种可用于快速识别和分离特定细胞类型的工具，是比较常见的单个核细胞分离方法。
它需要一种特殊的支架，可用来将原始血液的细胞在特定底物上悬浮，并將核细胞从其他细胞中区分出来，血液细胞由这种支架移动。
支架接受射流时，可引导其中的细胞以不同的方向流动，以便对它们进行特定的筛选分类。
最后，在特定的位置，需要的细胞可以独立收集，以便进行实验分析。
3 反应性空气层析
反应性空气层析是一种新兴的单个核细胞分离方法，使用反应性气体将血液中的细胞推向表面，然后由计算机识别特定的细胞类型，并将符合要求的细胞以单个状态分离出来。
它可以分离出仍保存临床意义的活性细胞，具有更大的整体分类准确度，还可以用来检测感染细胞和其他癌症标记物。
4 磁性粒子分离
磁性粒子分离是另外一种单个核细胞的分类方法。
它是通过一种
叫做磁性粒子的高度猝灭的物质，将其他类型的血细胞从外周血中分
离出来，以留下核细胞。
它可以用于血液细胞中比较罕见的细胞类型，因为它具有较高的敏感度。
总而言之，流式细胞术、反应性空气层析和磁性粒子分离是分离
人类外周血中单个核细胞的常用方法。
上述方法都可以实现较高的分
离精度，为后续进行系统研究奠定基础。
实验1 密度梯度离心法分离血液单个核细胞
实验1 密度梯度离心法分离血液单个核细胞姓名：李思露学号：131140040一、实验原理外周血细胞由密度不同的红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、血小板等组成。
对人血液来讲，其中红细胞密度最大，为 1.09~1.11g/L；粒细胞密度次之，为1.080~1.092g/L；单核细胞、淋巴细胞及NK细胞密度相近，为1.050~1.077g/L；血小板密度最小，只有1.030~1.060g/L；将其中的单核细胞、淋巴细胞、NK细胞等统称为外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）。
当将稀释的抗凝血叠加于适宜密度（与单个核细胞密度相近）的淋巴细胞分离液之上，经适当的离心力离心一段时间后，不同种类细胞因密度而分布于离心管的不同位置，红细胞和粒细胞密度大于分层液，沉积于管底；血小板则因密度小而悬浮在血浆中；其中与分层液密度相当的单个核细胞分布在血浆层和分层液之间的界面。
二、实验材料、试剂及器材1.材料肝素抗凝鸡血：先给注射器中吸入0.1mL 180IU／mL肝素钠溶液，鸡翅下静脉采血5mL。
肝素抗凝绵羊血。
2.试剂（1）肝素钠溶液：用生理盐水配成180IU/mL。
（2）D-Hanks液。
（3）人淋巴细胞分离液：市售。
20℃时密度应为（1.077±0.001）g/L。
3.仪器和用具10mL低速离心机、托盘天平、一次性塑料注射器、10mL离心管、胶头滴管、40mL 小烧杯等。
三、实验操作（1）稀释血液：用D-Hanks液按1：1稀释抗凝血。
（2）加样：先在10 mL离心管中加入2 mL鸡血淋巴细胞分离液，再沿管壁在距分层液界面上1 cm处缓慢加入2 mL稀释血。
应注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分层液内。
（3）离心：2000 r/min离心20 min。
（4）肉眼观察分离效果。
（5）收集PBMC：用胶头吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出PBMC，转入另一离心管。
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• •
• 3.用水平离心机以2000离心20，离心后管 内容物分为四层，上层为血浆（内含血 小板），中间层为分离液，底层为红细 胞和多形白细胞，在上、中层液体界面 处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层
• 4.用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘 吸取该层单个核细胞，移入管，2000r 5离心 去血浆，
• 加 1混匀，2000离心5，弃上清液。
• 5.末次离心后，吸尽上清后，将细胞悬液体积 用还原至1，取一滴细胞悬液置血细胞计数板 内计数，计算单个核细胞的回收率。
×100%
单个核细胞回收率= 分离后细胞悬液×每毫升单个核细胞 数
密度梯度离心()离心
试剂与器材
• 1.标本 外周静脉血加2抗凝，或1000肝素抗凝 血。
• 2.淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺，比重 (1.077±0.001）有商品供应。
• 3液 • 4.台盼蓝染液 • 5.器材 水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。
操作方法
• 1.取静脉血放入抗凝管，摇匀，先作白细胞计数，然 后取1.5加入等量液，混匀。
实验讨论
• 1. 注意事项①将稀释的血液加分层液上 时，一定要细心，动作要轻，使分离液 与血液的界面清楚，避免冲散分层液面 或与分层液混合影响分离结果。
• ②分离人和不同种类动物外周单个核血细胞要 使用不同比重的分层液，分离人血所用分层液 的比重以1.077±0.001为好；小鼠为1.088,而 马则为1.090。
全血数×全血中每毫升单个核细胞
数
单个核细胞数／1毫升细胞悬液)＝4个大 Nhomakorabea格内细胞总数
───────── ×10 × 103×2(稀释倍数)
4
6.细胞活力检测
• 取2滴细胞悬液与1滴台盼蓝染液混匀，加盖玻 片，显微镜高倍镜观察。 细胞活力百分率=蓝色细胞数/100个单个细胞 数
结果判断
活细胞不着色，折光强，由于染料可渗入 死亡细胞被染成蓝色，体积略膨大。正 常情况下，活细胞应在95%以上。
分层液
• 聚蔗糖-泛影葡胺:商品名为 ,其密度为 1.077±0.001。
• 主要用于分离外周血中的单个核细胞，是 一种单次差速密度梯度离心的分离法。
• 其主要成分:2份浓度为6℅、密度为1.020 聚 蔗糖(商品名为 )与1份浓度为34℅、密度为 1.200 泛影葡胺水溶液混合。
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
• ③配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗， 有缓冲作用，并对细胞无毒性
方法评价
• 密度梯度离心法是一种分离单个核细胞的常用 方法，
• 用该方法不能除去其中的单核细胞。
临床意义
• 分离所得的单个核细胞可满足许多实验的需要， 可用于细胞的分类鉴定，及各种功能，也可用 于进一步纯化淋巴细胞，分离单个核细胞技术 是进行细胞免疫试验的重要技术之一。
单个核细胞的分离
实验目的
1．熟悉免疫细胞分离的常用方法。 2．掌握外周血单个核细胞分离方法的原理、 操作规程。
免疫器官 免疫细胞 免疫分子
免疫系统
外周血细胞成分
淋巴细胞 单核细胞 粒细胞 红细胞和血小板
不同细胞密度不同
人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090 血小板：1.030~1.035
细胞分离基本原理
不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同
•人外周血单个核细胞（ ，）包括淋巴细胞和 单核细胞,是免疫学实验中常用的细胞群。
【实验原理】
人外周血单个核细胞的体积、形态和 比重与外周血其他细胞不同。因此利用一 种介于1.075～1.090之间而近于等渗的聚 蔗糖-泛影葡胺（ 比重 1.077±0.001 ） 混合分离液作密度梯度离心，离心后不同 比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。从 而分离出。