基因工程载体(质粒)(三)
合集下载
基因工程-载体
cmlr
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
第四章 基因工程的质粒载体
（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物 使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构 转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合 配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能 够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复， 所以就出现这两种构型之间的平衡状态。
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程是一种用于改变和改造生物体遗传基因的技术，它是利用分子生物学技术提高生物性状的一种新技术。
在基因工程中，需要使用一种材料将外源基因投入细胞中，这种材料就是载体。
基因工程中常用的载体有以下三种：
1. 质粒载体. 质粒载体是一种比较常见的基因工程载体，具有较强的稳定性，它是一种质粒DNA，也称为质粒DNA，不是单链DNA，它是由细菌质粒的DNA结合其它分子，形成质粒DNA的结构，具有可复制性能，可以在细菌或动物细胞中复制，具有较强的稳定性。
2. 杆状病毒载体. 杆状病毒载体是一种比较常见的基因工程载体，它由病毒的全基因组和其它分子形成，用来转移外源基因到细胞中，可以把外源基因转移到细胞核或任何其它的地方，可以实现基因工程的目的。
3. 化合物载体. 化合物载体是一种新型的载体，它是由多种不同的分子组成的，可以将外源基因转移到细胞核或其它位置，并且可以把这些基因在细胞中表达出来，从而实现基因工程的目的。
基因工程基因工程的载体
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白 质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分 子进入细菌细胞。
第三章 基因工程的载体
载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体
•酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr 抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的 水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
基因工程载体
第三章基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种主要类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒（cosmid）载体基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制。
（2）有选择性标记。
（3）有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不影响载体的复制。
（4）分子量小，拷贝数多。
（5）容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA（cccDNA）②开环DNA（open circular,ocDNA）③线形DNA（linear,lDNA）（二）质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
Col质粒：细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
基因工程(基因工程的基本条件-载体系统)
(二)质粒载体(Plasmid)
1. 质粒的一般生物学特征
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而 自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；
质粒常见于原核细菌和真菌中； 绝大多数的质粒是DNA型的； 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分
子结构，即cccDNA； 质粒DNA的分子量范围：1-300 kb。
D-DNA ocDNA cccDNA
但变性的线性染色体DNA分子复性时不准确，也不迅 速，因此彼此聚集形成网状结构,通过离心分离便与变 性的蛋白质及RNA一起沉淀下来，而仍滞留在上清液中 的质粒DNA则可用酒精等沉淀收集。
沸水浴法 用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体； 加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 沸水浴40秒钟； 离心，用无菌牙签挑去沉淀物； 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA；
λ噬菌体生物学特性：溶原状态
➢λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也 可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上， 并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态； ➢整合主要由λ-DNA上的cI和int两基因的产物所激 活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞 本身的性质； ➢人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质， 使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态；
4363 bp
ROI
➢用于基因克隆
ROP Origin of Replication Hind II
Sal I Bal I
pUC18/19：
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII
➢分子量2686bp； GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT
基因工程-3-载体
完整的β-半乳糖苷酶 N端 C端
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
2.pUC系统
蓝白斑筛选
X-gal也是β-半乳糖苷酶的 一种底物，经降解后可生成 溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落 呈蓝色。
3.pGEM-T载体 经 Taq DNA 聚合 酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单 个 A
六、枯草杆菌分泌表达系统
三、质粒的类型
1、抗性质粒（Resistance （R）plasmids） 2、致育因子（Fertility （F）plasmids） 3、Col质粒 4、降解质粒(degradative plasmids)
5、侵入性质粒(virulence plasmids)
四、质粒载体的改造 ①去掉不必要的DNA区域 ②减少限制性内切酶酶切位点 ③加入易于检出的选择性标记 ④关于质粒安全性的改造 ⑤改造或增加基因表达的调控序列
优点：
①非致病的土壤微生物,不像大肠杆菌那样具 有热源性脂多糖; ②遗传学特性先进,很多噬菌体和质粒适合于 用作克隆载体; ③分泌蛋白能力强,当分泌蛋白跨过细胞膜后, 就被加工和直接释放到培养基中,这使得回收 和纯化目的蛋白较为简单; ④良好的发酵基础和生产技术。枯草杆菌在 工业上长期被用于生产蛋白酶、α-淀粉酶等
常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称
氨苄青霉素 （Amp）
作用方式
一种青霉素的衍生物，通过干扰细菌胞 壁合成之末端反应，而杀死生长细胞。
抗性机理
bla抗性基因编码的一种周质酶，即 β-内酰胺酶，可特异的切割amp的 β-内酰胺环，从而失去杀菌效力。
氯霉素（Cm） 一种抑菌剂，通过同核糖体50S亚基的结 cat抗性基因编码乙酰转移酶，特异 合作用，干扰细胞蛋白质的合成，并阻 地使氯霉素乙酰化而失活 止肽键的形成。 卡那霉素 （Kan） 一种杀菌剂，通过同70S核糖体的结合作 kan抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移 用，导致mRNA发生错读。 酶，可对Kan进行修饰，从而阻止同 核糖体之间的相互作用。
基因工程的质粒载体
E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞
病毒载体 穿梭载体
动物细胞
动物细胞 和细菌
结构 环状 线状 环状 环状 环状 环状 线性染色体
线性染色体 环状 环状
插入片断 〈 8*
9 - 24kb
〈 10 kb 35- 45kb ≈300 kb
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
OC L
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒: 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
自主复制基因，转移基因，细 菌染色体区段
（5）分子量要相对较小 （6）在细胞内稳定性要高 （7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件
（四）基因工程中常用的载体
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 E.coli
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的 双链闭合环状DNA分子。
基因工程的载体种类
基因⼯程的载体种类基因⼯程的载体对于外源基因的复制、扩增、传代乃⾄表达⾄关重要，其必需具备以下条件：①具有有效运载能⼒，能够进⼊宿主细胞；②对多种限制酶有单⼀或较少的切点，最好是单⼀切点，即本⾝是⼀个复制⼦，携带外源基因前后均能在宿主细胞内⾃主复制，或者能够整合到宿主细胞中；③在宿主中能控制外源基因的表达活动；④要有筛选标记，鉴定⽅便，装卸⼿续简单；⑤容易控制，安全可靠。
在基因⼯程（DNA重组）中，使⽤的载体有：①克隆载体（clone vector），即以繁殖DNA分⼦为⽬的的载体；②穿梭载体（shuttle vecto），⽤于真核⽣物DNA⽚段在原核⽣物中增殖，然后在转⼊真核⽣物细胞宿主表达；③表达载体（express vector），⽤于⽬的基因的表达。
现在对载体提出了更⾼的要求，如：⾼拷贝数、具有强启动⼦和稳定的mRNA、具有⾼的分离稳定性和结构稳定性、转化频率⾼、宿主范围⼴、插⼊外源基因容量⼤且可以重新完整地复制与转录、和宿主细胞匹配等。
此外，载体在宿主不⽣长或低⽣长速率时仍能⾼⽔平地表达⽬的基因。
但达到上述要求的载体很少，尤其是当动物细胞作为宿主细胞时，⽬前能⽤的主要时病毒，进⼊宿主的⽬的基因⼀般只能是⼀个基因，⽽以基因组或多个基因同时进⾏重组还有⼀定困难。
⼀、质粒克隆载体除酵母杀伤质粒（killer plasmid）为RNA外，其他质粒多位环状DNA分⼦，每个质粒都有⼀段DNA复制起始点的序列，帮助实现质粒的复制。
质粒⼀般决定抗⽣素的抗性、产⽣抗⽣素酶系、糖酵解酶系、降解芳⾹族化合物酶系、肠毒素及限制-修饰酶系等。
其中严紧型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体同步，并与宿主蛋⽩质合成有关，与DNA聚合酶I活性⽆关，蛋⽩质合成停⽌，质粒与宿主染⾊体复制亦停⽌，故只有1个或少数⼏个拷贝；⽽松弛型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体复制不同步，与蛋⽩质合成⽆关，与DNA聚合酶I活性有关，蛋⽩质合成停⽌，质粒仍可复制，故可以在宿主有10—206个拷贝。
第三节 载体
细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒保持完整 的状态； （3）染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的 碱基中，导致链的解旋；形成的EB- DNA复合物 中，EB含量越高，密度会越低。
B：流程
2.碱变性法
A：原理： （1）pH 12.0-12.6：线性DNA变性，质粒DNA为
自然状态； （2）pH中性，高浓度盐：线性DNA交联成不溶网
3、载体的分类
根据来源：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体 根据用途：克隆载体、表达载体 常用的载体： 质粒（plasmid）、单链DNA噬菌体 M13 、噬菌体的衍生物、柯斯质粒（cosmid）、 动物病毒（virus）
常见载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 结构
E.coli
环状
λ 噬菌体
E.coli
（三 ） 质粒DNA的分离与纯化
1、氯化铯密度梯度离心法； 2、碱变性法； 3、沸水浴法
细菌DNA提取的步骤
• 1） 细菌培养物的生长和收集 • 2） 细胞破碎以获得细胞提取物 • 3） 从细胞提取物中纯化DNA • 4） DNA浓缩
1.氯化铯密度梯度离心法
A：原理 （1）质粒占总DNA1%～2%； （2）在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的
醇沉淀收集质粒DNA。
3、沸水浴法
用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体
加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴40秒钟 离心，取上清，加异丙醇，离心 乙醇沉淀质粒DNA
三 、噬菌体载体
（Bacteriophage，简称phage）
状结构，SDS作用下形成沉淀；质粒DNA仍为可 溶状态。离心，上清质粒DNA （3）纯化：乙醇沉淀
B：步骤
（1）菌体培养与提取； （2）裂解细胞：煮沸法、碱性SDS法，非离子型去污
B：流程
2.碱变性法
A：原理： （1）pH 12.0-12.6：线性DNA变性，质粒DNA为
自然状态； （2）pH中性，高浓度盐：线性DNA交联成不溶网
3、载体的分类
根据来源：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体 根据用途：克隆载体、表达载体 常用的载体： 质粒（plasmid）、单链DNA噬菌体 M13 、噬菌体的衍生物、柯斯质粒（cosmid）、 动物病毒（virus）
常见载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 结构
E.coli
环状
λ 噬菌体
E.coli
（三 ） 质粒DNA的分离与纯化
1、氯化铯密度梯度离心法； 2、碱变性法； 3、沸水浴法
细菌DNA提取的步骤
• 1） 细菌培养物的生长和收集 • 2） 细胞破碎以获得细胞提取物 • 3） 从细胞提取物中纯化DNA • 4） DNA浓缩
1.氯化铯密度梯度离心法
A：原理 （1）质粒占总DNA1%～2%； （2）在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的
醇沉淀收集质粒DNA。
3、沸水浴法
用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体
加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴40秒钟 离心，取上清，加异丙醇，离心 乙醇沉淀质粒DNA
三 、噬菌体载体
（Bacteriophage，简称phage）
状结构，SDS作用下形成沉淀；质粒DNA仍为可 溶状态。离心，上清质粒DNA （3）纯化：乙醇沉淀
B：步骤
（1）菌体培养与提取； （2）裂解细胞：煮沸法、碱性SDS法，非离子型去污
三、质粒与载体
第三章 质粒与载体
1. 质粒概述 质粒（plasmid）：
一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传 因子，主要存在于各种微生物细胞中。
1.1 质粒的分子结构
通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；
也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒； 疏螺旋体、链霉菌和酵母菌
1.2 质粒的检测
其特点是依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物， 通过它与目标RNA的互补结合以阻止质粒复制的起始。
目标RNA是质粒DNA复制的引物或是用于编码复
制所需的Rep蛋白的mRNA。
属于这一复制调控类型的质粒包括ColE1、pT181、 p15A、pMB1、RSF1010、loDF13 、R1等ColE1质粒
RNA I antisense
5’ 3’
copB
copA tap
repA
oriV
3’ 5’
RNA II
RepA initiates replication
Tap
Repressor
Shine-Delgarno repA
重复子-竞争结合调控(iteron-binding regulation)
最常见于质粒如：F、P1、R6k 、RK2、RP4和pSC101等，是
• 耐碱性
与染色体DNA相比，质粒有较高的耐碱性，调pH至 12.4 ，可使染色体DNA变性，通过离心将其与质粒 分离
2. 质粒的复制和调节 2.1 质粒的大小
常见质粒大小的范围为1～200kb，个别大质粒可达800～1000 kb 质粒的大小常用分子量MD或碱基对数kb来表示。1MD的双链
DNA≈1.65kb。 未知质粒的大小通常可以在相同条件下与已知其大小的几个 标准质粒比较并依其电泳距离作图来估算。 最精确的测定需要对质粒DNA作序列分析，然后从所含碱基 数目来直接推算出其大小和分子量。
1. 质粒概述 质粒（plasmid）：
一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传 因子，主要存在于各种微生物细胞中。
1.1 质粒的分子结构
通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；
也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒； 疏螺旋体、链霉菌和酵母菌
1.2 质粒的检测
其特点是依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物， 通过它与目标RNA的互补结合以阻止质粒复制的起始。
目标RNA是质粒DNA复制的引物或是用于编码复
制所需的Rep蛋白的mRNA。
属于这一复制调控类型的质粒包括ColE1、pT181、 p15A、pMB1、RSF1010、loDF13 、R1等ColE1质粒
RNA I antisense
5’ 3’
copB
copA tap
repA
oriV
3’ 5’
RNA II
RepA initiates replication
Tap
Repressor
Shine-Delgarno repA
重复子-竞争结合调控(iteron-binding regulation)
最常见于质粒如：F、P1、R6k 、RK2、RP4和pSC101等，是
• 耐碱性
与染色体DNA相比，质粒有较高的耐碱性，调pH至 12.4 ，可使染色体DNA变性，通过离心将其与质粒 分离
2. 质粒的复制和调节 2.1 质粒的大小
常见质粒大小的范围为1～200kb，个别大质粒可达800～1000 kb 质粒的大小常用分子量MD或碱基对数kb来表示。1MD的双链
DNA≈1.65kb。 未知质粒的大小通常可以在相同条件下与已知其大小的几个 标准质粒比较并依其电泳距离作图来估算。 最精确的测定需要对质粒DNA作序列分析，然后从所含碱基 数目来直接推算出其大小和分子量。
基因工程实验三、质粒的制备及目的基因的扩增
是一小段单链DNA 或RNA，作为DNA 复制的起始点，在核酸合成反 应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链 ，引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核 苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量要素：
PCR反应的五要素：
1、引物（primer）
2、酶（Taq DNA polymerase）
3、dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP）
4、模板 （template）
5、Mg2+ （magnesium）
PCR原理
PCR反应的条件：
94℃，5min 94℃，40s 60℃，40s 72℃，1min 72℃，5min 12℃，∞
引物设计的原则
⑤引物 3’端的碱基要求严格配对
特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败
⑥引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列 。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护 碱基）。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研 究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 ⑦避免引物形成发夹结构 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。
gc含量以4060为宜gc太少扩增效果不佳gc过多易出现非特异条带atgc最好随机分布避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补特别是3端的互补否则会形成引物二聚体产生非特异性的扩增条带引物3端的碱基要求严格配对特别是最末及倒数第二个碱基以避免因末端碱基不配对而导致pcr失败引物5端可以有与模板dna不配对碱基在5端引入一段非模板依赖性序列5端加上限制性核酸内切酶位点序列酶切位点5端加上适当数量的保护碱基
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
从不同位点整合到寄主菌染色体上，这种细胞称为Hfr细胞
(高频重组细胞)。
F因子是雄性决定因子，F+ 细胞表面可以形成 一种叫做性须（pilus）的结果，它促使F+ 经 性须进入F- 细胞。F- 细胞则变为F+ 细胞。F因 子可以通过接合作用自我转移，也能够带动寄 主染色体一道转移。但F因子的这种整合过程 是可逆的。在一定条件下，Hfr细胞又可重新 变为F+或F-细胞。 基因工程多选用非接合型质粒，主要安全角度 考虑
常用的是抗生素抗性基因的选择标记。主要有： 四环素（Ter），氨苄青霉素（Amp），氯霉 素（Cm），卡那霉素（Km）。新霉素（Neo） 等。如质粒对氨苄青霉素有抗生时，则写成 AmPr，反之则写成AmPs，。带有抗药性质粒 称为R质粒。一个质粒载体通常有二种抗生素 抗性基因
新的质粒还带有下列标记基因，使于筛选重 组体： ①HA ②Luaferase ③GFP ④便于检测的多肽
非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一 种接合型质粒，那么它们通常也是可以 被转移的。这种由共存的接合型质粒引 发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒 的迁移作用（mobiligation）又叫质粒 的诱动。
带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R 质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。 如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合 型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的 接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁 移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。ColE1 是一种可以
钝化了一个抗性基因，保留了另一个抗性基因。插入失活型载体，就是将 外源DNA片段插入到会导致选择性基因(Ampr，Tetr等)失活的位点。如
PACYC184质粒的EcoRI上插入外源DNA片段，会导致氯霉素抗生基因失活
(Cms)。也有例外，如Villa-Komaroff等1978年发现鼠胰岛素cDNA片段插 入PstI切点，并未使Ampr基因失活。
失去质粒后仍可正常生长繁殖。但质粒可以赋于寄
主某种新的有利的表型。
质粒载体
质粒DNA的一般特点：
① 质粒DNA可在宿主菌中自主复制，又是细菌复制非必须的。 ② 占总的基因组的1～3%。 ③ 所有原核生物都有质粒。 ④ 赋于细菌一种表型，是菌株特性不是菌种特性。
⑤ 隐蔽质粒(Cryptic plasmid)。
2. 质粒的不相容性(incompatibility)
利用同一复制系统不同质粒不能稳定的和平共处的 生存，称为质粒的不相容性，有时又称不亲和性，是指 在没有选择压力情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒， 不能够在同一寄主细胞中稳定地共存现象。在细菌增殖 过程中，其中一种质粒必然会丢失。分子克隆技术正基 于质粒的不相容性质，在只带有一种质粒的细菌中，提 取单一的DNA。
有多用途的辅助序列
如加入不同启动子序列，用于生产单链 DNA或RNA，外源基因的大量表达。又加 入COS位点，使载体能容纳更大的DNA片 段等等。
质粒载体的选择标记： 外源DNA片段与质粒载体DNA连接，再转化入 宿主菌，经培养后需筛选鉴定转化子。这就需 要利用质粒载体的可选择标记。
质粒载体的选择标记
码片段各自基因都不完整，都没有酶活性，当质粒转化入宿主菌后就会 产生具有酶活性的蛋白质，加入生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半 乳糖苷)后会形成蓝色菌落。而插入DNA的重组子则破坏了LacZ的阅读 框，不能使X-gal变蓝，而产生白色菌落。这种LacZ基因上缺失近操纵 基因区段的突变体(宿主菌)与带有完整的近操纵基因片段的β-半乳糖苷 酶阴性的突变体(质粒载体)之间实现互补，这种互补现象称为α互补。
基 因 工 程 载体
南 京 农 业 大 学
陈 溥 言
概
述
基因工程是利用酶学方法将不同来源的
DNA或cDNA，在体外切割、修饰、连接插入 到不同目的的基因工程载体中，进行扩增和表 达，研究基因结构和功能，基因和蛋白质关系 的一种分子生物学技术。
载体
基因工程的十分重要的工具。载体DNA分子 中是有一段生长扩增的非必需区，该区经人工改 造后可插入外源的DNA，并可送入宿主细胞中， 使外源DNA与载体DNA重组并共同扩增。
质 粒 载 体（Plasmid）
一词最早是由Lederberg，1952年提出的。是 双链、闭环DNA复制子（replicon）,存在于细菌的 细胞质中并独立于染色体之外,能自主复制的一类
DNA。 酵母的杀伤质粒（Killer Plasmid）是例外,
它是一种RNA复制子。根据导链霉菌中存在 线状 质粒 。质粒是细菌复制所非必须的，也就是说细菌
丢失四环素抗性标记的正选择体系
原理是具有四环素抗性的细菌对亲脂的螯合剂萎蔫酸
(fusaric acid)极为敏感，因此，将外源性DNA插入到质粒
载体的四环素抗性基因的酶切位点上，在含有萎蔫酸的培
养基上筛选对四环素敏感的重组子，则是十分方便的方法。
环丝氨酸富集法筛Tets重组子
四环素抗菌机理是抑制细菌蛋白质合成，使细菌停 止生长，但菌不死亡。环丝氨酸是氨基酸的类似物，在 细菌的生长过程中，如加入环丝氨酸，则会参入到细菌 新合成的蛋白质多肽链，使细菌死亡。所以在含有四环
抗生素抗性基因选择标记
最常用，主要有：四环素(Tet)、氨苄青霉素(Amp)、氯霉素(Cm)、卡 那霉素(Kan)、新霉素(Neo)等。如质粒对氨苄青霉素有抗生时，则写成 Ampr，反之则写成Amps。带有抗药性质粒称为R质粒。一个质粒载体通
常有二种抗生素抗性基因，这样筛选质粒载体更可靠。外源DNA片段插入
人工质粒要素
1．质粒的基因组小好（不影响生物学功能前题）。转 化入细菌的转化率与质粒大小呈反比，当质粒大于 15kb时，转化率将成为限制因素,质粒大，拷贝数越 低。 。 2．质粒应易于转化。 3．质粒应有较多的拷贝数。 4．选择标记。 5．质粒DNA可插入结合较大的外源DNA
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
3. 质粒的转移性
1）质粒的类型 革兰氏阴性细菌的质粒分为接合型质粒(Conjugative plasmid)，又叫自我转移质粒。它们既具有自我复制遗传
信息，又具有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
接合型质粒多属于严紧型质粒。 非接合型质粒(non-conjugative plasmid)也叫不能自我 转移的质粒。因为它们仅仅带有自主复制的遗传信息。非 接合型质粒多属于松驰型质粒。
霉素或壮观霉素，细菌染色体和严紧型质粒复制停止，而松驰型质粒经
过10~12小时，每个细胞中可多达几百个，甚至几千个质粒。每个细胞中 可达50%以上DNA是质粒DNA。
PUC质粒都属松驰型质粒。 PACYC184等质粒属严紧型质粒。 根据需要使用严紧型还是松驰型质粒,如果 插入外源DNA较大,或其产量过高会产生对 宿主菌新陈代谢有干扰作用时，常选用严 紧型质粒。反之选用松驰型质粒。
pUC 18 和pUC 19质粒图谱
质粒主要包括几个组成部分：
一、复制子（reilcator） 也就是基础复制子（basic replicon）， 具有原质粒同样拷贝数的最小自主复制单 位。一般约2kb，含一个复制起始部位 Orgin（Ori）拷贝数多少和携带有控制复 制的基因信息。
互补原理:
质粒的Lac Z仅编码-半乳糖苷酶的氨基端 宿主菌的Lac Z仅编码-半乳糖苷酶的羧基端 均无活性
环形质粒分子
环形染色体DNA
大肠杆菌细胞 抗菌素抗性基因
质粒DNA
控制质粒DNA转移的基因
质粒主要包括几个组成部分
复制子（reilcator） 复制起始位点(replication origin site) 多克隆位点（Polylink）(MCS) 辅助序列(COS位点等) 选择标记(LacZ,抗性等)
四环素＋环丝氨酸选择
4. 显色法筛选重组子
通常用α互补现象的检查。很多质粒载体DNA都有一段(来自大肠杆 菌DNA)含β半乳糖苷酶基因(LacZ)的调控序列和该酶基因氨基端146个 氨基酸编码信息。并在这个编码区中加入一个多克隆酶切位点，并不破
坏阅读框。而宿主菌有编码半乳糖苷酶C端部分序列，宿主菌和质粒编
多少划分的。严紧型质粒，一般分子量较高；每个寄主细胞中仅含10~60 个拷贝的质粒；松驰型质粒,每个细菌中所含的质粒DNA的拷贝数高,一种质
粒究竟属于严紧型还是松驰型并不是绝对的。往往与寄主状况有关。质粒的复
制不仅受自身的制约，而且还受寄主菌的控制。氯霉素是蛋白质合成的抑制
剂，一般在细菌生长的对数生长期后期(细菌达1×109细胞/mL)，加入氯
这样通过明显的颜色变化，挑选重组子则变得简单易行。往往在这过程
中还要加入IPTG(异丙基硫化-β-D-半乳糖苷)作为酶反应催化剂。
质粒DNA有一段（来自大肠杆菌DNA）含β半乳糖苷 酶基因（Lac Z）的调控序列和该酶基因氨基端146 个氨基酸编码信息。在这个编码区中加入一个多克隆 酶切位点，不破坏阅读框。宿主菌有编码半乳糖苷酶 C端部分序列，宿主菌和质粒编码片段各自基因都不 完整，都没有酶活性，当质粒转化入宿主菌后就会产 生具有酶活性的蛋白质，加入生色底物X—gal后会形 成蓝色菌落。而插入 DNA的重组子则破坏了Lac Z 的阅读框，不能使X—gal变兰，而产生白色菌落。这 种突变体（宿主菌）与质粒载体之间互补现象称为α 互补。入IPTG作为酶反应催化剂。
目前的载体主要有：
1,质粒（Plasmid）载体 2,入噬菌体 3,柯斯质粒（Cosmid） 4,M13噬菌体 5,杂交质粒 6,病毒载体，包括穿梭载体（Shuttle ）。 7,细菌人工染色体.(bacterial artificial chromosome，Shizuya， 1992 BAC) 8,酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，Merry，1983 YAC) 9,来源于P1的细菌人工染色体（P1-derived artificial chromosome PAC, loannon，1994）、 10,哺乳动物人工染色体（MAC，mamal artificial chromosome， Farr，1991） 11,人类人工染色体（HAC，human artificial chromosome， Harrington,1997） 12,植物人工染色体(PAC)