流式细胞术免疫标记简介(完整)学习资料共32页文档
临床免疫学：流式细胞术
流式细胞术的基本工作原理
根据待测细胞的生物学特性或 细胞生化成分，选择特定荧光 染料或与荧光染料耦联的多/单 克隆抗体标记细胞，以激光作 为激发光源，利用显微荧光光 度测定技术、光电技术以及计 算机技术测定流动相中单个细 胞受激后的光信号来分析细胞 的物理、生化、免疫、分子生 物等多种特性，并可根据某些 特征进行细胞亚群分选。
结合后，其荧光强度能够反映细胞表达抗原的情况， 从而对细胞亚群或功能进行分析； ✓荧光素直接标记DNA,可以得到相对的DNA含量，进而 对细胞周期进行分析；
荧光染料的选择
仪器所配置的激光光源的 波长，即荧光素的激发光 谱；
荧光素的发射光谱与检测 器的接收光谱；
染色细胞的抗原表达的相 对密度；
2. 荧光信号： 当激光光束照射在通过检测区的细胞上
时会产生两种荧光信号： 一种是细胞自身在激光照射下发出的微
弱荧光，称为细胞自发荧光； 另一种是标记在细胞上的荧光素，经激
发光照射后产生的荧光信号，称为特异 荧光，
荧光信号的意义
荧光信号可以反映细胞的不同生物学特征 ✓比如荧光素标记的抗体在与细胞上的对应抗原特异性
3、用单阳性管依次调节 相关通道荧光之间的补偿， 如FL1-%FL2， FL2-%FL1
阴性对照：未染色的待分析标本；
同型对照（抗体）：与荧光标记抗体相同 来源、相同标记、相同剂量、相同类、亚 类和型的未免疫的免疫球蛋白，用于消除 由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生 的背景染色。
阳性对照：
数据的显示和分析
医学免疫学实验五 流式细胞术检测免疫细胞表面标记
实验目的
1 了解BD FACS Verse的流式细胞术 2 学习并掌握FCM 的原理 3了解FCM 的运用 4 简单运用FCM检测免疫细胞特性
✓ Introduction FCM Principles FCM Applications
Introduction
BD是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于
BD Introduction FCM Principles ✓ FCM Applications
Flow Cytometry Applications Flow Cytometry Applications
• 细胞结构
• • 细胞大小 • • 细胞颗粒度 量与细 胞周 期
利用优化的缓冲液和抗体借 助 流式细胞仪检测转录因子 表达
用流式细胞仪分选细胞或 检测细胞表面蛋白表达
用 BD Phosflow 抗 体 检测关键蛋白的磷酸化水平
用 ELlSA或 ELISPOT方 法 检 测
分泌的细胞因子
..，.---\1 用 流 式 细 胞 仪 检 测 特 异 细 胞 胞内细胞因子表达
1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。
Maxwell W. Becton
Fairlegh S. Dickinson
经过一百多年的发展，BD已成为世界上最大的医疗技术及医
疗设备公司之一，它以领先的技术、卓越的产品质量和诚实可
信的服务赢得了全球用户及合作伙伴的广泛赞誉。
BD Introduction ✓ FCM Principles
Flow Cytometry Principles
某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比 照射光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧 光的物质称为荧光素
流式细胞术讲义
髓系细胞和单核细胞
7
CD20 FITC/CD22 PE/ CD45 PerCP
B淋巴系细胞及其分化程度
8
CD8 FITC/CD4 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞及其分化程度
9
CD3 FITC/CD16+56 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞、NK细胞
10
CD36 FITC/GP-A PE/ CD45 PerCP
❖ T细胞相关标志：
CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8
常用白血病免疫分型荧光素标记单克隆抗体组合及其意义
管号 1
三色标记McAb
MouseIgG1/ MouseIgG1/CD45 PerCP
染色细胞及目的
阴性对照及设门
2
CD5 FITC/CD7 PE/ CD45 PerCP
T淋巴系细胞、部分早期髓系细胞
样本要求：
➢ 肝素抗凝骨髓3ml(或外周血) ➢ 每天上午送检 ➢ 收费：
➢ 70元/每个单抗(临床常规检测12个单抗)
❖ 干/祖细胞标志：
CD34、CA133
❖ 髓系标志：
CD33、CD13、CD11b、CD15、MPO
❖ B细胞相关标志：
CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD79a、 CyIg、SmIg
3
CD10 FITC/CD19 PE/ CD45 PerCP
B淋巴系细胞
4
Anti-HLA-DA FITC / CD13 PE/ CD45 PerCP 髓系细胞、 B淋巴系细胞、部分T淋
巴系细胞
5
CD34 FITC/CD38 PE/ CD45 PerCP
反映细胞分化程度
流式细胞术简介
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
流式细胞术(FCM)的工作原理及其在免疫学上的应用
流式细胞术（FCM）的工作原理及其在免疫学上的应用摘要：流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种可对单细胞进行快速定性、定量分析的新技术。
它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术，具有极高的检测速度与统计精确性，而且从单一细胞可以同时测得多个参数。
随着其分析技术和方法的日臻完善，流式细胞术在临床免疫及科学研究上发挥了非常重要的作用。
本文对流式细胞术的工作原理进行了概括介绍，并对其在免疫学等方面的应用进行了综述，展示了FCM 在免疫学上应用的广阔前景。
关键词：流式细胞术；流式细胞仪；工作原理；免疫学；应用；应用前景流式细胞术(FCM)是70年代发展起来的一种快速对单细胞或微粒定量分析和分选的新技术。
其检测速度之快，统计学精度之高，是其他的方法无可比拟的，可同时从一个细胞中测得多种参数(如DNA、R N A、蛋白质、细胞体积等)进行多参数分析。
流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的结晶，在血液学、肿瘤学等学科尤其是在免疫学方面得到广泛应用[1]。
近年来，随着流式细胞免疫学技术的迅速发展，流式细胞术与单克隆抗体技术结合，使细胞表面和细胞内抗原，癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得了很大进展。
流式免疫技术克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足，形成了流式免疫学独特的科学分支，成为研究细胞免疫学的先进技术之一。
随着科学技术的发展，多种新的荧光探针的不断出现，使FCM技术的应用范围不断扩大，特别是各种各样的荧光探针标记的单克隆抗体和其他蛋白质的出现，为FCM 研究各种组织细胞膜和细胞内抗原、肿瘤性蛋白等开辟了新途径[2]。
1 .流式细胞术与流式细胞仪1.1流式细胞技术：流式细胞技术是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微球，测量其产生的散射光和发射荧光的强度；经染色的细胞或微球在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞或微球经过焦点时，发出一束散射光/或荧光；它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器光电倍增管或一个固态装置），光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析；并可能将感兴趣的细胞进行分选[3]。
流式细胞术在免疫学中的应用
流式细胞术在免疫学中的应用
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种利用流式细胞仪对细胞或其他生物颗粒进行快速、多参数、定量分析和分选的技术。
在免疫学领域，流式细胞术具有广泛的应用，为免疫学家提供了一种强大的研究工具。
1. 免疫细胞分型和计数：流式细胞术可以通过标记抗体与细胞表面或内部的特定抗原结合，从而对不同类型的免疫细胞进行分类和计数。
这对于监测免疫系统的状态、研究免疫疾病以及评估免疫治疗效果非常重要。
2. 细胞活化和功能分析：流式细胞术可以检测细胞表面标志物的表达水平，从而评估免疫细胞的活化状态和功能。
例如，通过检测 CD69、CD25 等活化标志物的表达，可以研究T 细胞的活化；通过检测细胞因子的表达，可以分析 Th1、Th2、Th17 等不同类型的 T 细胞亚群。
3. 免疫细胞凋亡检测：流式细胞术可以通过 Annexin V/PI 双染色法等技术，检测免疫细胞的凋亡情况。
这对于研究免疫细胞的生存和死亡调节机制、评估药物对免疫细胞的影响以及探讨免疫相关疾病的发病机制具有重要意义。
4. 免疫细胞分选：流式细胞仪可以根据细胞的物理或生物学特性，将目标细胞从混合细胞群体中分离出来。
这一技术在细胞培养、基因转染、单细胞分析等方面具有重要应用。
5. 高通量筛选：流式细胞术可以同时分析大量样本，实现高通量筛选。
这对于药物筛选、抗体发现以及寻找新的免疫治疗靶点等研究具有重要价值。
总之，流式细胞术在免疫学中的应用非常广泛，为深入了解免疫系统的结构和功能、探索免疫相关疾病的发病机制以及开发新型免疫治疗策略提供了重要的技术支持。
流式细胞术
调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析
1．离心收集细胞，PBS洗1～2次。 ► 2．1％多聚甲醛低温下固定15min。 ► 3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱内放置1～3天。 ► 4．PBS轻洗1次 ► 5．细胞与TdT标记液37℃孵育，时间1～2h。 ► 6．PBS轻洗1次。 ► 7．细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。 ► 8．含0.1％ Triton-X 100的PBS轻洗1次。 ► 9．1ml PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重悬。 ► 10． 流式细胞仪分析红色（PI）对绿色荧光（FITC）的地 形图。
Hale Waihona Puke ►PI/Hoechst33342双染法：Hoechst33342（HO）是 一种DNA的特异性荧光染料，可通过完整细胞膜， 应用PI/Hoechst33342可将细胞分为三群：正常活 细胞（HO强/ PI-），凋亡细胞（HO弱/ PI-）， （由于凋亡细胞发生DNA降解和丢失，导致HO荧光 减弱），死亡细胞（HO弱/ PI+）。此种方法再结 合凋亡细胞前向角光散射能力降低的特点，能更好 地鉴定凋亡细胞，但HO须紫外光激发，由于很多流 式细胞仪不配有紫外激光，故此法应用受限。
Phospholipid redistribution
► 应用流式细胞仪采用FITC-
Annexin Ⅴ/PI双 染法进行细胞凋亡检测，可同时描述三群不 同状态细胞：FITC- Annexin Ⅴ-/PI-细胞，即 正常活力细胞；FITC- Annexin Ⅴ+/PI-细胞， 即凋亡细胞；FITC- Annexin Ⅴ+/PI+细胞， 即已死亡细胞。此种方法操作过程简单，指 标敏感，应用者越来越多。
免疫标记技术-精品
其主要优点是： ①人眼对黄绿色较为敏感， ②通常切片标本中的绿色荧光
少于红色。
2、四乙基罗丹明
（rhodamine,RIB200）
橘红色粉末，易溶于酒精。性质稳定， 可长期保存。
最大吸收光波长为570nm，最大发射 光波长为595nm～600nm，呈橘红色 荧光。
3、四甲基异硫氰酸罗丹明 （tetramethylrhodamineisothiocya nate,TRITC）
抗原
标记抗体
荧光 光原
直接法原理示意图 缺点：检查每种抗原均需制备相应标记的抗体
炭疽杆菌24h培养物直接荧光抗体检测
(一)间接法 将抗体(一抗)与标本中的 抗原结合,再用FITC标记的二抗染色。
抗原
抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
2、间接荧光法
将组织或细胞上的抗原直接与相 应抗体（不标记荧光）结合，此为 第一抗体，再把能与第一抗体特异 结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗 体加入，此为荧光标记的第二抗体， 在荧光显微镜下观察荧光。
紫红色结晶粉末，溶于水和酒精。最大 吸引光波长为550nm，最大发射光波长 为620nm，呈橙红色荧光。
与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配 合用于双重标记或对比染色，其异硫氰 基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。
二、荧光免疫标记技术原理和方 法
（一）原 理 荧光免疫技术是用化学方法使荧光素 标记的抗体（或抗原）与组织或细胞 中的相应抗原（或抗体）结合，进行 定性定位检查抗原或抗体的方法。
【材 料】
1、 大白鼠肝组织印片。 2、 病人血清。 3、 荧光标记抗人IgG。 4、 丙酮、PBS、缓冲甘油 (PBS+等量
甘油)。 5、 阳性血清和阴性血清。
流式细胞术课件
抗体使用原则
Ø 根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光 抗体
Ø 低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素， 如PE、APC
Ø 使用双标以上抗体必做荧光补偿
几种常见的荧光染料
细 胞 悬 液
激光
FITC 异硫氰酸荧光素
Texas red 得州红
PE.PC.APC 藻胆蛋白类 PEcy5 能量传递复合染料
原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。 （n----2n）
以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。 首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞 （G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的 细胞又有 G1 期，S 期,G2 期和 M 期。
Flow cytometry of cell cycle
线粒体功能的变化
TMP会在凋亡中产生，可以通过一些标记用流 式细胞仪检测。使用有膜穿透性的亲脂性阳离 子荧光染料，如Rh123, DiOC6, JC-1,CMXRos 等，可作为流式检测的探针。
当细胞发生凋亡时，一个线粒体膜表面蛋白— —7A6抗原会出现
Bcl-2/bax family of proteins.
酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如 DCH, BCECF, BCECF-AM, SNAFLs, SNARFs等进行检测
Flow cytometry of apoptotic cell death
Phospholipid redistribution
第七节 细胞周期的检测
Flow cytometry of cell cycle
光 强
Ø便于数据统计
度
Ø不同的细胞群可
以用不同的色标
记
Ø主要表达方式
绿色荧光强度
医学免疫学实验五 流式细胞术检测免疫细胞表面标记
细胞功能
• 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 • 细胞活性 • 细胞内/外的细胞因子 • 激素结合位点、细胞受体 • 蛋白磷酸化 • pH值 • 钙离子浓度 • 细胞膜电位、线粒体膜电位 • ……
用 BrdU. Annexin V 和其他方法检测 增殖和凋亡
FCM Applications
Flow Cytometry Principles
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种快速、准确、客观
的同时检测直线流动状态中单个细胞多项物理及生物学特性，加以分析定 量的技术。
检测速度快，分析样本量大在极短时间内可分析大量细胞，这
是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速 率进行测量。
Flow Cytometry Applications
流式细胞仪四色分析造血干细胞
Flow Cytometry Applications
胞内磷酸化流式Phosflow
Fix
Permeabilize
Stain
Analyze
Flow Cytometry Applications
BD Phosflow —— 精准
BD Introduction FCM Principles ✓ FCM Applications
Flow Cytometry Applications Flow Cytometry Applications
• 细胞结构
• • 细胞大小 • • 细胞颗粒度 • • 细胞表面积 • • 核浆比例
• • DNA含量与细 胞周 期
c-Myc
Klf4
Oct3/4
Sox2
流式细胞术免疫标记简介(完整)
T细胞标志
T细胞及其亚群 T祖细胞（pro-T）的表型为CD34+、TdT+、CD10+、
CD7+ 未成熟T细胞标志CD3、CD4和CD8。 在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志，
且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。 胸腺细胞要分化发育为有功能的成熟T细胞，细胞
表面标志需经历一定的变化过程。
如与CFSE 进行不同细胞亚群增殖分析。
流式细胞术表面分子免疫标记操作举例
淋巴细胞亚群检测操作程序
一、实验原理：
人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为 三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。T淋 巴细胞表达CD3；B淋巴细胞表达CD19；NK自然杀伤细胞 表达CD56或CD16，并且不表达CD3。利用各种单克隆抗体 与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把 淋巴细胞区分为各种亚型。进面得到各亚群的比例。
（6）浆细胞（plasma cell）：激活B细胞进 一步分化成为产生抗体的浆细胞，这时获得 PC-1、PCA-1和CD138浆细胞特异抗原，CD85表 达增加，CD38抗原再出现。而SIg和上述B抗原 消失。CD79仍可存在于胞质中。
B细胞上的CD抗原分为：
①B细胞限制性（特异性）抗原： CD19、CD20、 CD21、 CD22、CD77 和CD79， 它们的表达只限 于B细胞上，在鉴别细胞系上是十分重要的标志。
（5）活化B细胞（activated B cell）：成熟 B细胞被抗原或丝裂原刺激后，成为活化B细胞， 继之增生和分化。在此过程伴随表达B细胞激 活抗原CD23、CD77、CD80、CD86和其他激活相 关 抗 原 如 CD25 、 CD26 、 CD30 、 CD69 、 CD70 、 CD71、CD38等。膜结合型Ig逐渐减少，分泌型 Ig逐渐增加。
流式细胞术免疫标记简介完整
.
CD19、CD20、CD21、CD22和CD24都是B 细胞白血病和淋巴瘤最常用的标记抗体。
对中国人而言，CD19是特异性和敏感性最 高的。
CD19是一种早期的、谱系特异的泛B细胞 表面抗原，从最早期B细胞前体细胞阶段即 表达，持续存在直至B细胞终末阶段
外周血T细胞、单核细胞、粒细胞和血小板 表面不表达CD19。
.
流式细胞术系列讲座之——免疫标记
流式细胞术免疫标记应用简介
1
.
上次流式细胞术讲座内容（概述）
流式细胞术的一般介绍 流式细胞术在临床检测和科研中的应用
2
.
流式细胞仪可检测的细胞参数
细胞结构 细胞大小 细胞颗粒性程度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周
期 RNA含量
细胞功能 细胞表面蛋白抗原 细胞胞浆内蛋白性
的祖细胞。
8
.
T细胞标志
T细胞及其亚群 T祖细胞（pro-T）的表型为CD34+、TdT+、CD10+、
CD7+ 未成熟T细胞标志CD3、CD4和CD8。 在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志，
且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。 胸腺细胞要分化发育为有功能的成熟T细胞，细胞
27
.
二、主要试剂： MultiTEST IMK Kit(美国BD Biosciences公司；CAT:340503)， 其中包括：1、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 2、CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 3、FACSLysing Solution 三、实验操作： 1、标本采集：使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。 2、染色和固定细胞： • 标本管编号A，取两只流式专用管A1、A2。 • A1管加入CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 20uL； • A2管加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 20Ul。 • A1、A2管中分别再加入全血100Ul，混均。 • 置室温，避光孵育15min。 • 加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。 • 300g离心5min，弃上清液。 • PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。 • 1%多聚甲醛0.5mL。 3、上机检测；分析结果；打印实验报告。
第15章流式细胞术免疫学
第一节 流式细胞术的基本原理
流式细胞仪特点
单细胞悬液 或生物颗粒
快速 多参数
精度高
当代最先进的细 胞定量分析技术
流式细胞仪主要组成部分 Z
Y
1.流动室与液流驱动系统（Z）
2.激发光与光束成形系统（X）
X
3.细胞信号检测与分析处理
系统（Y）
X
X--激发光源
单波长、高强度、高稳定性 多采用氩离子（488nm）激光器或氦氖
(1) 检测信号之一：散射光信号
前向散射光（Forward scatter, FS）信号 • 侧向散射光（Side scatter, SS）信号
FS（小角散射)光它反应细胞的相对大小 和截面积的大小。 SS (90度角散射光)代表细胞的颗粒度和 精细结构的变化。
前向散射光信号 （Forward scatter, FS）
细胞分选系统
细胞分选的原理
细胞分选(cell sorting)：是将特定的细胞 从细胞群体中分离出来。 分选原理
细胞液滴形成（超声震荡压电晶片）； 细胞液滴充电（脉冲发生器）； 细胞液滴在高压静电场中偏转； 细胞收集。
Fluorescence Activated Cell Sorting
compensation）方法
所有补偿调 为“0”
调节电压， 用同型对照或 阴性对照，使 阴性群位于 “左下角”
依单阳群体 调节荧光补偿
流式细胞术分析的质量控制
◆仪器的质量控制 ◆免疫荧光对照
设阳性、阴性对照 ◆双色荧光和多色荧光分析中的荧光补偿 ◆试剂和操作的标准化
第三节 流式细胞术的应用
流式细胞仪检测范围
细胞大小 细胞粒度 细 细胞表面面积 胞 结 核浆比例 构 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量
流式细胞术介绍
细胞系
抗原
分子数（/细胞）
CD2
CD3 T淋巴 细胞 CD4+ T 细胞 CD8+ T 细胞 CD5 CD7 CD45 CD4 CD28 CD8 CD28 CD19 CD20 CD22 HLA-DR 单核细 胞 中性粒 细胞 NK细 胞 CD14 CD64 CD14 CD16 CD56
55,000
124,000 90,000 20,000 >200,000 100,000 20,000 90,000 15,000 18,000 109,000 14,000 85,000 110,000 13,000 3,500 225,000 10,000
第二部分 流式细胞仪样本的制备
样品的保存
没有立即检测的标本，常可用 1、深低温保存法 单细胞悬液装入有盖塑料管，将它放入装 有无水乙醇与干冰混合物的盒子里面，再放入低温冰箱。 2、70%的冷乙醇或者75%的甲醇保存 此方法保持了细胞的完整和生物学活性 3、甲醛或多聚甲醛固定。 该固定以后的细胞不具有生物学活性
实体组织单细胞悬液的制备
1、取新鲜实体组织，用缓冲液（PBS）除血凝块。
2、制备单细胞悬液：剪碎法、研磨法、网搓法、胰酶消化等方法。 用200-300目尼龙网过滤到试管内。 3、低速离心沉淀除细胞碎片，至少3次。
4、作细胞计数并调整细胞浓度为1×106/ml。常温下放置。
5、取9份细胞悬液,加一份台盼蓝溶液混匀后，用记数板在光 镜下分别记数活细胞和死细胞。
国家自然科学基金
精子的分选
精子的分选
第四部分 流式质量控制
第四部分 流式质量控制
样本的质量控制 评价一个样品制备的优劣，可有四个评价指标 ①细胞的密度，不能低于1×106/ml ； ②非特异荧光，不超过1％； ③细胞碎片和聚集体，不能出现肉眼可见的 团块； ④死细胞不超过5%。
流式细胞术简介
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。