流式细胞仪简介和使用方法共85页
流式细胞仪及流式细胞术
流式细胞仪及流式细胞术流式细胞仪技术流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。
它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。
其优点如下：1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
基本流程原理：1、将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定的角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
2、流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90度方向的光电倍增管接收。
散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，被称为细胞的物理参数或固有参数，散射光有包括前向角散射和侧向叫散射，前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信号。
荧光信号也有两种，一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。
流式细胞仪原理及应用 简介
构造模式图
光学系统
流动室及液流驱动系统
激光光源及光束形成系统
1、 Fluidics Subsystem 流动室与液流驱动系统
• 流动室：核心部件，样品在此与激光相交； • 液流层流原理：鞘液（PBS或去离子水），使流动细胞拉开 距离，单个细胞通过； • 要求分辨率高的样品（DNA）应用低速：周期
分选指标：效率、纯度和得率
三、实验中注意事项
1、样品准备 1）原代细胞（骨髓、血液）；2）培养的细胞 单细胞悬液：上机前过膜 2、染色 1）荧光染料的选择：荧光强弱 2）多色搭配：激发光和发射光谱 3）染色条件：抗体浓度、冰上/4度，避光 4）同型对照，阴性对照，单阳管
非常用组合 • PE-texas red/PI PE • PE-Cy5 Percp-Cy5.5/Percp • PE-Cy5 APC
流式细胞术（Flow cytometry，FCM）
以流式细胞仪为主要工具，对处在快速直线流动状态中 的细胞或生物颗粒细胞的各种成分进行多参数、快速的和优势
特点:
单细胞，也能区分群体细胞 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群、单细胞克隆等； 定量的 多参数测量和分析（散射光和荧光，可多达27色） 快速测量和分析（每秒可达1000-10000个细胞） 分选细胞的高纯度（可达99%）；
基本构造
1） Fluidics Subsystem ——保证细胞单个通过检测区 2）Optics Subsystem: excitation components ——使检测细胞发出继发荧光 Optics subsystem: collection components ——规范散射光、继发荧光 3）Electronics subsystem ——将光信号转化为电信号，使检测结果完 美的表达出来 4）Sorting subsystem ——保证细胞的分选功能
流式细胞仪原理及操作步骤
流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。
活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
（一）原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
（二）操作步骤制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1 ∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇↓ 4 ℃30min 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2ml 左右1000rpm×5min↓加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl 固定液）↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7 天）（三）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％FCS RPMI1640, DPBS 、洗涤液、固定液（见附录）。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（四）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10 倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
流式细胞仪的简要介绍与注意事项
流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项)来源：评论：0我要评论[流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项)] 一、流式细胞仪的检测范围1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。
2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。
[关键词:流式细胞仪注意事项]…••一、流式细胞仪的检测范围1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。
2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。
二、流式细胞仪的临床应用1．流式细胞术在肿瘤学中的应用：流式细胞术可以检测肿瘤细胞增殖周期、检测肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物、进行多药耐药性分析、检测凋亡；2．流式细胞术在血液学中的应用：检测白血病和淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞（CD34+）计数、白血病与淋巴瘤的免疫分型、网织红细胞计数、细胞移植的交叉配型和免疫状态监测；3．流式细胞术在免疫学中的应用：可以进行淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、检测细胞因子。
三、流式细胞仪的科研应用主要有细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究。
四、流式细胞术常规检测时的样品制备(一) 直接免疫荧光标记法取一定量细胞（约1×106细胞/ml），直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），孵育20～60分钟后，用PBS（pH7.2 ～7.4）洗1～2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
流式细胞仪使用简介
仪器名称：流式细胞仪生产厂家：美国贝克曼库尔特有限公司使用方法：一．开机程序1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。
2．打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。
打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。
确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。
排出过滤器内的气泡。
4．如果需要打印，打开打印机电源。
5．打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。
7．分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。
待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。
二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files)1．从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2．选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。
从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。
3．选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。
4．将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。
本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。
流式细胞仪简介和使用方法描述85页PPT
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
流式细胞仪简介和使用方法
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技巧四：检测指标
• 检测前要清楚地知道：除阳性百分比指标外，还有荧光强度指标。 后者往往比前者更有意义
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富集白细胞
方法一：溶血法
1. 取100 ul抗凝全血； 2. 快速加入 2ml NH4CL溶血剂,混匀； 3. 室温孵育10分钟； 4. 4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS； 5. 4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS； 6. 4ºC，400g离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。
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注：化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸
为主的溶血剂（Coulter Q-Prep），基于NH4CL的BD 公司的FACSLyse溶血剂。
优点：溶血时间快？？？，在流式细胞仪上可清楚地
将淋巴、单核、粒及红细胞碎片相区分。
缺点：需严格掌握溶血时间，对白细胞表面抗原有影响，
随时间细胞形态变化大。
• 传统手工计数：耗时、准确度差 • 流式细胞仪计数： BD，Coulter仪器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，低速0.5ul/秒？ partec仪器:最为精密的细胞计数器，直接报告细胞浓度
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反应体积
• 样本中加完抗体后， 1×106细胞反应体积应不小于100ul。
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抗体染色
• 最为普通的抗体染色原则：
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其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进
行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。
制备大鼠肾脏浸润细胞
材料： 解剖刀、CO2孵育箱、滤网
以及含1mg/ml胶原酶的细胞培养液（无血清）
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流式细胞仪的使用流程
流式细胞仪的使用流程1. 简介流式细胞仪 (Flow Cytometer) 是一种先进的生物学实验设备，用于检测和分析细胞的形貌、大小、形态、功能和数量等特征。
它可通过流式技术将单个细胞排列成单个的流束，然后通过激光器进行激发和检测，实现对细胞的高通量分析。
本文将介绍使用流式细胞仪的具体使用流程，帮助用户能够正确、高效地操作该设备。
2. 准备工作在正式操作流式细胞仪之前，需要做一些准备工作：2.1 样本准备•从培养皿中取出待分析的细胞，并进行适当的处理，如洗涤、离心等。
•将细胞悬浮液转移至离心管中，并进行适当的离心操作，以获得较为纯净的细胞样本。
2.2 仪器准备•打开流式细胞仪的电源开关，并等待设备启动完成。
•根据实验需要，调整仪器的相关参数，如流速、激发光源、检测通道等。
•准备合适的背景溶液，用于样本的稀释和冲洗。
3. 操作步骤了解了准备工作后，下面将介绍流式细胞仪的具体操作步骤：3.1 样本准备与装载•使用移液器将经过处理的细胞悬浮液取出一定量至样本管中。
•观察样本管中的细胞悬浮液是否均匀分散，如果存在沉淀则轻轻摇晃样本管使之均匀。
3.2 仪器设置•在流式细胞仪的操作界面上设置相应的参数，如流速、激发光源、检测通道等。
•检查仪器的液路系统是否正常工作，如检查液体的流速、流量传感器是否正常等。
3.3 校准仪器•使用已知样本进行仪器的校准。
通常使用亮度微珠进行仪器的调整和刻度。
•在仪器设置界面选择亮度微珠的通道，并进一步设定检测参数以达到最佳校准效果。
3.4 样本测试•将样本管装载至流式细胞仪中的样本架上，确保样本与仪器的光学系统的光路对准。
•启动流式细胞仪，开始测试。
•根据实验需要，选择合适的激发光源和检测通道，进行样本的快速测试。
•在测试过程中，可根据实验需要采集样本的荧光和散射信号，以及其他额外的参数。
3.5 数据分析•测量完成后，通过流式细胞仪软件导出所测细胞的数据文件。
•使用相应的数据分析软件对所测细胞的数据进行分析和解读。
流式细胞仪使用方法说明书
流式细胞仪使用方法说明书1. 概述流式细胞仪是一种用于细胞分析和排序的先进仪器。
本方法说明书旨在向用户介绍如何正确操作流式细胞仪以及最佳的使用方法。
请用户在使用前仔细阅读本说明书并遵循相关的安全操作规程。
2. 仪器组成流式细胞仪主要由以下几个组成部分构成：- 流体传送系统：用于将样本引入仪器并排除废弃物。
- 激光系统：产生激光束以激发样本中的荧光染料。
- 光学系统：收集样本产生的荧光信号并进行检测。
- 数据分析系统：用于解析和分析收集到的数据。
3. 使用准备在进行流式细胞仪实验之前，请确保以下几个步骤已经完成：- 仪器校准：根据仪器的使用手册进行仪器校准，确保仪器工作在最佳状态。
- 样本准备：按照实验需求，对待测样本进行合适的处理，例如细胞培养、染色等。
- 试剂准备：准备好所需的荧光染料、缓冲液等试剂。
4. 仪器操作以下是流式细胞仪的一般操作步骤：- 打开仪器电源，并等待仪器启动完成。
- 将样本装入合适的样本管，并在样本管中加入适量的荧光染料或其他试剂。
- 将样本管放入仪器中的样本槽，并调整流速和其他参数。
- 启动激光系统，并调整激光强度和波长以适应实验需求。
- 开始数据采集，根据仪器界面指示收集所需数据。
- 数据分析：根据实验需要，使用相应的数据分析软件对采集到的数据进行解析和处理。
5. 安全注意事项在使用流式细胞仪时，务必注意以下安全事项：- 佩戴个人防护装备，包括实验手套和护目镜。
- 遵循实验室的生物安全规程，确保样本处理符合相关的安全要求。
- 避免直接暴露于激光束下，以免损伤眼睛和皮肤。
- 在清洁仪器时使用合适的溶剂，并按照仪器清洁的标准程序进行操作。
6. 故障排除在实际操作中，有时可能会遇到仪器故障或其他问题。
以下是一些常见问题及其排除方法：- 仪器无法启动: 检查电源连接是否正常，重启仪器。
- 数据质量差: 检查样本制备和染色的质量，调整参数和仪器校准。
- 清洗困难: 检查是否有阻塞，按照清洁程序进行清洗。
流式细胞仪使用方法
流式细胞仪使用方法
流式细胞仪是一种高效、精准的细胞分析仪器，广泛应用于生物、医学、生态等领域的细胞研究和诊断。
使用流式细胞仪需要以下步骤： 1. 准备样品：将待测细胞或颗粒悬浮在缓冲液中，并且使细胞均匀分散。
2. 调整流速：根据样品大小和含量调整流速。
样品含量高时要降低流速，避免流速过快造成信息遗漏。
3. 线性校准：使用荧光染料或粒子标准品进行线性校准，以保证数据准确性。
4. 过滤样品：使用0.22微米孔径过滤器过滤样品，去除悬浮在样品中的大颗粒。
5. 调节光源：根据样品的荧光信号选择合适的激光波长和强度。
6. 数据分析：通过流式细胞仪软件对数据进行分析和处理，得到所需结果。
需要注意的是，使用流式细胞仪时要注意样品的保存和保护，避免细胞损伤和阳性信号污染。
此外，操作过程中要认真阅读说明书，遵循标准操作程序，确保实验结果的准确性和可靠性。
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医学-流式细胞仪简介和使用方法
富集白细胞
方法一：溶血法
1. 取100 ul抗凝全血； 2. 快速加入 2ml NH4CL溶血剂,混匀； 3. 室温孵育10分钟； 4. 4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS； 5. 4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS； 6. 4ºC，400g离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。
操作
1. 将样本置于皮氏培养皿，加15ml BSA-PBS，将样本切 成1mm3大小，用镊子将其分离； 2. HBSS或PBS洗清 3. 加入10ml无Ca、Mg离子0.2% II型胶原酶溶液0.02% DNase 1的HBSS； 4. 37ºC摇床上孵育15~60分钟，视样本类型而定；
5. 用5ml的吸样管反复吹打，制成单个细胞悬液； 6. 使用35um滤网过滤，300g离心5分钟； 7. 用PBS或细胞培养液重悬样本；对于某些样本过滤后
二、0.1% BSA-PBS缓冲液
1. 准备500ml，PH7.3 PBS 2. 加入5ml 10% BSA 3. 使用0.45um滤网过滤
三、氯化铵溶血剂
1. 在一升蒸馏水中溶解8.29g NH4CL,1g KHCO3和37mg Na2EDTA 2. 调节PH值至7.2 3. 在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤
从组织获取淋巴细胞
淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松
散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤 便可。
方 法：
1. 将样本置于陪替氏培养皿，加入15ml BSA-PBS； 2. 将样本切成3-4mm3大小，用镊子将其分离；
3. 将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。
其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进
流式细胞仪
将其L拖OG至O 空白区。
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流式细胞仪基本操作流程
2、开启CellQuest 软件、编辑实验文件 检查现有仪器条件
从Cytometer菜单中选择Threshold，出现 Threshold 窗口在Threshold 窗口：确认FSC为设阈参数，初步确认 预设阈值52。将其拖至空白区。
从Cytometer菜单中选择Compensation，确认所有预 设数值皆为零。将其拖至空白区。
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流式细胞仪基本操作流程
3、上样品、设置仪器
使仪器处于High RUN，支撑架左移，上阴性对照管样 品，支撑架回位。确认Acquisition Control 窗口中 Setup前需打叉或打勾 (即不储存数据)，点击Acquire。观 察FSC/SSC图的变化
调节 FSC/SSC
流式细胞术的研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、 微生物、及人工合成微球等
流式细胞术研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并
加以定量
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二、流式细胞仪基本原理
流式细胞仪的组成
液流系统
聚焦细胞以供检测
光学系统
激发和收集光信号
电子系统
将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析
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流式细胞仪基本操作流程
4、收集实验数据 计数器Counters
从Acquire 菜单中选择Counters. 窗口会显示样品分析速 率、与总数进度。
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流式细胞仪基本操作流程
4、收集实验数据 收集实验数据
样品放到检测区，在Acquisition Control窗口中，将 Setup
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51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石Байду номын сангаас 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利