体外放射分析
核医学体外放射分析技术课件
二、结合反应动力学规律
• 遵守质量作用定律 • [L]+[B] 适当的实验条件 [LB]
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（competitive binding) • 过量的配体与有限量的结合剂发生竞争性
结合反应。 • 2、非竞争结合（non-competitive binding) • 过量的结合剂与有限量的配体，在非竞争
的条件下发生结合反应。
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（主要应用：放射免疫分析）
• [L]+ [L*]+[B] [LB] +[L*B]
• 2、非竞争结合
•结合在试管 或包被珠上
• Sp.Ab1+Ag Sp.Ab1.Ag
• Sp.Ab1.Ag +Ab2* Sp.Ab1.Ag.Ab2*+Ab2*
优点
• 慢性淋巴细胞性甲状腺炎： • 早期：T3,T4升高，然后降低，
TSH,TGAB,TPOAB升高。 • 甲状腺肿瘤：TG升高。 • 全身性疾病：心血管疾病、肿瘤等： • T3下降，rT3、TSH升高。
（二）肾上腺疾病
• 皮质醇增多症： • ACTH\COR正常情况下有节律分泌，检测
可以与单纯性肥胖区分。 • 原发性醛固酮增多症：尿游离皮质醇
• 反应误差关系 • 精密度图
• 2、准确度：测的值与其标称值之间的 相符程度。
• 3、灵敏度（sensitivity): • 4、特异性(specificity) • 5、稳定性(stability)
（三）质量评价
• 内部质量控制 • 外部质量控制
三、以配体与受体间结合反应 为基础的分析系统
第8章 体外放射分析技术新版
抗体包被分离法
特点：试管包被第二抗体 原理：SP－Ab2－Ab1－*Ag
Ab2
优点：固相包被具有简便、快速、稳定、不需离心等， 有逐渐取代液相法的趋势。
固相吸附分离法
吸附分离剂是固相颗粒，它可以从反应液中吸附游离抗原。活性 炭是常用的吸附剂，多用于小分子游离抗原和抗原－抗体复合物的分 离。具体应用时在活怀炭颗粒的表面涂上一层右旋糖酐或蛋白类化合 物，这样在活性炭的表面形成一定大小的孔洞，在反应液中加入这种 特殊颗粒时，小分子的游离抗原就会被活性炭吸附，从而达到分离B 与F的目的。
逐个代入上式，即可求得各样品的含量 X。 优点：操作简单，用计算器也可拟合。
缺点：①由于Log 0无解，拟合时丢掉0剂量点，降低了灵敏度②
如有突出值，整条拟合线会偏离；③在顺序加样法中不是 直线不可用。
2. 四参数Logistic模型 本法从Logit-Log法演化而来，其函数式如下： Y=（a-d）/「1+（X/C）b」+d 式中Y是标记抗原在各实验点的结合率（包括NSB），X 是各点的剂量。a、b、c、d是四个参数。a代表0剂量时
1、系统误差（systematic error）这种误差常表现为检测结果呈 倾向性的偏高或偏低，是一些可以确定的因素导致的。（1）方法 误差，如标准品稀释体积不正确；抗体过浓或过稀，分离效果不 好；不适当的曲线拟合模型等。（2）仪器和试剂误差，如仪器状
态不佳；量器不准；试剂不纯等。（3）操作误差，如不正确的操
作习惯、错加样品等。系统误差是可以通过努力消除的。 2、随机误差（random error）这种误差是由难以确定且无法控
制的原因（偶然因素）引起，误差的出现是随机的，与真值的偏
核医学技术中级职称考试：2022第十九章 体外放射分析真题模拟及答案(5)
核医学技术中级职称考试：2022第十九章体外放射分析真题模拟及答案(5)1、利用肾动态显像计算GFR，需要获得的数据除外（）。
（单选题）A. 膀胱感兴趣区计数B. 患者身高和体重C. 双肾感兴趣区计数D. 注射前、后注射器计数E. 双肾周围本底计数试题答案：A2、关于放射免疫分析的质量控制，交叉反应率是属于下列哪种类型的质量指标？（）（单选题）A. 特异性B. 精密度C. 灵敏度D. 准确度E. 稳定性试题答案：A3、属于生物分离法是（）。
（单选题）A.B.C.D.E.试题答案：D4、下列哪项是体外放射分析标准品的量的要求？（）（单选题）A. 纯度高，稳定性好B. 待测配体属同类物质C. 与待测配体有同等的亲和能力D. 与待测配体有同等的活性（免疫或生物活性）E. 定量精确试题答案：E5、下列关于放射免疫分析中抗体的说法不正确的是（）。
（单选题）A. 降低抗体的浓度可提高检测灵敏度，检测的范围变宽B. 抗体的量必须保持恒定C. 抗体工作浓度通常以能与50%的标记抗原结合的稀释倍数表示D. 抗体必须有合适的滴度E. 增加抗体浓度会降低检测的灵敏度，适合较高浓度的抗原检测试题答案：A6、肾静态显像不能用于检测（）。
（单选题）A. 肾脏大小B. 肾小球滤过率C. 肾脏位置D. 肾实质内占位性病变E. 肾脏形态试题答案：B7、“弹丸”注射的描述正确的是（）。
（单选题）A. “弹丸”要求大剂量下体积尽可能超过1mlB. “弹丸”要求特定剂量下体积不超过1mlC. “弹丸”不要求特定剂量下体积不超过1mlD. “弹丸”要求特定剂量下体积随意E. “弹丸”要求特定剂量下体积尽可能大试题答案：B8、在体外放射分析中，应用PEG等物质进行化学分离或沉淀分离，该分离法的缺点包括（）。
（单选题）A. 分离时要求条件高B. 分离需要时间长C. 试剂的通用性不强D. 分离的试剂成本高E. 特异性和分离效果较差试题答案：E9、下列关于放射免疫分析中抗体的说法不正确的是（）。
体外放射性分析
定义：在体外条件下、以放射性核素标记的配体为示踪剂、以结合反应为基础、以放射性测量为定量手段、对微量物质进行定量分析的一类分析方法。
按照方法学设计原理分类竞争性结合分析——竞争性结合反应为基础，结合剂和标记物是限量的。
（放射免疫酶促受体）放射免疫分析（最有代表性）、放射受体分析、蛋白质结合竞争分析、放射酶促分析非竞争性结合分析——结合剂的结合位点是过量的，待测配体全量参加反应，灵敏度高。
免疫放射分析、受体放射分析、酶的放射化学测定、酶的激活剂或者抑制剂测定。
※共同基础为分子识别。
放射免疫分析(RIA)——待测抗原和定量标记抗原与有限量的特异性抗体竞争性结合，以放射性测量为定量手段，获得待测抗原浓度的分析。
条件1、待测Ag和标记具有相同免疫活性。
2、待测Ag和标记Ag*总量必须＞Ab量（只有多了才能竞争）3、Ag*量和Ab量保持恒定。
4、Ab必须有合适的滴度（常以能与50%标记抗原结合的稀释倍数表示）5、降低Ab浓度→提高检测灵敏度，但是缩窄检测范围6、增加Ab浓度→降低检测灵敏度，但是适合较高浓度的抗原检测。
公式：（Ag+Ag*）＋Ab——→Ag·Ab + Ag*·Ab + Ag + Ag*免疫放射分析（IRMA）——过量的标记抗体与待测抗原结合，分离标记抗原抗体复合物和未结合标记抗体，通过反射性测量可求得抗原的含量。
Ag+＋*Ab——→Ag·*Ab + *Ab具体方法：单位点法、双位点法（应用最最多的方法）和标记第三抗体法两种方法异同点相同点：1、均已抗原抗体的免疫反应为基础；2、测定的对象都是物质的抗原不同点：见下表受体放射分析——研究受体数目和性质的分析技术，非竞争性结合分析受体放射分析时标记配体的要求：1、与相应的受体有高亲和力，在一定浓度达到最大结合率，转移性好；2、标记配体比活度高（＞10ci/mmol），纯度高、常用的多为3H标记拮抗剂，某些具有酪氨酸残基的多肽也可以125I标记。
体外放射分析
RIA的基本条件
Specific binding reagent
• 特异性结合剂抗体特异性(specificity)：交 叉反应的程度越小越好 • 亲和力(affinity)：配体与结合剂相互结合 的程度，是反映结合剂质量的主要指标。 可用亲和力常数表示。 • 滴度(titer)：在RIA时，结合50%的标记配 体的结合剂稀释度；IRMA分析要求较高 滴度（过量）。
Competive inhibition curve
• Binding rate（％）
• Concentration of antigen(mol/L)
抗体的工作浓度
• Ag*与Ag的免疫化学性质相同； • Ag*与Ag之和大于Ab，Ag*与Ab的量保持恒定。 Binding rate(%) 50%
体外放射分析
内容提要
• Part one: 体外放射分析技术 •Part two: 非放射免疫分析技术 • Part three: 临床应用
历史
• 1960年美国的Berson和Yalow 将核技 术与免疫学技术相结合建立了放射免疫 分析法，并首先用于测定血浆胰岛素浓 度，由于该法对医学的巨大贡献，1977 年Yalow获得了Nobel奖。
Definition
• 在体外条件下 In vitro 以放射性核素标记的配体为示踪剂Tracer 以结合反应为基础 Base 以放射性测量为定量手段 Means 对微量物质进行定量分析Quantitative analysis 一类分析方法的总称。 General name
Main methods
• 半对数坐标系制图法制图方法简便，但 易导致主观误差。 B/F (%) Log X
• 特异性抗体：亲和力大，滴度高，特异性强 • 标记抗原：纯度高；较高的比活度；放化纯度 >95%;保持免疫活性;标记稳定性好,无核素脱落 • 标准品:与被测物属同一种物质,具有相等的活 性,高度纯化;定量要精确(国家标准;药盒标准; 质控标准) • B与F分离技术:完全又快速,非特异性结合低;不 易受外界因素的干扰;价廉,操作简便,重复性好 (双抗法,沉淀法,双抗+PEG法,固相分离法,SPA 法,微孔滤膜法) • 放射性测量仪器: 计数器
体外放射配体结合分析
实
验
AFP放射免疫（快速法）测定
AFP放射免疫（快速法）测定
实验报告
姓名 学号 期、班级 实验名称 实验原理 实验方法（步骤） 实验结果 讨论*
AFP放射免疫（快速法）测定
加样
100 μl 100 125 μI-AFP l 抗体 AFP 缓 冲 液
100μl AFP 10ng/ml
100μl AFP 25ng/ml
单克隆抗体涂被固相载体，形成固相
抗体，通常为试管底部； 试管内加入标准品或待测样品，形成 固相抗原抗体复合物 加入放射性核素标记的单克隆抗体， 形成固相抗体-抗原-*抗体复合物 剩余的标记单克隆抗体则留于液相中， 通过洗管洗去 测量试管中的放射性计数，经标准曲 线就可查出待测物含量
反应式
*Ag+ Ab + Ag *Ag-Ab+ *Ag
限量
Ag-Ab + Ag
Ag: 待测抗原 *Ag: 标记抗原 Ab: 抗体 Ag-Ab: 抗原抗体复合物 *Ag-Ab: 标记抗原抗体复合物
放射免疫分析技术原理示意
标准曲线
基本试剂
标准抗原
标记抗原
即标准品，与 待测物具有相同 的化学结构、免 疫学活性， 是RIA的示综剂， 125I，纯度高，合适的 比活性，标记后抗原 免疫活性不受破坏 特异性高，滴 度高，亲和力大
固相-Ab1+Ag （待测） 固相-Ab1-Ag +*Ab2
固相-Ab1-Ag -*Ab2+*Ab2
基本特点
标记物为抗体，不影响抗原的免疫活性 使用的是单克隆抗体，特异性明显提高 单克隆抗体为大分子物质，碘化标记抗体比
抗原容易，产物比较稳定
检测灵敏度较RIA高，且检测范围扩大 操作更为简便、快速 抗体用量大，成本较高 仅适用于蛋白质类大分子物质的检测
核医学技术中级职称考试：2021第十九章 体外放射分析真题模拟及答案(4)
核医学技术中级职称考试：2021第十九章体外放射分析真题模拟及答案(4)1、下列哪项体外放射分析方法不属于非竞争性分析？（）（单选题）A. 酶的激活剂或抑制剂测定法B. 免疫放射分析C. 酶的放射化学测定D. 受体放射分析E. 蛋白质竞争结合分析试题答案：E2、在肿瘤学的应用范畴内，与PET比较，PET/CT具有的优势是（）。
（单选题）A. 更好地鉴别生理性摄取抑或非生理性摄取B. 提高肿瘤诊断的准确性C. 更精确的病灶空间定位D. 明显缩短检查时间E. 以上均是试题答案：E3、放射免疫分析的质量控制，批间变异系数（CV）应为（）。
（单选题）A. ＜15%B. ＜1%C. ＜2%D. ＜10%E. ＜5%试题答案：A4、用于肾静态显像的放射性药物为（）。
（单选题）A. 99m Tc－（V）－DMSA和99m Tc－葡庚糖酸盐B. 99m Tc－（Ⅲ）－DMSA和99m Tc－DTPAC. 99m Tc－（Ⅲ）－DMSA和99m Tc－葡庚糖酸盐D. 99m Tc－（V）－DMSA和99m Tc－DTPAE. 99m Tc－DIPA和99m Tc－葡庚糖酸盐试题答案：C5、进行肾动态显像常用显像剂不包括（）。
（单选题）A. 99m Tc－EICB. 99m Tc－DTPAC. 131I－OIHD. 99m Tc－DMSAE. 99m Tc－MACn试题答案：D6、肾静态显像不能用于检测（）。
（单选题）A. 肾脏大小B. 肾小球滤过率C. 肾脏位置D. 肾实质内占位性病变E. 肾脏形态试题答案：B7、患者无明显不适，阴囊血池显像可见团块样放射性增浓的是（）。
（单选题）A.B.C.D.E.试题答案：E8、属于生物分离法是（）。
（单选题）A.B.C.D.E.试题答案：D9、下列哪项是体外放射分析标准品的量的要求？（）（单选题）A. 纯度高，稳定性好B. 待测配体属同类物质C. 与待测配体有同等的亲和能力D. 与待测配体有同等的活性（免疫或生物活性）E. 定量精确试题答案：E10、肾动态显像的要点除外（）。
检验核医学放射免疫分析和免疫放射分析
3 标记Ag 常用125I和3H标记化合物 要求： (1)适当高的放射性比活度 影响方法的灵敏度和 精密度，标记Ag化学量≤被测Ag的最小量 (2)放射化学纯度>95% 影响方法的灵敏度 (3)免疫活性与未标记Ag基本保持一致 (4)稳定性好，在一定条件下，稳定期1-3月
标记Ag与Ab的用量对 测定的影响
实验室内部质量控制方法
1对实验数据进行审核剔除“坏点” 2剂量反应曲线拟合及质量审核 3精密度评价 (1)反应误差关系RER
从多批实验资料求出直线方程式 SDR = a + bR
a反映分离误差 b反映加样误差
(2)精密度图(P-P图) (用剂量反应曲线)
通过RER将SDR转换SDD(CVD%) 作SDD (CVD%) - lgD曲线 CVD%≤10%
[Q0]
1
[Q0]
B2 – B (1 + ——— + ——— ) + ——— = 0 (4)
[P0] K [P0]
[P0]
将B = 1 - F代入(3)
[Q0]
1
1
F2 – F (1 - ——— - ——— ) + ——— = 0 (5)
[P0]
K [P0] K [P0]
定义R = B / F，由B + F = 1得B = R / (1+R)代入(3)
偏差分析 2实验室外部质量控制(1)对某种分析方法的试剂
或试剂盒进行综合评价 (2)对不同实验室的分析工作
质量进行比较
质量控制样品 质控的“标准系统”－质控血清(QC) 要求：1 QC样品与待测样品性质相同
2 QC样品与待测样品中待测物相同，免疫活性一致 3 QC样品中待测物量已知，分高、中、低三档浓度 4足量制备，分装，低温存放，分批使用 制备方法：1按三档浓度收集多余病人血清，测定标示值
放射免疫分析
加样： 1、Ag（系列标准品及待测样品）50ul/每管 2、Ag* 200ul/每管 3、Ab 100ul/每管 混匀，37℃ 45分钟，加分离剂离心，测定 结合部分放射性。
放射免疫分析的几种标准曲线图：
抗原抗体的结合反应遵循质量作用定律， 即：
当反应达到平衡时， k1[Ag][Ab]=k2[AgAb]。设KA为平衡结 合常数，也称亲和常数，则有：
Ag + Ab → AgAb + Ag* ↓ Ag*Ab
式中Ag *代表标记抗原，Ag代表非标 记抗原，Ab代表特异性抗体，Ag * Ab代 表标记抗原抗体复合物，AgAb代表非标 记抗原抗体复合物。
当反应体系中同时存在Ag、Ag *和Ab， 而Ag *的量一定、Ab的量限定（分子数少于抗 原）时，随着Ag的增加，Ag * Ab的量相应减 少，即与Ag（包括标准抗原或待测抗原）的 量呈负相关竞争性抑制。当反应达到平衡后， 将反应体系中的标记抗原抗体复合物与游离的 标记抗原分离，测定其放射性。以标准抗原的 浓度为横坐标，以标记抗原抗体复合物的结合 率（B/T、B/F、B/B0）为纵坐标，绘制剂量 效应曲线（calibration curve），也称标准曲 线。
3）亲和力和亲和常数测定：亲和力表 示特定的抗原、抗体之间的结合能力， 常用亲和常数KA来表示。KA越大，表 示抗原、抗体之间结合能力越强，B/F 值大，方法的灵敏度高。 随着单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）技术的发展，提高 了现代体外分析技术的特异性和亲和力。
（二）、放射性标记物 放射性标记物是体外放射分析的测 量依据，常用的标记核素有125I和3H。 对标记物的质量要求包括： （1）比活度（specific activity）：体外 放射分析法的定量范围一般在10-9-1012mol水平，标记物的用量应等于或小于 被测物的最小量，以得到较好的灵敏度。 高比活度的标记物是确保分析方法灵敏 度的前提。
第五章体外分析技术
的疗效判断,评价胰岛素产品质量.
骨钙素解甲状
腺\甲状旁腺功能
肝脏
急性黄疸型肝炎\慢性活动性肝炎\肝硬化
胆酸 放免<300μg/dl 肝癌\胆汁淤积时明显升高,慢性迁延性肝
炎及胆囊炎轻度升高。妊娠胆淤明显升高。
透明质酸 放免 <120μg/l 肝硬化\肝纤维化\慢性肝炎时升高,肝硬
同上
甲状腺球 放免〈30%
甲状腺自身免疫疾病特异指
蛋白抗体
标，桥本氏甲状腺炎
甲状腺微 放免〈20%
甲状腺自身免疫疾病特异指
粒体抗体
标，桥本氏甲状腺炎
TSH 免放 0.4-3.1μIU/ml 鉴别原发与继发甲低,评价下
丘脑-垂体-甲状腺轴功能,垂体瘤,库欣综合征
甲状腺 放免4-14.5μg/ml 诊断甲癌\慢性淋巴细胞性
三、质量控制
Quality Control , QC
（一）定义：质量控制 就是控制误差， 即对分析工作中的误差进行经常性的 检查，遇有质量异常则及时采取对策， 以保证分析误差控制在可接受的范围 内。
放射免疫分析是一类高灵敏度的超微 量分析技术，极易受各种因素的影响 而使检测结果失真，因此必须有严格 的质量控制体系。
CA-153 放免<30U/ml 乳癌诊断特异,乳癌肝及骨转移\卵巢癌\
子宫内膜癌一定程度增高
肾上腺及肾脏
尿免疫球蛋白 放免<8mg/l 早期诊断肾脏受损\受损部位及程度判断
尿白蛋白 放免<10mg/l
同上
尿β2微球蛋白 放免<230mg/l
同上
上午8时: 50~280μg/l 综合征,肾上腺肿瘤、肿瘤、应激
糖类抗原 放免<20mg/l 肿瘤诊断\预后, 放化疗及手术后的疗
第五章 体外分析技术
1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析方法，利用标 记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，故其 灵敏度比放射免疫分析法明显提高，而且标准曲线的测 量范围也明显扩大。
放射免疫分析
RADIOIMMUNOASSAY,RIA
Definition
是以抗原抗体的免疫反应 为基础，利用待测抗原与 定量的标记抗原同有限量 的特异性抗体竞争性结合， 以放射性测量为微量定量 手段，获得待测生物样品 中抗原浓度的技术。
Main methods
Ag + Ab + * Ag AgAb + Ag
*Ag + *AgAb
Main methods
放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原） 与有限量的特异性抗体发生可逆性竞争结合，形成抗原抗 体复合物。 反应体系中同时存在*Ag、Ag和Ab，而*Ag的量一定、Ab的 量固定，而且Ag+*Ag＞＞Ab时，随着Ag的增加，*AgAb的 量相应减少，即与Ag（包括标准抗原或待测抗原）的量呈 负相关。当反应达到平衡后，将反应体系中的标记抗原抗体复合物与游离的标记抗原分离，测定其放射性。以标 准抗原的浓度为横坐标，以标记抗原-抗体复合物的结合 率（B/T、B/F、或F/T）为纵坐标，绘制剂量反应曲线， 也称剂量效应曲线（calibration curve）。
Radiolabeled compounds
标记物
合适的核素标记（半衰期、射线类型、能量 等）,常用核素有125I和3H 标记物的用量要小，应等于或低于待测物的 最小量 足够的比活度 放化纯度高 免疫活性 稳定性好，贮存不易脱标
Specific binding reagent
体外分析技术放射免疫分析
体外分析技术放射免疫分析体外分析技术是指在试管内进行反应从而测定某生物活性物质的超微量分析技术。
该类技术的特点是高灵敏度和高特异性，广泛用于临床和科学研究的很多领域。
应用最多的是：放射免疫分析、免疫放射分析、受体的放射配基结合分析及非放射性免疫分析。
一、原理放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)的基本原理是，限量标记抗原［*Ag］和可变量的非标记待测抗原［Ag］与定量的特异抗体［Ab］发生竞争结合反应，通过测定复合物的放射性来计算出待测非标记抗原的量。
这一过程可用下式表示：*Λg+Λg+Ab< »［ΛgΛb］*+［ΛgΛb］上述式中，Ab的分子数少于*Ag,因此即使系统中没有Ag,仅有*Ag,当反应达到平衡时，绝大部分(因为是可逆反应，不会是100%)Ab将形成*AgAb复合物。
如果系统中加入Ag,则Ag与*Ag竞争结合Ab,形成AgAb,*AgAb将减少。
Ag越多则*AgAb越少。
实践和理论推导都证明，*AgAb和Ag呈二次方程的函数关系，如以Ag为横坐标，*AgAb(B)或*AgAb占加入总*Ag的％(B%)为纵坐标，是一条斜率逐步由大变小的下降曲线。
如以游离的*Ag(F)或游离*Ag占加入总*Ag的％(F%)为纵坐标，则是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
也可以*AgAb∕*Ag的比值(R)为纵坐标，也是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
分析中，首先以不同量的已知标准品Ag和定量*Ag及限量Ab进行竞争结合反应，得到以B或B%、F或F%、或R为纵坐标的剂量效应曲线(也称标准曲线)，然后以未知样品测得的B或B%、F或F%、或R从曲线上查出相应的剂量。
二、试剂盒基本试剂试剂盒由国家批准的生产单位提供，提供R1A的主要试剂、操作方法、保存条件及保存期限。
使用者应按说明书的要求合理使用。
如果临床工作需要，使用者可以对试剂稀释度、操作步.骤等进行适当修改，但应当对改变了的方案进行精密度、准确度、灵敏度等考核，并作详细记录。
体外放射分析(检验)-检验核医学
〔三〕放射性测量 放射性测量是定量的根底
第一节 放射免疫分析 radio innumo assay,RIA
竞争放射分析
放射免疫分析
〔Radio Immuno Assay, RIA〕
竞争性蛋白结合分析
〔Competitive Protein Binding
Assay, CPBA〕
2、简述RIA、IRMA的原理。 3、简述RIA、IRMA的异同点。 4、简述常用的体外放射分析B与F的别离方法
前一致 3、放射化学纯度：>95% 4、稳定性 鉴定： 1、最大结合率
3、抗体
要求：
1、亲和力 2、高滴度
3、特异性 4、可长期保存
抗体
一、多克隆抗血清
抗原 动物选择 佐剂 免疫动物、收获鉴定抗体
抗血清的鉴定
亲和力： 指抗体与抗原的结合能力，常用平衡亲和常数
KA表示。 特异性： 抗体与相应抗原的结合能力与其它类似物结合
难点： 1、RIA的原理
体外放射分析指在体外实验条件下， 以特异结合反响为根底，以放射性 测量为手段，对生物活性物质进行 超微量分析的总称。
特点：灵敏度高、特异性强、精密 度好、按应反应用范围竞Com广争pet性、itive放方rad射法io a分s简sa析y便。
机制分
非竞争性放射分析
Non-Copetitive radio assay
多孔玻 璃微球
磁化颗粒法
〔四〕放射免疫分析方法的建立
1、反 应 方 式
平衡法 顺序加样法 STAT法
2、加样程序
实验设计 配制试剂 加未标记物〔标准品或待测样品〕 加标记物〔*Ag〕 加抗体〔Ab〕 混匀、温育 加别离剂、别离B与F 测量各管放射性计数，绘制标准曲线 由标准曲线反求出样品浓度
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受体容量分析
已知量 配体1 2 3 B%
受体 受体容量(mol)
两者比较
相同点 都是标记配体, 配体与受体的结合反应, 都是标记配体 , 配体与受体的结合反应 , 反映生物活性. 反映生物活性. 不同点 前者测配体含量, 后者测受体容量, 前者测配体含量 , 后者测受体容量 , 前 者为竞争性,后者为饱和分析. 者为竞争性,后者为饱和分析.
双位点法(Ab2为McAb)
具有代表性的固相免疫放射分析法: 固相Ab1(试管壁上)+Ag (固相)Ab1.Ag Ab1.Ag (过量) + 过量Ab*2 Ab*2((McAb) Ab*2 固相Ab1.Ag.Ab*2 Ab1.Ag.Ab*2 Ab1.Ag. +剩余Ab*(洗去) Ab*( Ab*
双位点法(Ab1为McAb) 为 双位点法
Ag.Ab
放射免疫分析
为了定量地测定待测样品中抗原的含量,如在 这个体系中加入放射性核素标记的同类抗原, 体系中同时存在两个平衡.
Ag+Ab Ag+ + Ag*
Ag.Ab Ag. Ag*. Ag*.Ab
分析原理
Ag*与 Ag由于免疫化学性质一致 由于免疫化学性质一致, Ag* 与 Ag 由于免疫化学性质一致 , 共同竞争性 Ab结合 结合, Ag*和Ab的量保持恒定 Ag*与 的量保持恒定, 与Ab结合,当Ag*和Ab的量保持恒定,Ag*与Ag 之和大于Ab时,则Ag*.Ab复合物的形成受Ag含 Ag*.Ab复合物的形成受Ag含 复合物的形成受Ag 之和大于Ab时 Ab 量的制约,二者之间存在函数关系,即随着Ag 量的制约,二者之间存在函数关系,即随着Ag 浓度的增加, Ag*.Ab复合物也减少 因为Ag* 复合物也减少, 浓度的增加 , Ag*.Ab 复合物也减少 , 因为 Ag* 对Ab的结合被Ag竞争性抑制. Ab的结合被Ag竞争性抑制. 的结合被Ag竞争性抑制
K1 Ag + Ab K2
K1=Ag,Ab正向结合为Ag.Ab复合物的速率常数; K1=Ag,Ab正向结合为Ag.Ab复合物的速率常数; 正向结合为Ag.Ab复合物的速率常数 K2=Ag.Ab复合物离解为Ag Ab的速率常数 复合物离解为Ag和 的速率常数; K2=Ag.Ab复合物离解为Ag和Ab的速率常数; K1在早期明显 K2在后期明显 在早期明显, 在后期明显, K1在早期明显,K2在后期明显,一定时间后达 到平衡状态,两者保持相对恒定, K1>K2. 到平衡状态,两者保持相对恒定,但K1>K2. K1与K2之比为亲和力常数 Ka=K1/K2, 之比为亲和力常数, K1与K2之比为亲和力常数,Ka=K1/K2,K越大越 K2与K1之比为平衡离解常数 Kd=K2/K1. 之比为平衡离解常数, 好.K2与K1之比为平衡离解常数,Kd=K2/K1.
因使用固相法,操作更简便,易于 分离(固相材料有多种) 标记抗体比标记抗原容易,可获得高 比度的抗体.
以配体与受体间的结合反 应为基础的分析技术
放射受体分析
放射受体分析 (Radioreceptor assay,RRA) 也是竞争性结合分析法.与放射免疫分 析不同的是以特异性受体蛋白质取代抗 体.利用待测配体及定量的标记配体与 有限量的特异性受体蛋白质竞争性结合, 测得样品中配体的浓度.
半对数坐标系制图法
制图方法简便,但易导致主观误差. B/F (%)
Log X
质量控制
Bo% NSB% ED50,RER,CV, Bo%,NSB%,ED50,RER,CV, 50 精密度图,质控样品等. 精密度图,质控样品等.
�
分离技术
免疫分离法:利用抗原抗体结合形成的复合物 化学分离法:PEG等 物理分离法:电泳,层析,离子交换,活性炭 或树脂吸附等 生物分离法:葡萄球菌A蛋白(SPA) 固相分离法:包被试管,塑料球,磁化分离技 术等.
标准曲线的拟合方式
标准曲线是衡量待测样品中配体浓 度的客观尺度, 度的客观尺度 , 也是反映检测质量 的指标. 的指标 . 标准曲线要最大限度地反 映量, 效关系, 便于自动化分析, 映量 , 效关系 , 便于自动化分析 , 使用灵活. 使用灵活 . 每一批分析必须做一条 标准曲线. 标准曲线.
RIA与IRMA的异同 RIA与IRMA的异同
均为以抗原抗体的免疫反应为基础, 均为以抗原抗体的免疫反应为基础,测 定对象为物质的抗原; 定对象为物质的抗原; RIA
☆为竞争性,标记物为抗原 为竞争性, ☆结合部分放射性与待测抗原浓度呈负 相关, 相关,在直角坐标系呈曲线 为了产生竞争,抗体仅使用结合50% 50%抗 ☆为了产生竞争,抗体仅使用结合50%抗 原的量, 原的量,故灵敏度较免放法低
放射免疫分析( 放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA) 是以抗原抗体的免疫反应为基础,利用 待测抗原与定量的标记抗原同有限量的 特异性抗体竞争性结合,以放射性测量 为微量定量手段,获得待测生物样品中 抗原浓度的技术.
免疫放射分析
免 疫 放 射 分 析 ( Immunoradiometric assay,IRMA)
也是以抗原抗体的免疫反应为基础, 不同的是放射性核素标记的是抗体, 以过量标记抗体直接与待测抗原结 合.为非竞争性结合分析. Ag+Ab*(过量)===Ag.Ab*+ )===Ag Ag+Ab*(过量)===Ag.Ab*+Ab*
(1)单位点法:
Ag+Ab*(过量) Ag.Ab* +Ab*(加抗原吸附剂去除 多余Ab*,上清为结合部 分).
标记品
合适的核素标记(半衰期,射线类型,能量等) 合适的核素标记(半衰期,射线类型,能量等) 标记物的用量要小, 标记物的用量要小,应等于或低于待测物的最 小量 足够的比活度 放化纯度高 免疫活性 稳定性好, 稳定性好,贮存不易脱标
特异性结合剂
抗体,受体, 抗体,受体,酶,蛋白质
特异性(specificity): 特异性(specificity):不受交叉反应的程度 亲和力(affinity): 亲和力(affinity):配体与结合剂相互结合的 程度,是反映结合剂质量的主要指标.可用亲 和力常数表示. 滴度( titer): 滴度 ( titer): 在没有待测物的条件下,结合 50%的标记配体时的结合剂稀释度.
体外放射分析
In vitro radioassay
放射免疫分析 免疫放射分析
竞争性蛋白质结合 分析 放射性酶学分析等
放射受体分析 受体放射分析
Zhang Yongxue
体外放射分析 定义
– – – – – – 是指在体外条件下 是指在体外条件下, 体外条件 以放射性核素标记的配体为示踪剂 以放射性核素标记的配体为示踪剂 以结合反应为基础 以结合反应为基础 以放射性测量为定量手段 以放射性测量为定量手段 对微量物质进行定量分析 定量分析的 对微量物质进行定量分析的 一类分析方法的总称 总称. 一类分析方法的总称.
已知Ag浓度
非竞争性分析
免疫放射分析是典型的非竞争性体外放 射分析.它应用标记抗体作为示踪剂, 在反应系统中加入过量的标记抗体,待 测物(或标准品)进行全量反应,未结 合的标记抗体通过加入免疫吸附剂而去 掉,因此,溶液中放射性与待测物的浓 度呈正相关.Fra bibliotek基本类型
以抗原抗体间的免疫反应为基础的分析技术
常用的方法有
log-logit坐标系及线性回归法: log-logit坐标系及线性回归法: 坐标系及线性回归法 是目前公认比较好的拟合方法, 是目前公认比较好的拟合方法,它是以 结合率的logit值为纵坐标, logit值为纵坐标 结合率的logit值为纵坐标,以标准品浓 度的对数值为横坐标,制成散点图,然 度的对数值为横坐标,制成散点图, 后用最小二乘法对各散点进行直线回归, 后用最小二乘法对各散点进行直线回归, 得出回归方程,获得标准曲线, 得出回归方程,获得标准曲线,可用计 算机或计算器完成. 算机或计算器完成.
主要方法
放射免疫分析,免疫放射分析,放射受体分析, 受体放射分析,蛋白质竞争结合分析等. 其中以放射免疫分析和免疫放射分析应用最为 普遍. 不仅可用于样品中蛋白质,多肽,甾体类激素 等物质的测量,而且可用于具有生物活性的小 分子物质的检测,如血药浓度测定等.
基本原理
竞争性结合分析 放射免疫分析是体外放射分析最有代表性的一 类检测技术.放射免疫分析的基本原理是以抗 原及其特异性抗体在适当的反应体系中能够发 生免疫反应,形成抗原抗体复合物为基础的.
Log-Logist作图法 作图法
logit Y=a+b logit Y=ln(logX/ 1-B/Bo ) a=截距 b斜率为"-"值 Y=结合率 Y与X呈负相关 r需大于0.99 logit y
log X
Logistic模型
log-logit的发展 但克服了log 的发展, log是 log-logit 的发展 , 但克服了loglogit的不足 的不足, logit的不足,也是目前认为较好的 拟合方法. 拟合方法.
因抗体为过量,抗原全量参与反应,反应更为 迅速,灵敏度高 标准曲线工作范围大 由于使用单抗,其特异性好 免疫放射分析仅适用于多肽和蛋白质大分子物 质的测定,要求抗原不少于两个以上的抗原决 定簇(通常一个抗原决定簇至少由5-6个氨基 酸组成,故理论上少于10个以下氨基酸的小分 子物质无法建立免放分析法)
IRMA
为非竞争性,标记的是抗体,且为过量 (高滴度) 结合部分放射性与待测抗原浓度呈正相 关,因抗体为过量,不存在竞争结合, 故结合在固相物上的放射性计数与抗原 浓度呈正比,在直角坐标系近似直线; 但当待测抗原浓度超过一定范围时,则 正比关系消失,出现"平台效应.
浓度过高出现的平台效应
结 合 率 ( ) % 浓度 的 效
反应原理