体外放射分析

常用的方法有
log-logit坐标系及线性回归法: log-logit坐标系及线性回归法: 坐标系及线性回归法 是目前公认比较好的拟合方法, 是目前公认比较好的拟合方法,它是以 结合率的logit值为纵坐标, logit值为纵坐标 结合率的logit值为纵坐标,以标准品浓 度的对数值为横坐标,制成散点图,然 度的对数值为横坐标,制成散点图, 后用最小二乘法对各散点进行直线回归, 后用最小二乘法对各散点进行直线回归, 得出回归方程,获得标准曲线, 得出回归方程,获得标准曲线,可用计 算机或计算器完成. 算机或计算器完成.
以酶与底物间的酶促反 应为基础的分析方法
主要有两类方法
放射酶分析法:以酶为结合剂,测量配 体的含量; 酶的放射化学测定:以放射性标记的底 物为配体,测定酶的活性.
竞争性蛋白质结合分析
基本技术
标准品
质的要求 与待测配体属同类物质 与待测配体有同等的活性和亲和能力 纯度高,不含其它杂质,稳定性好 量的要求 定量精确
Log-Logist作图法 作图法
logit Y=a+b logit Y=ln(logX/ 1-B/Bo ) a=截距 b斜率为"-"值 Y=结合率 Y与X呈负相关 r需大于0.99 logit y
log X
Logistic模型
log-logit的发展 但克服了log 的发展, log是 log-logit 的发展 , 但克服了loglogit的不足 的不足, logit的不足,也是目前认为较好的 拟合方法. 拟合方法.
固相Ab1-McAb(试管壁上)+Ag (过量) 最后抗原被夹在两种抗体 分子之间,测固相上的放 射性(结合部分).此法过 量标记抗体易去除,NSB较 低,灵敏度高;抗原结合 部分需要有两个特定的抗 原决定簇,故特性较高. (固相)Ab.Ag + Ab*2(过量) Ab*2
固相Ab1.Ag.Ab*2 Ab*2 +剩余Ab*(洗去)
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反应原理
Ligand + Receptor + L* L.R L*. L*.R
受体放射分析
受体放射分析( 受体放射分析(receptor radioassay) 是以分析受体的数量和性质 受体的数量和性质为目的 受体的数量和性质 一定量受体只能与一定量的标记配体(受体激 动剂和阻断剂)结合,受体具有一定的饱和度 根据复合物的最大放射性及所用标记配体的比 活度推算出受体的数量,并利用scatchard作 图法求出受体的亲和力常数,以反映受体的性 质等. R===L* L*. L* + R===L*.R + L*
竞争性结合分析条件
Ag*与Ag的免疫化学性质相同; Ag*与Ag的免疫化学性质相同; 的免疫化学性质相同 Ag*与Ag之和大于Ab,Ag*与Ab的量保持恒定 之和大于Ab 的量保持恒定. Ag*与Ag之和大于Ab,Ag*与Ab的量保持恒定
结 合 率 50% 50 的 大结合
标准曲线
如果采用系列已知浓度的标准品在相同条件下 进行分析,测得各标准点的结合率(B/F),以 结合率对标准品量作图,可以得到一条标准曲 线.通过这条标准曲线即可查得未知浓度的待 测样品的含量.
体外放射分析
In vitro radioassay
放射免疫分析 免疫放射分析
竞争性蛋白质结合 分析 放射性酶学分析等
放射受体分析 受体放射分析
Zhang Yongxue
体外放射分析 定义
– – – – – – 是指在体外条件下 是指在体外条件下, 体外条件 以放射性核素标记的配体为示踪剂 以放射性核素标记的配体为示踪剂 以结合反应为基础 以结合反应为基础 以放射性测量为定量手段 以放射性测量为定量手段 对微量物质进行定量分析 定量分析的 对微量物质进行定量分析的 一类分析方法的总称 总称. 一类分析方法的总称.
因抗体为过量,抗原全量参与反应,反应更为 迅速,灵敏度高 标准曲线工作范围大 由于使用单抗,其特异性好 免疫放射分析仅适用于多肽和蛋白质大分子物 质的测定,要求抗原不少于两个以上的抗原决 定簇(通常一个抗原决定簇至少由5-6个氨基 酸组成,故理论上少于10个以下氨基酸的小分 子物质无法建立免放分析法)
K1 Ag + Ab K2
K1=Ag,Ab正向结合为Ag.Ab复合物的速率常数; K1=Ag,Ab正向结合为Ag.Ab复合物的速率常数; 正向结合为Ag.Ab复合物的速率常数 K2=Ag.Ab复合物离解为Ag Ab的速率常数 复合物离解为Ag和 的速率常数; K2=Ag.Ab复合物离解为Ag和Ab的速率常数; K1在早期明显 K2在后期明显 在早期明显, 在后期明显, K1在早期明显,K2在后期明显,一定时间后达 到平衡状态,两者保持相对恒定, K1>K2. 到平衡状态,两者保持相对恒定,但K1>K2. K1与K2之比为亲和力常数 Ka=K1/K2, 之比为亲和力常数, K1与K2之比为亲和力常数,Ka=K1/K2,K越大越 K2与K1之比为平衡离解常数 Kd=K2/K1. 之比为平衡离解常数, 好.K2与K1之比为平衡离解常数,Kd=K2/K1.
IRMA
为非竞争性,标记的是抗体,且为过量 (高滴度) 结合部分放射性与待测抗原浓度呈正相 关,因抗体为过量,不存在竞争结合, 故结合在固相物上的放射性计数与抗原 浓度呈正比,在直角坐标系近似直线; 但当待测抗原浓度超过一定范围时,则 正比关系消失,出现"平台效应.
浓度过高出现的平台效应
结 合 率 ( ) % 浓度 的 效
也是以抗原抗体的免疫反应为基础, 不同的是放射性核素标记的是抗体, 以过量标记抗体直接与待测抗原结 合.为非竞争性结合分析. Ag+Ab*(过量)===Ag.Ab*+ )===Ag Ag+Ab*(过量)===Ag.Ab*+Ab*
(1)单位点法:
Ag+Ab*(过量) Ag.Ab* +Ab*(加抗原吸附剂去除 多余Ab*,上清为结合部 分).
主要方法
放射免疫分析,免疫放射分析,放射受体分析, 受体放射分析,蛋白质竞争结合分析等. 其中以放射免疫分析和免疫放射分析应用最为 普遍. 不仅可用于样品中蛋白质,多肽,甾体类激素 等物质的测量,而且可用于具有生物活性的小 分子物质的检测,如血药浓度测定等.
基本原理
竞争性结合分析 放射免疫分析是体外放射分析最有代表性的一 类检测技术.放射免疫分析的基本原理是以抗 原及其特异性抗体在适当的反应体系中能够发 生免疫反应,形成抗原抗体复合物为基础的.
放射免疫分析( 放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA) 是以抗原抗体的免疫反应为基础,利用 待测抗原与定量的标记抗原同有限量的 特异性抗体竞争性结合,以放射性测量 为微量定量手段,获得待测生物样品中 抗原浓度的技术.
免疫放射分析
免 疫 放 射 分 析 ( Immunoradiometric assay,IRMA)
已知Ag浓度
非竞争性分析
免疫放射分析是典型的非竞争性体外放 射分析.它应用标记抗体作为示踪剂, 在反应系统中加入过量的标记抗体,待 测物(或标准品)进行全量反应,未结 合的标记抗体通过加入免疫吸附剂而去 掉,因此,溶液中放射性与待测物的浓 度呈正相关.
基本类型
以抗原抗体间的免疫反应为基础的分析技术
分离技术
免疫分离法:利用抗原抗体结合形成的复合物 化学分离法:PEG等 物理分离法:电泳,层析,离子交换,活性炭 或树脂吸附等 生物分离法:葡萄球菌A蛋白(SPA) 固相分离法:包被试管,塑料球,磁化分离技 术等.
标准曲线的拟合方式
标准曲线是衡量待测样品中配体浓 度的客观尺度, 度的客观尺度 , 也是反映检测质量 的指标. 的指标 . 标准曲线要最大限度地反 映量, 效关系, 便于自动化分析, 映量 , 效关系 , 便于自动化分析 , 使用灵活. 使用灵活 . 每一批分析必须做一条 标准曲线. 标准曲线.
Ag.Ab
放射免疫分析
为了定量地测定待测样品中抗原的含量,如在 这个体系中加入放射性核素标记的同类抗原, 体系中同时存在两个平衡.
Ag+Ab Ag+ + Ag*
Ag.Ab Ag. Ag*. Ag*.Ab
分析原理
Ag*与 Ag由于免疫化学性质一致 由于免疫化学性质一致, Ag* 与 Ag 由于免疫化学性质一致 , 共同竞争性 Ab结合 结合, Ag*和Ab的量保持恒定 Ag*与 的量保持恒定, 与Ab结合,当Ag*和Ab的量保持恒定,Ag*与Ag 之和大于Ab时,则Ag*.Ab复合物的形成受Ag含 Ag*.Ab复合物的形成受Ag含 复合物的形成受Ag 之和大于Ab时 Ab 量的制约,二者之间存在函数关系,即随着Ag 量的制约,二者之间存在函数关系,即随着Ag 浓度的增加, Ag*.Ab复合物也减少 因为Ag* 复合物也减少, 浓度的增加 , Ag*.Ab 复合物也减少 , 因为 Ag* 对Ab的结合被Ag竞争性抑制. Ab的结合被Ag竞争性抑制. 的结合被Ag竞争性抑制
半对数坐标系制图法
制图方法简便,但易导致主观误差. B/F (%)
Log X
质量控制
Bo% NSB% ED50,RER,CV, Bo%,NSB%,ED50,RER,CV, 50 精密度图,质控样品等. 精密度图,质控样品等.
�
双位点法(Ab2为McAb)
具有代表性的固相免疫放射分析法: 固相Ab1(试管壁上)+Ag (固相)Ab1.Ag Ab1.Ag (过量) + 过量Ab*2 Ab*2((McAb) Ab*2 固相Ab1.Ag.Ab*2 Ab1.Ag.Ab*2 Ab1.Ag. +剩余Ab*(洗去) Ab*( Ab*
双位点法(Ab1为McAb) 为 双位点法
标记第三抗体法
与双位点法相似, 与双位点法相似,只是两种抗体均 不标记,而是反应结束后, 不标记,而是反应结束后,加入非 第三抗体(兔抗鼠IgG) IgG), 特异的125I-第三抗体(兔抗鼠IgG), 与抗原-抗体复合物结合, 与抗原-抗体复合物结合,达到测 量结合部分的目的. 量结合部分的目的.
标记品
合适的核素标记(半衰期,射线类型,能量等) 合适的核素标记(半衰期,射线类型,能量等) 标记物的用量要小, 标记物的用量要小,应等于或低于待测物的最 小量 足够的比活度 放化纯度高 免疫活性 稳定性好, 稳定性好,贮存不易脱标
特异性结合剂
抗体,受体, 抗体,受体,酶,蛋白质
特异性(specificity): 特异性(specificity):不受交叉反应的程度 亲和力(affinity): 亲和力(affinity):配体与结合剂相互结合的 程度,是反映结合剂质量的主要指标.可用亲 和力常数表示. 滴度( titer): 滴度 ( titer): 在没有待测物的条件下,结合 50%的标记配体时的结合剂稀释度.
因使用固相法,操作更简便,易于 分离(固相材料有多种) 标记抗体比标记抗原容易,可获得高 比度的抗体.
以配体与受体间的结合反 应为基础的分析技术
放射受体分析
放射受体分析 (Radioreceptor assay,RRA) 也是竞争性结合分析法.与放射免疫分 析不同的是以特异性受体蛋白质取代抗 体.利用待测配体及定量的标记配体与 有限量的特异性受体蛋白质竞争性结合, 测得样品中配体的浓度.
RIA与IRMA的异同 RIA与IRMA的异同
均为以抗原抗体的免疫反应为基础, 均为以抗原抗体的免疫反应为基础,测 定对象为物质的抗原; 定对象为物质的抗原; RIA
☆为竞争性,标记物为抗原 为竞争性, ☆结合部分放射性与待测抗原浓度呈负 相关, 相关,在直角坐标系呈曲线 为了产生竞争,抗体仅使用结合50% 50%抗 ☆为了产生竞争,抗体仅使用结合50%抗 原的量, 原的量,故灵敏度较免放法低
受体容量分析
已知量 配体1 2 3 B%
受体 受体容量(mol)
两者比较
相同点 都是标记配体, 配体与受体的结合反应, 都是标记配体 , 配体与受体的结合反应 , 反映生物活性. 反映生物活性. 不同点 前者测配体含量, 后者测受体容量, 前者测配体含量 , 后者测受体容量 , 前 者为竞争性,后者为饱和分析. 者为竞争性,后者为饱和分析.