肠球菌、溶血性链球菌和粪链球菌检验培养基(DOC)
肠球菌、溶血性链球菌和粪链球菌检验培养基
葡萄糖肉浸液肉汤Dextrose Meat Infusion Broth 用途：用于溶血性链球菌的增菌培养配方：（g/L）牛肉粉氯化钠蛋白胨磷酸氢二钾葡萄糖pH值7.5 ± 0.1 3.0 5.0 10.0 2.0 10.0 25℃原理：蛋白胨、牛肉粉提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；磷酸氢二钾为缓冲剂；葡萄糖提供碳源。
用法：称取本品 30.0g,煮沸溶解于 1000ml 蒸馏水中,121℃高压灭菌 15 分钟,备用。
质量控制：在36±1℃培养24小时。
质控菌株ATCC生长情况溶血性链球菌（10-8）+++单增李斯特氏菌27853 （10-8）+++大肠杆菌25922 +/-沙门氏菌14028 +/-匹克氏肉汤基础APick’s Broth BaseA用途：用于溶血性链球菌的增菌培养配方：（g/L）胰蛋白胨牛心浸粉叠氮钠结晶紫pH值7.3-7.5 10.0 20.0 0.065 0.002 25℃原理：胰蛋白胨、牛心浸粉提供碳氮源、维生素和生长因子；脱纤维兔血（或羊血）为溶血性链球菌提供大量生长因子；结晶紫和叠氮钠为选择性抑菌剂。
用法：称取本品 30.0g,加热溶于1000ml 蒸馏水中,分装, 121℃高压灭菌 15 分钟, 冷至 50℃左右时,加入脱纤维羊血,混匀。
质量控制：在36±1℃培养18-24小时。
质控菌株ATCC生长情况溶血现象溶血性链球菌+++ +（大）单增李斯特氏菌27853 ++ +（小）大肠杆菌25922 - -沙门氏菌14028 - -肉浸液肉汤培养基Meat Infusion Broth用途：用于溶血性链球菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的增菌培养（GB标准）配方：（g/L）牛肉粉氯化钠蛋白胨磷酸氢二钾pH值7.5 ± 0.1 3.0 5.0 12.0 2.0 25℃原理：蛋白胨和牛肉粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；磷酸氢二钾为缓冲剂；氯化钠可维持均衡的渗透压。
肠球菌属标准操作规程
肠球菌属标准操作规程1.概述肠球菌属于1984年从链球菌属划出，单独成为一个菌属，包括粪肠球菌、屎肠球菌、鸟肠球菌、坚韧肠球菌、铅黄肠球菌、蒙氏肠球菌、海氏肠球菌、鹑鸡肠球菌和病臭肠球菌等18个种和1个变异株。
临床上常见的菌株为粪肠球菌。
2.标本类型血液、尿液、痰、穿刺液、脓液等标本。
3.鉴定3.1 形态与染色革兰阳性球菌，单个、成双或短链状排列。
3.2 培养特性在血琼脂平板上形成较小、灰白色，有a 溶血或β溶血环的菌落。
在麦康凯琼脂平板上形成较小、干燥、粉红色菌落。
3.3 生化反应触酶试验阴性，分解甘露醇、山梨醇、胆汁七叶苷试验阳性、在含6.5%氯化钠的肉汤中生长，多数菌株PYR试验阳性，对杆菌肽耐药。
3.4 鉴别要点3.4.1 本菌特征革兰阳性球菌，触酶试验阴性，在65g/L 氯化钠中生长，胆汁、七叶苷试验阳性，45℃中生长。
3.4.2与屎肠球菌的鉴别：粪肠球菌不分解阿拉伯糖，而屎肠球菌能分解阿拉伯糖3.4.3 与链球菌属和乳球菌属的鉴别：见表5-353.4.4 粪肠球菌与其他各主要菌种间的鉴别：见表5-36操作步骤3.5.1 触酶试验阳性参见触酶试验标准操作规程3.5.2 鉴定从血平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。
4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100-S20最新版本文件.5.质量控制参见《质量控制程序》6.检验结果解释与分析在β-内酰胺酶阴性球菌肠球菌中，氨苄西林药敏试验结果可预测阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林和哌拉西林-他唑巴坦等敏感性。
青霉素药敏试验可预测氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林和哌拉西林-他唑巴坦等药敏结果。
粪肠球菌中氨苄西林药敏结果可以预测亚胺培南的药敏结果。
对于血培养和脑脊液中分离到的肠球菌，需做β-内酰胺酶检测，β-内酰胺酶阳性，则对青霉素、羧基青霉素和脲基青霉素均耐药。
肠球菌、溶血性链球菌和粪链球菌检验培养基
葡萄糖肉浸液肉汤Dextrose Meat Infusion Broth 用途：用于溶血性链球菌的增菌培养匹克氏肉汤基础APick’s Broth BaseA用途：用于溶血性链球菌的增菌培养肉浸液肉汤培养基Meat Infusion Broth用途：用于溶血性链球菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的增菌培养（GB标准）叠氮钠葡萄糖肉汤Azide Dextrose Broth 用途：用于链球菌的增菌培养乙基紫叠氮钠肉汤用途：用于链球菌的增菌培养KF链球菌琼脂KF Streptococcus Agar 用途：用于链球菌的选择性分离及计数（GB、SN标准）肠球菌琼脂(胆盐－七叶苷－叠氮钠琼脂)Enterococcus Agar(Bile Esculin Azide Agar) 用途：用于食品和水中肠球菌的计数CATC琼脂CATC Agar 用途：用于食品和饮料肠球菌的分离培养胆盐七叶苷琼脂Bile Esculin Agar用途：用于肠球菌和肠道致病菌的分离培养哥伦比亚血琼脂基础Columbia Blood Agar Base 用途：营养非常丰富，用于各种细菌的基础培养基LIM培养基LIM Medium 用途：用于链球菌的分离培养（Japan方法）BETA-SSA琼脂BETA-SSA Agar用途：用于链球菌的选择性分离培养粪肠球菌琼脂Enterococcus faecalis Agar 用途：用于粪肠球菌的选择性分离缓冲蛋白胨水Buffered Peptone Water 用途：用于阪崎杆菌前增菌培养（GB2008标准）胆汁液态培养基Bile broth用途：用于粪链球菌的胆汁耐受试验。
M-肠道菌琼脂M-Enterococcus Agar用途：用于水中或其它物质中肠球菌分离培养和计数（滤膜法或划线法）THB培养基THB Medium 用途：用于链球菌增菌培养PS琼脂PS Agar 用途：用于消化球菌的培养肠球菌肉汤Enterococcus Broth 用途：用于肠球菌增菌培养脑心浸液肉汤（BHI）Brain Heart Infusion Broth 用途：用于细菌的增菌培养脑心浸萃液肉汤Brain Heart Infusion Broth 用途：用于营养苛求细菌的增菌培养脑心浸液琼脂（BHIA）Brain Heart infusion Agar 用途：用于营养苛求细菌的增菌培养Pfizer肠球菌选择性琼脂（PSE琼脂）Pfizer Enterococcus Selective Agar 用途：用于粪链球菌的选择性分离和计数（SN标准）MEI培养基MEI Medium 用途：用于一步滤膜法显色检测或计数水中的肠球菌。
中文名称肠球菌显色培养基
中文名称: 肠球菌显色培养基英文名称：Enterococcus faecium chromogenic medium产品规格：1000ml用途：用于肠球菌的显色培养，肠球菌显红色至紫红色作用:肠球菌显色培养基是公司改良的培养基，用于快速检测食品、水质和环境中的肠球菌。
菌落显红色至紫色，其它菌显无色、黄色或被抑制。
肠球菌显色培养基是用于快速检测食品、水质和环境中的肠球菌。
菌落显红色至紫色，其它菌显无色、黄色或被抑制。
成份(g/L)此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。
用法称取本品56.4g，水浴加热溶解于1000ml 蒸馏水中，冷却至45-50℃时，倾入无菌平皿，备用。
无需高压灭菌;操作步骤使用前，把制备好的培养基放置室温10-20 分钟。
1、按国家标准、SN标准、FDA标准或其它方法制备样品液；2、取样品液1ml加入冷却至45-50℃肠球菌显色培养基中混匀或涂布于平板上；或取样品液划线接种于肠球菌显色培养基上；3、36℃培养24～48h，选用有30～200 个菌落的平板，计数平板上出现的红色至紫色菌落。
质量控制1、外观此干燥培养基的粉末均匀，具有良好的流动性，呈淡黄色至乳白色。
制备好的平板呈透明淡黄色培养基。
2、微生物试验在36℃培养24-48h：典型特征典型菌落为红色至紫色。
贮存制备好的平板应立即使用，应避免光线直接照射。
干燥培养基应放置于阴暗干燥处，保存温度2-8℃，注意避光保存。
失效干燥培养基超过保质期、结块和颜色变化都不能使用。
注意此培养基仅供实验室使用。
肠球菌显色培养基的微生物灵敏度试验:按标签用法制备培养基，接种以下质控菌株，放置36±1℃需氧培养24-48小时。
注：回收率计算时，用TSA琼脂做对照培养基。
肠球菌、溶血性链球菌和粪链球菌检验培养基
葡萄糖肉浸液肉汤Dextrose Meat Infusion Broth 用途：用于溶血性链球菌的增菌培养Pick ' s Broth BaseA用途：用于溶血性链球菌的增菌培养pH 值7.3-7.5 25 C原理：胰蛋白胨、牛心浸粉提供碳氮源、维生素和生长因子；脱纤维兔血〔或羊血〕为溶血性链球菌提供大量生长因子；结晶紫和叠氮钠为选择性抑菌剂。
用法：称取本品，加热溶于1000ml蒸馏水中，分装,121 C高压灭菌15分钟，冷至50C左右时，参加脱纤维羊血，混匀。
质量控制：在36 ±1 C培养18-24小时。
Meat Infusion Broth用途：用于溶血性链球菌、蜡样芽抱杆菌和金黄色葡萄球菌的增菌培养〔GB标准〕配方：〔g/L〕原理: 蛋白胨和牛肉粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；磷酸氢二钾为缓冲剂；氯化钠可维持均衡的渗透压。
用法：称取本品，溶解于1000ml蒸馏水中,121C高压灭菌15分钟，备用质量控制：在36 ±1 C培养18-24小时。
Azide Dextrose Broth 用途：用于链球菌的增菌培养用途：用于链球菌的增菌培养KF Streptococcus Agar 用途：用于链球菌的选择性别离及计数〔GB、SN标准〕肠球菌琼脂胆盐-七叶苷-叠氮钠琼脂Enterococcus Agar(Bile Esculin Azide Agar) 用途：用于食品和水中肠球菌的计数CATC Agar用途：用于食品和饮料肠球菌的别离培养Bile Esculin Agar 用途：用于肠球菌和肠道致病菌的别离培养配方：〔g/L〕Columbia Blood Agar Base 用途：营养非常丰富，用于各种细菌的根底培养基用法：称取本品39克，加热溶解于1000ml蒸馏水中，分装，121 C高压灭菌15分钟，冷至45-50'C左右时, 参加相当于20mg庆大霉素的无菌硫酸庆大霉素，混匀，倾入无菌平皿。
溶血性链球菌检验
2、食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局 部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染；
3、熟食制品因包装不善而使食品受到污染。
溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼 吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细 菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。
①急性肾小球肾炎（acute glomerulonephritis）
在咽炎或脓皮病后均可发生，多见于儿童和青少年。 发病机理：Ⅲ型超敏反应；
Ⅱ型超敏反应；
②风湿热（rheumatism，or rheumatosis）
主要在咽炎后有可能发生，临床表现以关节炎、心肌炎为 主。
发病机理：尚未完全清楚，但本病不是链球菌直接侵袭所 致。
(3)血平板上分纯
观察溶血性链球菌在血平板上的菌落特征，灰白色、 半透明或不透明、表面光滑、圆形突起的细小菌落， 以及在菌落周围有2～4mm界限分明、无色透明的溶 血环。
(4) 杆菌肽敏感试验
杆菌肽是一种抗生素，挑取乙型溶血性链球菌液， 涂布于血平板上，用无菌镊子夹取的杆菌肽纸片， 放在上述平板上，置 36±1℃培养18～24小时，如 有抑菌带出现即为阳性。同时用已知阳性菌株作对 照。
根据抗原结构不同分类
根据多糖抗原不同分18群（其中致病菌株多 属于A群）。
各群之间，又按蛋白质抗原不同，分若干 型。如A群—— 分M、T、R…等约100个型
B群——分 4型 C群——分13型
在18个血清型群中,主要致病的血清群
A群：主要对人类致病，如猩红热、丹毒、扁桃腺炎以 及 各种炎症和败血症。对动物致病性不强，但在公共卫生上有 重要性；
不同培养基对肠球菌的检测效果比较
农产 品加工 ・ 学刊 Ａ ａ ｅ ｃＰ ｒ ｄｃｌ ｆ ａｍ ｒｄ ｃ ｒｃｓｉｇ ｃｄｍｉ ｅｉ ｉ ｒ Ｐｏ ｕｔ Ｐｏｅｓ ｏ ａ ｏＦ ｓ ｎ
Ｎｏ １ ．
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文 章 编 号 ：１７ — ６ Байду номын сангаас （０ ２ ０ — １９ ０ ６ １９ ４ ２ １） １ ００ — ２
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和准 确 性 。 关键词 ：肠球菌 ；培养基 ；最近似值测定法
中图分类号 ：Ｑ ３３ ２ ９． ３
文献标 志码 ：Ａ
ｄ ｉ ０３ ６￣ｓｎ１７ — ６ ６ Ｘ） ０ ２０ ． １ ｏ：１ ． ９ ｉ ．６ １ ９ ４ （ ． １ ．１ ３ ９ ｓ ２ ０
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溶血性链球菌的检验
溶血性链球菌在自然界分布较广，可存在于水、空气、 尘埃、牛奶、粪便及人的咽喉和病灶中，按其在血平板 上溶血能力分类，可分为甲型溶血性链球菌、乙型溶血 性链球菌、丙型溶血性链球菌和亚甲型溶血性链球菌。 与人类疾病有关的大多属于乙型溶血性链球菌，其血清 型90%属于A族链球菌，常可引起皮肤和皮下组织的化 脓性炎症及呼吸道感染，还可通过食品引起猩红热、流 行性咽炎的爆发性流行。因此，检查食品是否有溶血性 链球菌具有现实意义。
4.链激酶试验
致病性乙型溶血性链球菌能产生激酶素（即溶纤维蛋白酶），此酶能激 活正常人体血液中的血浆蛋白酶原，使成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋 白。
吸取草酸钾血浆0.2ml，加0.8ml灭菌生理盐水，混匀，再加入18h24h，36度培养的链球菌培养物0.5ml及0.25%氯化钙0.25ml，振荡摇 匀，置于36度水浴中10min，血浆混合物自行凝固，然后观察凝固块重 新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24h不溶解即为阴性。
食品学院
3、透明质酸酶：又称扩散因子，能分解细胞间质的透明 质酸，故能增加细菌的侵袭力，使病菌易在组织中扩散。 4、链激酶：又称链球菌纤维蛋白溶酶，能使血液中纤维 蛋白酶原变成纤维蛋白酶，具有增强细菌在组织中的扩散 作用，该酶耐热，100℃50分钟仍可保持活性。 5、脂磷壁酸（LTA）：与细菌粘附于宿主细胞表面有关， 大多数LAT位于细胞膜和肽聚糖之间，通过肽聚糖孔伸展 至细菌细胞表面，人类口腔粘膜和皮肤上皮细胞、血细胞 等细胞膜上均有LAT的结合位点。
食品学院
5.杆菌肽敏感试验 挑取乙型溶血性链球菌液，涂布于血平板上，用灭菌镊子 夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上， 于36度培养18-24h，如有抑菌带出现即为阳性，同时用 已知阳性菌株作为对照。
粪链球菌及检验
粪链球菌及检验一、生物学性状依据最新分类原则，粪链球菌又叫粪肠球菌。
应用C多糖抗原，依据兰氏（Lancefield）血清学分类，可将链球菌分成很多群。
粪链球菌属于D群。
D群链球菌分肠球菌和非肠球菌两类。
前者包括粪链球菌（S.faecalis）、屎链球菌（S.faecium）和坚忍链球菌（S.durans）,后者有牛链球菌（S.bovis）和马肠链球菌(S.equinus)。
粪链球菌菌形圆或椭圆，可顺链的方向延长,直径0.5-1.0微米,大多数成双或短链状排列,通常不运动。
在丰富培育基上菌落大而光滑，直径1-2mm，全缘，罕见色素。
其养分要求低，在一般养分琼脂上也可生长。
能在10℃或45℃ pH 9.6或含6.5%NaCl肉汤培育基中生长，并能耐65℃ 30分钟。
它可利用精氨酸为能源，发酵山梨醇，不发酵阿拉伯糖。
在简洁的培育基上生长不需叶酸。
近年来，DNA-DNA杂交结果显示，肠球菌与链球菌属同源程度低，故有学者建议另立肠球菌属，与人类有关者为粪肠球菌（E.faecalis）和屎肠球菌（E.faecium）。
二、致病性粪链球菌引起的感染有尿路感染、化脓性腹部感染、败血症、心内膜炎和腹泻发烧等。
其中败血症最常继发于生殖泌尿性感染，皮肤、胆道、肠道等感染也可作为原发病灶。
从自然乳清培育物中分别的菌株，能产生一种细菌素，叫肠球菌素（Enterocin），对单增李斯特氏菌有杀灭作用。
三、流行病学粪链球菌为条件致病菌，它来源于人和温血动物的粪便，间或消失于感染的尿道及急性心内膜炎。
它能够通过食品对人类造成感染，因而常见于很多食品，如火腿肠、炸肉丸、布丁及经过巴氏消毒的牛奶等，粪链球菌进入食物链的主要缘由是不卫生的加工条件所致的，一般与直接的粪便感染无关。
粪链球菌引起的感染大多是由于它的侵袭所造成，感染剂量较高，一般大于107个细菌。
人、禽感染率最高，亦见于猪、牛、马、山羊、绵羊及兔。
四、检验与掌握1、检验：样品制备取25g或25mL样品，放入225mL灭菌生理盐水中，充分混匀，制成1：10样品稀释液。
链球菌、肠球菌
方法：挑取菌落2-3个转种于含有提取酶的 试管中，使其成为乳化均匀的菌悬液，置 37℃水浴15min。在卡片的相应区域滴加一 滴A、B、C、D、F、G致敏胶乳，再加入 处理后的菌悬液一滴分别与胶乳混匀，同 时在卡片相应区域加一滴控制液与任意一 滴致敏乳胶混匀，作为阳性对照，轻摇卡 片，观察结果。
主要生化反应
S. pneumoniae
optochin试验: 含 5μg optochin 纸片 贴于 涂布有待测菌 的平板上35℃孵育过 夜，抑菌圈大于 14mm即为敏感。
甲型溶血链球菌(R) 肺炎链球菌(S)
胆汁溶菌试验 原理：胆汁或胆盐能活化肺炎链球菌的自 溶酶，促进细菌细胞膜破损或菌体裂解而 自溶。 方法：A、平板法：在血琼脂平板上选择 出待检的草绿色溶血的菌落，观察记录菌 落特点，然后于菌落上加一滴去氧胆酸钠 溶液，35℃孵育15-30min观察结果。
CAMP试验
原理：B群溶血性链球菌能产生CAMP因子， 该物质可促进金黄色葡萄球菌β溶血素的活性，故 在血琼脂平板上两菌交界处溶血能力增强，形成 箭头状透明溶血区。 方法：在羊血琼脂平板上，用金黄色葡萄球菌 划种一条横线，在将被检菌距金葡菌接种线3mm 处直角接种一短线，35℃培养18-24h观察结果。同 时设阳性对照和阴性对照。
B、试管法：将甲型链球菌和肺炎链球菌血 清肉汤培养液1ml分别加入2支试管，再于各 管中加入去氧胆酸钠溶液0.1ml，摇匀后置 于37℃水浴30min后观察结果。 结果判断：平板法若菌落消失为阳性， 不消失为阴性，试管法若液体由浑浊变透 明为阳性，不透明为阴性，此试验是鉴别 甲型溶血性链球菌和肺炎链球菌的重要试 验，后者阳性。
链球菌的溶血性
β溶血性链球菌
常见致病菌检验—溶血性链球菌检验
三、微生物检验
（二）检验操作要点 6、生化鉴定： （2）杆菌肽敏感试验
将分纯的乙型溶血性链球菌接种血平板，在划 线处贴附杆菌肽纸片，37℃18h，出现抑菌带 为阳性，据此可推测为乙型溶血性链球菌。
三、微生物检验
（二）检验操作要点 7、报告： 根据培养后的形态，菌落特征及生化试验可报 告：有乙型溶血性链球菌生长。
2）链激酶（streptokinase；SK）
3） 链道酶（streptodornase；SD）
2. 所致疾病
淋巴管炎， 化脓性感染 蜂窝组织炎，
扁桃体炎等
毒素性疾病 猩红热
超敏反应性疾病 风湿热 急性肾小球肾炎
痈
链球菌感染
金黄色葡萄球菌感染
Ⅱ型超敏反应
溶血性链球菌
肾小球基底膜 共同抗原 急性肾小球肾炎
（2）外毒素类 1）致热外毒素
• 红疹毒素，猩红热毒素 • A群链球菌溶原菌菌株产生 • 引起猩红热
2） 链球菌溶血素
• SLO：对O2敏感。测定SLO抗体含量，可作为链球菌新近感染指 标之一或风湿热及其活动性的辅助诊断
• SLS：对O2稳定，β溶血环
（3）侵袭性酶 1） 透明质酸酶
• 扩散因子 • 分解细胞间质的透明质酸→组织中扩散
1、食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化 脓性炎症时造成食品的污染；
二、 生物学特性
2、食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺 炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染； 3、熟食制品因包装不善而使食品受到污染。 溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性 炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以 及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风 湿热、肾小球肾炎等变态反应。
病原学特性
链球菌及肠球菌鉴定说明
链球菌及肠球菌鉴定试剂使用说明书 3.4【原理】：本试剂盒用于体外标本中细菌（链球菌及肠球菌）的鉴别培养。
【试剂盒组成】：① 10或20个鉴定板(培养基) ② 10或20张结果记录单。
③操作说明书1份【本试剂盒所需显色试剂及配制方法】： VPⅠ：5% α-萘酚无水乙醇溶液。
VPⅡ：40% KOH水溶液。
【贮存及效期】：2-8℃贮存，效期见外标签。
【操作】：1.菌落的选择●根据革兰氏染色，触酶等确定菌株属链球菌科。
记录溶血类型（这组成第22个测试结果）。
●挑取单个菌落在哥伦比亚羊血琼脂平板上均匀涂抹整个表面。
(如疑为肺炎链球菌应涂2个平板最合适)●根据菌株生长条件在厌氧或好氧条件下于35-37℃培养18-24小时。
注：一般菌在培善24小时后可产生足够大的菌落。
有些菌落太小应培养48小时后才选择菌落。
对营养苛求菌(在48小时后只产生小菌落)，应将培养菌落种于1ml增菌培养基中，置35-37℃培养5小时。
用整个培养物注入哥伦比亚羊血琼脂平板上。
2.接种●取出试验板条，平衡于室温。
在鉴定试条伸出的边沿处标上菌株编号。
●取无菌蒸馏水3ml，将培养18-24小时的目的菌洗脱下来,制成菌悬液，使其浊度相当于4号McFarland标准浊度。
●将调制好的菌悬液按每孔100ul，加入试验板条中。
除VP孔外，每孔滴加液体石蜡2滴覆盖。
（为防止VP孔蒸干，可在未加试剂的三个孔中各加蒸馏水100-200ul）●盖上盖子，放35～37℃孵育18～24小时，取出按判读标准判读自然发生的结果和加入反应试剂后出现的结果（滴加VP试剂于相应孔中观察），并记录在记录单上。
●将反应结果输入计算机BIO-KONT STREP软件得到鉴定结果。
使用后的所有的玻璃管、玻璃片、吸头、试条及试验纸条等均须高压灭菌处理。
【质量控制】：为保证试验条的质量试验板条启封后应保持干燥，尽量无菌操作。
BIO-KONT STREP试剂盒的质量检查推荐用以下菌株进行。
微生物学检验(第3版)2012肠球菌与血液标本
具体实验操作
第一天的主要操作：
1.取标本分区画线接种到血平板、SS平板上
假设各位同学的平板经过培养24小时
2.取提供的平板菌落进行G染色观察细菌形态
3.取平板菌落进行触酶试验
4.取平板菌落接种于胆汁七叶苷培养基、6.5% NaCl肉汤培养基
5. 各人放入指定托盘后，由值日生放入35℃培养 24小时。
2、65g/L NaCl生长试验： 原理：肠球菌具有很强的耐盐能力，能在 65g/LNaCL血清肉汤培养基中生长，而链球菌的耐 盐能力较弱，在此培养基中不能生长。 方法：将被检菌接种65g/LNaCL血清肉汤培养基中， 35º C孵化18－24小时。 结果判断和报告：细菌生长且培养基变黄色为阳性， 细菌不生长且培养基不变色为阴性。此试验是鉴定 肠球菌和D群链球菌的重要试验，前者为阳性，后 者为阴性。
血瓶的配制：
血液培养基的种类很多，但共同的是均含有
三组成分：一是支持细菌生长的营养物质； 二是预防血液凝固的成分；三是抑制血液中 的杀菌物质。以生物制品公司生产的半成品： ‘血液增菌肉汤’ 为培养基。
配制步骤ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
(1)、称量、(2)、溶解、(3)、矫正PH、(4)、
分装、(5)、灭菌、(6)、质验、(7)、保存
无菌生长 (7天培养)
3
血液标本出现阳性结果的报告 三级报告制度
当疑有细菌生长时，以无菌操作挑取培养液涂片， 作革兰氏染色，如发现细菌要马上电话报告临床 (描述镜下细菌形态和革兰氏染色情况)，这是第 一级；取培养液转种血平板、中国蓝平板，同时 按涂片所见细菌的类型选药直接做初级药敏。24h 报初级药敏结果给临床，这是第二级；同时挑取 培养基上长出的可疑菌落做正规的生化试验和药 敏。48h根据生化结果发正规报告，同时报告药敏， 这是第三级。
细菌检验表格整理(球菌、肠杆菌、弧菌)
肠外无菌部位——增菌——BAP；
混有其他污染菌——MAC、EMB——抑制其他革兰阳性菌及少数革兰阴性菌；
粪便标本——BAP、MAC、SS；
鉴定：
（科间鉴别）氧化酶、O/F实验
（属间鉴别）
KIA：分解葡——产酸/产酸产气；
分解乳糖——鉴别致病菌与非致病菌
MIU：U——大肠阴性为黄、变形阳性为红；
MAC：发酵乳糖产酸，形成较大黏液型、红色菌落；
在科玛嘉定位显色培养基呈绿色菌落
BAP、MAC培养基分离培养——挑选可疑菌落；
属间鉴别：
MIU（- - +）I除了产酸克雷伯菌，都为阴
KIA（发酵葡萄糖/发酵乳糖）
志贺菌属
4个血清群：A、B、C、D群
致病与侵袭力、内毒素、外毒素有关；
引起人类细菌性痢疾即菌痢，粪口传播；
生化：
发酵葡萄糖（产酸或产酸产气）、触酶+、氧化酶-、硝酸盐还原+；
抗原构造：
主要包括菌体O抗原（脂多糖）、鞭毛H抗原（蛋白质）、表面抗原（多糖）；
O抗原与H抗原是肠杆菌科血清型分群和分型的依据
抵抗力：
不强，高温即可被杀死
标本采集：
只有肠外感染标本做直接镜检（除血液）；
肠道感染标本（粪便、脓血、粘液）；
分类
（1）肠杆菌科：
革兰阴性杆菌，多为肠道的正常菌群；
（2）KIA：克氏双糖铁培养基，为肠杆菌科细菌常用的鉴别培养基
（3）迁徙现象：普通变形杆菌和奇异变形杆菌的大多数菌种在普通琼脂平板上生长时可蔓延成波纹状，布满整个培养基表面
形态：
革兰阴性杆状或球杆状，无芽孢，多有鞭毛，能运动，致病性的菌株多有菌毛；兼性厌氧，营养要求不高，在BAP和MAC上生长良好；
肠球菌属的鉴定要点
肠球菌属的鉴定要点
肠球菌属的鉴定要点
肠球菌属（Enterococcus）是革兰阳性球菌的一类，是一些重要且广泛存在于人和动物肠道中的细菌。
此类细菌是病原菌和医院感染的主要来源之一，因此对于肠球菌属的鉴定显得尤为重要。
本文将从形态特征、生理生化特性以及分子生物学方法等方面介绍肠球菌属的鉴定要点。
形态特征
从形态特征方面，肠球菌属的细菌在革兰染色结果中通常呈现革兰阳性，球形或椭圆形，直径一般为0.5-1.5 μm，有一定的链状或成对排列现象。
在培养基上进行培养时，其菌落呈灰白色或白色，表面多呈平坦或凹陷状，粘度较高，可形成微嗅气味。
生理生化特性
除了形态特征外，还可通过生理生化实验鉴定肠球菌属。
在营养需求方面，肠球菌属偏爱碱性环境，常常能够生长在高盐分和多种碳源的基础培养基中，低温、低氧和高CO2浓度的环境中也可适应生长。
在酶学反应方面，肠球菌属是鲜奶酪加工过程中极为常见的乳酸菌，表现出强烈的产酸、产气和哑巴菌特性。
分子生物学方法
除了生理生化实验外，分子生物学方法也成为肠球菌鉴定的一种新的手段，比如PCR扩增和16S rRNA基因测序等方法。
这些方法的出现对于鉴定肠球菌属的种类和种群密度起到了很大的帮助，同时也大幅度增加了鉴定的准确性。
在进行PCR扩增时，常常会采用16S rRNA 基因作为检测的目标基因，从而通过对其序列的分析来进行细胞种类的识别。
总之，对于肠球菌属的鉴定来说，在形态特征、生理生化特性以及分子生物学方法方面都有着相应的鉴定要点。
我们需要结合多种方法进行鉴定，从而保证准确性和精度。
同时也需要注意防止肠球菌的传播和感染，保障我们的健康和生命安全。
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用途：用于溶血性链球菌的增菌培养
配方：（g/L）
胰蛋白胨
10.0
牛心浸粉
20.0
叠氮钠
0.065
结晶紫
0.002
pH值7.3-7.5
原理:
胰蛋白胨、牛心浸粉提供碳氮源、维生素和生长因子；脱纤维兔血（或羊血）为溶血性链球菌提供大
量生长因子；结晶紫和叠氮钠为选择性抑菌剂。
用法:
称取本品30.0g，加热溶于1000ml蒸馏水中，分装,121C高压灭菌15分钟，冷至50C左右时，加入脱纤
叠氮钠
0.4
红四氮唑（TTC）
0.1
琼脂
15.0
pH值7.0 ±0.2
25C
原理：
胰酪蛋白胨、酵母浸粉提供氮源、维生素和矿物质，磷酸二氢钾是缓冲剂。琼脂是培养基凝固剂。
萄糖提供碳源。
用法:
称取本品30.0g,煮沸溶解于1000ml蒸馏水中，121C高压灭菌15分钟,备用。
质量控制: 在36 ±1C培养24小时。
质控菌株
ATCC
生长情况
容血性链球菌
(10-8) +++
单增李斯特氏菌
27853
(10-8) +++
大肠杆菌
25922
+/-
少门氏菌
14028
+/-
匹克氏肉汤基础A
质量控制:
KF链球菌琼脂
KF Strep tococcus Agar
用途：用于链球菌的选择性分离及计数（GB、SN标准）
配方：（g/L）
月示蛋白胨
10.0
酵母粉
10.0
甘油磷酸钠
10.0
氯化钠
5.0
麦芽糖
20.0
乳糖
1.0
叠氮钠
0.4
琼脂
13.0
溴甲酚紫
0.015
pH值7.2 ±.2
25C
原理：
月示胨和酵母粉提供氮源、维生素和生长因子；麦芽糖和乳糖为可发酵糖类；氯化钠维持均衡的渗透 压；叠氮化钠可抑制革兰氏阴性菌；琼脂是培养基的凝固剂；溴甲酚紫为指示剂染料。
用法:
称取本品56.3g,加热溶解于1000ml蒸馏水中，121C高压灭菌15分钟拎至45 ±C,倾入含1ml样品
液平皿中约15ml培养基，混匀，凝固。35+2C倒置培养基培养24±2h。注：从保温开始至做成平板时间不 要超过4h。
质量控制：
在36±）.5 C培养24小时。
菌 名
菌号
生长状况
培养特征
质控菌株
菌株编号
生长情况
其它特征1
容血性链球菌
ATCC32210
+++
浑浊
金黄色葡萄球菌
ATCC25923
+++
浑浊
大肠埃希氏菌
ATCC25922
+++
浑浊
少门氏菌
ATCC14028
+++
浑浊
叠氮钠葡萄糖肉汤
Azide Dextrose Broth
用途：用于链球菌的增菌培养
配方：（g/L）
胰蛋白胨
15.0
ATCC25922
被抑制
肠球菌琼脂（胆盐-七叶苷-叠氮钠琼脂）
Enterococcus Agar(Bile Esculin Azide Agar)
用途：用于食品和水中肠球菌的计数
货号：HB0133-3
配方：（g/L）
牛肉浸粉
3.0
胰酪蛋白胨
17.0
酵母粉
5.0
牛胆粉
10.0
氯化钠
5.0
七叶苷
1.0
柠檬酸铁铵
葡萄糖肉浸液肉汤
Dextrose Meat Infusion Broth
用途：用于溶血性链球菌的增菌培养
配方：（g/L）
牛肉粉
3.0
氯化钠
5.0
蛋白胨
10.0
磷酸氢二钾
2.0
葡萄糖
10.0
pH值7.5 ±.1
25C
原理:
蛋白胨、牛肉粉提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；磷酸氢二钾为缓冲剂；葡
维羊血，混匀。
质量控制:
质控菌株
ATCC
生长情况
溶血现象
溶血性链球菌
+++
+ （大）
单增李斯特氏菌
27853
++
+ （小）
大肠杆菌
25922
-
-
沙门氏菌
14028
-
-
在36 ±1C培养18-24小时。
肉浸液肉汤培养基
Meat Infusion Broth
用途：用于溶血性链球菌、蜡样芽抱杆菌和金黄色葡萄球菌的增菌培养（
粪链球菌
CMCC(B)32223
良好
棕黑色，具有棕色晕轮
金黄色葡萄球菌
ATCC6538
被抑制
—
大肠埃希氏菌
ATCC25922
被抑制
—
CATC琼脂
CATC Agar
用途：用于食品和饮料肠球菌的分离培养
配方：（g/L）
胰酪蛋白胨
15.0
酵母浸粉
5.0
磷酸二氢钾
5.0
柠檬酸钠
15.0
吐温80
1.0
碳酸钠
2.0
0.5
叠氮化钠
0.25
柠檬酸钠
1.0
琼脂
13.5
pH值7.1±.2
25C
原理:
胰酪蛋白胨和牛肉浸粉、酵母粉提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；细菌水解
七叶苷与柠檬酸铁铵中铁离子反应形成黑色的6,7-二羟基香豆素；柠檬酸钠、牛胆粉和叠氮化钠为选择性 抑菌剂，抑制非链球菌的细菌；琼脂是培养基的凝固剂。
GB标准）
配方：（g/L）
牛肉粉
氯化钠
蛋白胨
磷酸氢二钾
pH值7.5 ±.1
原理:
压。
3.0
5.0
12.0
2.0
蛋白胨和牛肉粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；磷酸氢二钾为缓冲剂；氯化钠可维持均衡的渗透
用法:
称取本品20.0g,溶解于1000ml蒸馏水中，12「C高压灭菌15分钟,备用。
质量控制:
在36 ±1C培养18-24小时。
牛肉浸粉
4.5
氯化钠
7.5
葡萄糖
7.5
叠氮钠
0.2
pH值7.0-7.4
25C
原理:
胰蛋白胨和牛肉浸粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；葡萄糖提供碳源；叠氮化钠可抑制革兰氏阴
性菌。
用法:
称取本品34.7g,加热搅拌溶解于1000ml蒸馏水中，分装，12「C高压灭菌15分钟,备用。
质量控制:
在36 ±1C培养18-24小时。
质控菌株
菌株编号
生长情况
其它特征
肠球菌
+++
/
大肠埃希氏菌
AtCC25922
-
/
粪肠球菌
ATCC29212
+++
/
金黄色葡萄球菌
ATCC25923
-
/
乙基紫叠氮钠肉汤
用途：用于链球菌的增菌培养
配方：（g/L）
酪蛋白胨
13.5
酵母浸粉
6.5
葡萄糖
5.0
氯化钠
2.7
叠氮钠
0.4
乙基紫
0.00083
pH值7.0 ±.2
25C
原理:
酪蛋白胨和酵母浸粉提供氮源、维生素和生长因子；葡萄糖提供碳源；叠氮化钠可抑制革兰氏阴性菌;
氯化钠维持均衡的渗透压；磷酸氢二钠和磷酸二氢钠做缓冲剂；乙基紫作为指示剂。
用法:
取本品35.8g,溶解于1000ml蒸馏水中,121C高压灭菌15分钟,备用。
用法：
称取本品69.4g,加热溶解于1000ml蒸馏水中,121C高压 灭菌15分钟,冷却至50-60C时，加入无菌
1%TTC溶液10ml,混匀,倾入无菌平皿，备用。
质量控制：
在36±）.5 C下培养48h。
菌 名
菌号
生长状况
培养特征
粪性链球菌
CMCC(B)32223
良好
红色或粉红色中心
大肠埃希氏菌