支气管哮喘蛋白质组学研究的现状和前景

!综述!!!作者单位"!"##!$南京医科大学第一附属医院呼吸科支气管哮喘蛋白质组学研究的现状和前景刘!华!殷凯生!!!摘!要"!蛋白质组学是后基因组时代一项重要的生命科学的研究手段’近年在支气管哮喘的发生)发展方面的研究方兴未艾(它主要依托质谱和二维电泳技术比较正常和病理状态下组织或细胞的差异蛋白质的表达’结合生物信息学的方法’从而研究疾病的发病机制及为临床提供诊断和治疗靶点(在哮喘的研究中目前主要是比较蛋白质组学的研究’发现新的靶标为临床服务同时探讨其发病机制(!关键词"!支气管哮喘-质谱-二维电泳!!人类基因组测序的完成’基因组)后基因组及蛋白质组学的研究已引起人们的极大关注’尤其是高通量分析蛋白质组的变化是生命科学的一项里程碑式的发展/"0(在肿瘤的研究中’包括肺癌的研究蛋白质组学已经取得了令人瞩目的成绩’而令人遗憾的是发病率和患病率都居高不下的支气管哮喘蛋白质组学的原创性研究很少/!0(尽管蛋白质组学在哮喘的研究中有它的局限性和方法学上的困难’但相信对生命科学研究有如此重要地位的蛋白质组学一定会给哮喘的研究带来一线曙光(!!蛋白质组学研究的基本方法!&!!二维凝胶电泳和质谱!现在进行蛋白质分离仍然采用三十多年前应用并发展起来的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳法/30’第一维是等电聚焦%7:B ?>?@;A 7@\B @C :78G&’也就是根据蛋白质的等电点设定一个O M 值梯度来分离蛋白质(第二维就是通过0J 0E .)&,胶根据它们的相对分子质量来分离//’20’最后进行质谱鉴定/%0(然而需要说明的是蛋白质分离过程受到很多外来因素的干扰’以至于最后发现的靶点蛋白质不能很好分析(首先’高丰度蛋白质比如血清蛋白可能掩盖低丰度蛋白质’以至于含量和浓度较少的差异蛋白质难以被发现-同时蛋白质提取过程中的降解和修饰化作用都可能直接影响实验结果/4’*0’这个问题最近可能被一些新技术的发展所改进’包括修饰蛋白质的浓缩)强化/$’"#0’柱色谱对体液的预分离’以及选择性剔除高丰度蛋白质等/""’"!0(液相色谱,基质辅助激光解析离子化,质谱,质谱%F 5,P)F J ’,P 0,P 0&和液相色谱,电喷雾离子化,质谱,质谱%F 5,,0’,P 0,P 0&是目前蛋白质组学分离蛋白质技术的新进展(其次’在蛋白质分离过程中要注意相对分子质量的大小和物质的酸碱度’一般要求相对分子质量在"####*!#####’O M 值在/*"#实验结果较好/"0(再次’重复性的问题也是蛋白质组学所面临的一个重要的挑战’目前已基本解决并可以获得高分辨率和高通量的靶蛋白/"3E "20(总之’以二维凝胶电泳为基础的蛋白质分离技术已经显示了其对新的生物学标记和治疗靶点发现的良好应用前景’对于研究不同疾病在生理状态和病理状态下的差异蛋白质的表达具有神奇的功效/"%’"40(在二十世纪九十年代’P 0仪器及技术的改进使蛋白质化学发生了革命性的变化’并整个变更了蛋白质分析技术(在八十年代’,0’和P)F J ’技术上的突破促进了这些改变的发生(这两种技术的出现解决了从大的)非挥发性物质如蛋白质和多肽中产生离子且没有明显的分析物碎片的难题’从而使P 0技术在蛋白质组学的研究中占据了一个非常重要的地位(,0’和一些高性能的分离技术如毛细管电泳%5,&和高效液相色谱%M .F 5&联在一起应用时’对蛋白质和多肽结构的检测灵敏度和速度有令人惊奇的提高(分离技术的进步’特别是微分离技术和高性能的质谱仪的联用’还有微型喷雾器和,0’离子源的发明使得对多肽进行完全分析或序列测定所需的样品量减少’由二十世纪八十年代中期的几个O <B >减至九十年代中期所需的几个\<B >甚至更少(更高效率和灵敏度的质谱技术的发展是正在萌芽的蛋白质组学的一个极其重要的因素’在今天它仍在不断地得到更新(P 0分析方法应用于在生物机体中鉴别蛋白质)计算机途径搜索序列数据)蛋白质表达水平的确定及磷酸化蛋白质或肽的检测等方面(目前最有前途和最流行的P 0技术主要!/%!中华哮喘杂志%电子版&!!##4年!第"卷!第!期!试刊!56789):;6<=%,>?@;A B 87@-?A :7B 8&’9C 8?!##4’-B >D "D (B D !有"基质辅助激光解析离子化E 飞行时间质谱仪%P)F J ’E H I +P 0&’电喷雾离子化E 四极杆E 飞行时间质谱仪%,0’E T E H I +P 0&’,0’离子阱质谱仪’,0’E T E H I +’,0’E H I +’基质辅助激光解析离子化E 离子阱E 飞行时间%P)F J ’E ’H E H I +&’P)F J ’E H I +E H I +’傅里叶变换E 离子回旋共振质谱仪%+H E ’5L P 0&’P)F J ’离子阱’,0’E 离子淌度仪等(!&"!生物信息学工具!P 0鉴定结果应用生物信息学的方法分析是蛋白质组学研究中必不可少的一项工作’P 0发现差异蛋白质靶点在数据库中比对’确定其理化性质’完成了整个蛋白质组学的研究(但是在此过程中由于大量的新样本的出现使我们与有效的参考数据库的比对产生了困难’因此建立一个描述性的全面的生物现象数据库是必要的’而且它必须具有一定的前瞻性和预见性(同时不仅要了解生物现象中存在的基因和蛋白质’而且更重要的是要了解其质和量变化的动态过程’这方面蛋白质组学已经展示了一个美好的前景’且已取得了一定的突破/"*E !#0("!支气管哮喘蛋白质组学应用的现状和前景蛋白质组学在哮喘中的应用起步较晚’其应用主要是比较蛋白质组学发现新的诊断和治疗靶点(最早的研究始于M B C ;<=8等/!"0’他利用非过敏性哮喘小鼠模型和正常小鼠的肺组织行二维电泳和质谱’结果发现了!3个差异的蛋白质表达’其与气道重构’肺的解毒’细胞对炎症和应急的反应’血浆渗漏以及未知的功能有关’但并没有发现一些与哮喘免疫有直接相关的蛋白质靶点’作者分析可能是由于其在体内的低丰度而没有被有效检出’也可能是由于其主要是小肽段’相对分子质量较小有关(最后作者希望通过进一步研究肺的引流淋巴结或支气管肺泡灌洗液%1)F +&从而发现有效的新的蛋白质靶点(自此以后’人们开展了支气管哮喘蛋白质组学方面的一系列研究’到目前为止原创性研究已有"3篇’但偏重于基础或纯粹是基础性研究’选择不同的组织靶标以期发现新的有意义的靶点蛋白质’研究从细胞水平)组织水平)动物模型以及临床标本等方面进行’下面作一综述("&!!支气管哮喘蛋白质组学研究现状!瑞典科学家+=_=A R B 等/!!0应用二维凝胶电泳和质谱%P)F J ’,H I +和P)F J ’E H I +,H I +&方法检测哮喘模型小鼠和正常小鼠的肺组织和1)F +’结果发现在炎症组织中一些蛋白质靶点显著增高’尤其是一些与低氧有关的蛋白质点的增高"精氨酸酶)相对分子质量4*###的糖调节蛋白质以及糖代谢酶等(P =><:;A B <等/!30应用蛋白质组学的方法研究了与人类支气管哮喘’特发性纤维化及慢性阻塞性肺疾病%5I .J &有密切关系的肺成纤维细胞在静息状态和活化状态下蛋白质谱的变化’并运用定量质谱研究了转化生长因子E %"%H &+E %"&刺激下的成纤维细胞蛋白质谱’将其发现的肽段编写进了数据库’这也是从细胞水平研究哮喘发病机制较为全面的一项工作(在其工作中同时发现H &+E %在成肌纤维母细胞的分化中起着一个中心性的调节作用’其机制可能是通过改变剪接因子%:O >7@78G \=@;B A :&的相对比率实现的(这项工作提示我们蛋白质组学的研究不仅仅是通过研究发现新的诊断和治疗靶点’同时也是研究哮喘发病分子机制的重要手段(F =‘:?8等/!/0研究了轻度哮喘患者肺成纤维细胞的活化’结果发现在气道上皮外的炎症反应中成纤维细胞起着重要作用’同时在气道纤维化中扮演一个重要角色’尤其是伸长的成纤维细胞%?>B 8G?R \7[A B [>=:;:&伴有L B 6)和L =@"的表达’说明它们的表达与成纤维细胞迁移能力的增加有密切关系(与临床治疗有关的是韩国学者L B 6等/!20于!##/年完成的’他和同事研究了地塞米松治疗哮喘小鼠后肺的蛋白质组的变化并和正常小鼠进行比较(作者为了探讨临床部分哮喘患者对糖皮质激素治疗效果不好而设计实验’但却并没有建立糖皮质激素依赖的哮喘小鼠的模型’其结果是观察了激素治疗后哮喘小鼠肺蛋白质组的变化’说明了激素可以阻止杯状细胞的增生及具有抗炎作用’从而从靶点蛋白质的角度探讨了可能的激素作用机制’为以后进一步研究激素依赖的机制做了一个很好的前期工作(研究结果也提示"细胞骨架蛋白)氧化应急)细胞凋亡可能与激素依赖有关(近段时间来’人们为了发现与哮喘发病免疫机制有关的可能的新的靶点’进行了一系列有针对性的工作(有代表性的当属L B :?8G A ?8等/!%0和P C A O 6]等/!40的工作’L B :?8G A ?8从5J /Q H 细胞的分化角度研究了白介素E "!%’F E "!&刺激后5J /QH 细胞表达的/!个差异蛋白质靶点’其中有!!个上调’!#个下调(上调的蛋白质靶点包括一个多功能的细胞因子"巨噬细胞移动抑制因子%P ’+&和一个已知的’F E "!靶基因"程序性细胞死亡/%.R @R /&(下调的蛋白质有蛋白激酶.=V!以及它上游的的&H .=:?@R @/!和一个热休克蛋白家族成员P B ;E !(P ’+除了它的致炎和抗炎活性以外’还具有氧化还原酶的活性’通过结合5J 4/作为一个分泌因子诱导细胞信号传导’可以通过细胞的内吞作用被吸收(最近关于日本人群中P ’+启动子和特应性!2%!中华哮喘杂志%电子版&!!##4年!第"卷!第!期!试刊!56789):;6<=%,>?@;A B 87@-?A :7B 8&’9C 8?!##4’-B >D "D (B D !的多态性之间的关系已见诸报道’而早期的研究中已经证实P ’+多态性与青少年关节炎及风湿性关节炎的严重性有密切关系(在作者的研究中发现了’F E "!刺激后P ’+的上调’说明了P ’+多态性与辅助性H 细胞功能失调之间可能存在的联系(.R @R /可以在环氧化酶E !%5I U E !&抑制剂作用下在细胞内表达增加’也说明了.R @R /与炎症之间千丝万缕的联系(同时.R @R /也是一种肿瘤抑制剂’可以通过抑制5E 9C 8?和5E +B :的活性而抑制).E "的活化(它也可以通过和真核细胞翻译启动子%?’+/)&的相互作用而抑制蛋白质的翻译’部分解释它的抗新生瘤的特征(5R @/!和.=V!是同一个细胞信号通路的成分’它们的活化抑制细胞的程序性死亡’以前研究’F E /可以加强5R @/!蛋白的数量’也间接说明了5R @/!和炎症之间的关系(从作者的研究结果可以看出’通过’F E "!刺激后’5J /Q H 细胞的分化表达产物均与抗炎或致炎有密切的关系’通过全面分析这些产物开拓了研究哮喘发病的分子免疫机制的视野(P C A O 6]则利用表面加强激光解析离子化E飞行时间%0,F J ’E H I +&质谱技术确定了哮喘母亲胚胎和脐带血的蛋白质谱和正常妊娠母亲的差异’结果证实了0,F J ’E H I +是一个有效的蛋白质组学研究的工具’并为进一步研究发病机制提供了一组候选肽段’尤其是可能与妊娠哮喘有关的蛋白质靶点(为了发现可能与哮喘发病有关的小肽段’h ?B 等/!*0利用M .F 5代替二维电泳串联P 0研究哮喘小鼠血浆蛋白质和正常小鼠血浆蛋白质的比较’发现53\片段是一种有意义的靶点’作者认为其可能成为哮喘的一种新的诊断标志(对1)F +的蛋白质组学的研究始于i 6=B 等/!$0’他使用经典的蛋白质组学的研究方法比较了哮喘模型小鼠和对照组之间1)F +的差异蛋白质’结果发现了!*个差异的蛋白质靶点(其中’>C 8G V 78?是介导中性粒细胞向肺内迁移的重要介质’这在以前的研究中已经证实’而中性粒细胞在过敏性气道炎症中的地位还没有有力的证据(已经有实验证实了早期过敏原激发后就有中性粒细胞的浸润’是否预示着中性粒细胞是过敏性炎症早期浸润的主要炎症细胞’有待于进一步证实’这是作者的一个非常大胆的假设(同时有实验证实在哮喘恶化期不管有否细菌感染’诱导痰的中性粒细胞明显增加(G B [E 2是作者通过蛋白质组学的研究方法第一次发现且有重要意义的靶点蛋白质’G B [E 2是氯离子通道的成分’伴随着氯离子的排出杯状细胞黏液分泌增加’在这过程中G B [E 2起着非常重要的作用(G B [E 2在正常气道和过敏气道均有表达’但在过敏气道中明显增加’而在人类G B [E 2对应于65F 5)"’后者受控于Pe 52)5’Pe 52)5是负责杯状细胞代谢和黏液分泌的主要基因’可见发现G B [E 2在哮喘小鼠模型中高表达的意义(最早进行临床哮喘患者1)F +蛋白质组学研究的是美国学者W C 等/3#0(他于抗原激发前后!/6在健康人群和哮喘人群中进行比较蛋白质组学研究’发现了一系列与哮喘发病有关的蛋白质"细胞因子)化学因子)蛋白酶)补体片段)急性期反应蛋白)单核细胞特异性颗粒蛋白以及局部基质蛋白等(总之’支气管哮喘的蛋白质组学研究方兴未艾’相信在不久的将来关于支气管哮喘临床治疗方面的蛋白质组学研究也会见诸报道("&"!支气管哮喘蛋白质组学应用前景!目前关于哮喘的蛋白质组学研究还是偏重于基础或者是纯粹基础性研究’有关临床治疗哮喘方面的研究还未见报道’比如"激素依赖性哮喘)脆性哮喘)运动性哮喘)老年性哮喘)月经性哮喘)感染性哮喘等’这些与临床密切相关的难以处理的哮喘应是以后研究的一个方向’也更有科研)学术和临床应用价值’具有更好的前景-同时选择好的研究靶组织也是需要不断探讨的问题’尤其如何有效干预以便与哮喘发病的分子机制有机结合’才能显示其更加旺盛的生命力’上面综述的一些科研方法值得我们去总结)学习(#!结语蛋白质组学技术应用至今仍然处在不断完善和发展中’尤其是关于哮喘的研究更是处于起步阶段’国际上目前仅有十几篇的原创性研究’而国内未见报道’可见其研究潜力和空间很大’同时国内的技术平台比较成熟’故积极开展国内的蛋白质组学研究迫在眉睫’关键是不要重复别人的工作(参!考!文!献"!5A =<?A 7’D H 6?O B ;?8;7=>B \O A B ;?B <7@:=8R O ?O;7R B <7@:\B A =>>?A G ]=8R =:;6<=A ?:?=A @6D )>>?A G ]’!##2’%#""!!4E "!34D !!L ?8?M ’‘=8R ?8W B A <,D ):;6<=’;6?R C @V >78G B \>C 8G R 7:?=:?O A B ;?B <7@:1956A B <=;B G A1)8=>];H ?@68B >17B <?RF 7\?0@7’!##2’*"2"!*2E !$/D3!I c \=A A ?>.MD M 7G 6A ?:B >C ;7B 8;^B E R 7<?8:7B 8=>?>?@;A B O6B A ?:7:B \O A B ;?78:D 917B >56?<’"$42’!2#"/##4E /#!"D /!H B B W)’F ??J h ’g 7<5WD J ?‘?>B O <?8;B 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