翻译好的-罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书
翻译好的罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书
罗氏 (Roche)公司 Tunel 试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法)一、原理：TUNEL （TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA 的断裂情况。
其原理是荧光素（ fluorescein）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（ TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的3’-OH 末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与 HRP 底物二氨基联苯胺（DAB ）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 断裂，因而没有 3‘-OH 形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1 号（蓝盖） Enzyme Solution 酶溶液： TdT 10×、2号（紫盖） Label Solution 标记液：荧光素标记的 dUTP 1×、3号（棕瓶） Converter-POD:标记荧光素抗体的 HRP；自备试剂： PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB 工作液（临用前配制， 5 μl 20 ×DAB+1 μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（ 10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl ，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于 0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、 DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl ，pH 7.5， 10 mM MgCl2 ，1 mg/ml BSA ）等。
TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤
TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤--------------------------------------------------------------------------------凋亡细胞的原位末断转移酶标记法（TUNEL法）细胞凋亡的多步骤机制作用的最终环节是；细胞内源性核酸内切酶的激活而导致核染色质DNA双链的断裂。
大量DNA片段暴露出的3 羟基在末断转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)或DNA多聚酶的作用下，与生物素或地高辛标记的核苷酸结合，最终借助与卵白素或抗地高辛抗体结合的荧光素或HRP，使凋亡细胞被特异性地标记和显示出来。
TUNEL细胞凋亡试剂盒由美国罗氏公司提供试剂1：酶浓缩溶液（Enzyme Solution）试剂2：标记溶液（Lable Solution）试剂3：转化剂-POD（Converter-POD）酶标记抗荧光素抗体（即用型）试验所需其它试剂：非石蜡切片:·冲洗缓冲液:磷酸盐缓冲液（PBS）·阻断溶液:0.3%H2O2甲醇溶液·固定溶液:4%多聚甲醛（溶剂pH7.4新鲜配制的PBS溶液）·渗透液:0.1%Triton甔-100（溶于新鲜配制的0.1%枸橼酸钠溶液）Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)名：曲拉通X-100，乳化剂OP分子式：C34H62O11石蜡切片:·二甲苯和乙醇（100%、95%、90%、80%、70%用蒸馏水稀释）·冲洗缓冲液:磷酸盐缓冲液（PBS）·蛋白酶K 工作液10~20mg/ml溶于10mM Tris/HCl（pH7.4~7.8）根据需要选择:·渗透液:0.1%TritonX-100（溶于新鲜配制的0.1%枸橼酸钠溶液）·胃酶溶液（0.25%-0.5%溶于HCl ，pH2）或胰酶·0.1M枸橼酸缓冲液，pH6，微波修复材料：微波炉，微波输出功率850W-2000W2 .选用中性甲醇固定的活检及实验动物标本，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。
自己翻译的罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书
罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书注意：Label溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴，严禁吸入和食入。
反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。
除上表所列试剂外，还需准备以下溶液。
下表列出每步所需物品概览：特异性：TUNEL反应优先标记凋亡产生的DNA链断裂，从而辨别凋亡与坏死、以及由抑制细胞生长的药物或放射线产生的primary DNA链断裂实验干扰：假阴性：在某些型式的凋亡细胞中DNA链断裂可能缺失或不完全。
空间位阻，如细胞外元件可能阻止TdT到达DNA断裂处。
两种情况均能产生假阴性。
假阳性：在坏死晚期，可能产生大量的DNA片段DNA链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。
两种情况均能产生假阳性。
为确认细胞死亡的凋亡型式，应认真进行每种细胞的形态学检查凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式，因此，对于可以结果进行解释时，细胞形态评估是一项重要的参数样本：细胞离心涂片和细胞涂片在chamber slides上培养的黏附细胞冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本分析时间：2-3小时，除外培养、固定和渗透检测次数：一个试剂盒50T试剂盒存储/稳定性：未开封试剂盒储存于-15～-25℃可稳定至标签上标明的效期。
1 流程图：2 样品准备2.1 黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片需准备的其他试剂：Washing buffer：磷酸盐缓冲液（PBS）Blocking buffer封闭溶液：甲醇稀释的3% H2O2Fixation solution固定溶液：PBS配制的4%多聚甲醛，ph 7.4，新鲜配制Permeabilisation solution 渗透液：0.1%Triton1）X-100溶于0.1%柠檬酸钠溶液中，新鲜配制步骤：下表描述了细胞固定、内源性过氧化物酶封闭和细胞渗透过程。
2.2 组织部分2.2.1 福尔马林-包埋组织福尔马林包埋组织的预处理：可按4种不同的方式预处理。
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罗氏 (Roche)公司 Tunel 试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法)一、原理：TUNEL （TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA 的断裂情况。
其原理是荧光素（ fluorescein）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（ TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的3’-OH 末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与 HRP 底物二氨基联苯胺（DAB ）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 断裂，因而没有 3‘-OH 形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1 号（蓝盖） Enzyme Solution 酶溶液： TdT 10×、2号（紫盖） Label Solution 标记液：荧光素标记的 dUTP 1×、3号（棕瓶） Converter-POD:标记荧光素抗体的 HRP；自备试剂： PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB 工作液（临用前配制， 5 μl 20 ×DAB+1 μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（ 10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl ，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于 0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、 DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl ，pH 7.5， 10 mM MgCl2 ，1 mg/ml BSA ）等。
罗氏（Roche）公司Tunel试剂盒操作说明书
罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HR P；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml–3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7. 5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
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罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法)一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml–3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
罗氏 荧光 tunel (11684795910)说明书
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein
y Version 17
Content version: November 2012
Preface .....................................................................................................................................................2 Table of contents ................................................................................................................................................................. 2 Kit contents ............................................................................................................................................................................ 3 Introduction ............................................................................................................................................5 Product overview .................................................................................................................................................................. 5 Background information ................................................................................................................................................... 8 Procedures and required materials .................................................................................................10 Flow chart .............................................................................................................................................................................10 Preparation of sample material ....................................................................................................................................11 Cell suspension ..................................................................................................................................................................11 Adherent cells, cell smears, and cytospin preparations .....................................................................................12 Tissue sections ....................................................................................................................................................................12 Treatment of paraffin-embedded tissue ...................................................................................................................12 Treatment of cryopreserved tissue ..............................................................................................................................14 Labeling protocol ...............................................................................................................................................................15 Before you begin ................................................................................................................................................................15 Labeling protocol for cell suspensions ......................................................................................................................16 Labeling protocol for adherent cells, cell smears, cytospin preparations and tissues ...........................................................................................................................................................................17 Labeling protocol for difficult tissue ...........................................................................................................................18 Typical results ......................................................................................................................................19 Appendix ................................................................................................................................................20 Troubleshooting .................................................................................................................................................................20 References ............................................................................................................................................................................23 Related products ................................................................................................................................................................24
翻译好的罗氏公司Tunel试剂盒操作说明方案
罗氏(R o c h e)公司T u n e l试剂盒操作说明书(Insitucelldeathdetectionkit-POD法)一、原理：TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1号（蓝盖）EnzymeSolution酶溶液：TdT10×、2号（紫盖）LabelSolution标记液：荧光素标记的dUTP1×、3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS）、ProteinaseK工作液（10-20μg/mlin10mMTris/HCl，pH7.4-8）或细胞通透液（0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase1（3000U/ml–3U/mlin50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mg/mlBSA）等。
TUNEL说明书
TUNEL说明书1 介绍TUNEL是提供单细胞水平细胞凋亡的稳定系统，能够迅速、快捷、精确的检测出凋亡细胞。
该试剂盒可以通过测定核DNA片段检测组织切片和培养细胞的凋亡细胞。
多数高等真核生物的细胞都通过启动自身的细胞自杀程序实现程序性死亡或细胞凋亡。
凋亡在发育、内环境稳定和一些疾病中具有重要作用。
凋亡具有某些特定的形态学特征，包括细胞膜起泡，细胞核和细胞质固缩，染色质浓缩，并且不发生局部炎症反应。
细胞死亡与此相反，它的特点是细胞肿胀，染色质絮凝，细胞膜完整性破坏，细胞溶解和产生及局部炎症反应。
凋亡过程中，内源性Ca2+、Mg2+依赖性核酸内切酶被激活，DNA被降解而形成末端为3’－OH、含180～200碱基对的不同倍数的核苷酸片段。
TUNEL 可用于多种细胞凋亡的检测，已经经过验证的应用范围: Vibratome® 神经组织切片, Jurkat 细胞, HL-60细胞这本技术小册子包括检测组织切片和茴香霉素诱导的HL-60细胞的细胞凋亡。
检测原理: DeadEnd™ Colorimetric TUNEL 系统使用改良的TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)对凋亡细胞的断裂DNA进行末端标记。
使用末端脱氧核苷转移酶(TdT)将生物素标记的核苷被掺入到DNA的3′-OH末端。
然后，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin HRP)结合在上述生物素标记的核苷上，可以通过过氧化物酶的底物——过氧化氢和稳定的显色剂氨基联苯胺(DAB)检测到。
用这种程序，凋亡细胞的核被染成深棕色。
2 产品内容G7361平衡缓冲液（G327B）——4.8ml末端脱氧核苷酰酶酸转移酶（M828B）——20ul抗生物素蛋白链菌素辣根过氧化物酶（G714A）——40ul生物素化的核苷混合物（G715A）——20ul蛋白酶K（V302A）——10mgG7362塑料盖玻片（G326B）——2020X SSC（G329B）——20mlDAB 20X 色原体（G716A）——200ul20X DAB底物缓冲液（G717A）——200ul20X过氧化氢（G718A）——200ul储存条件: 将平衡缓冲液, TdT酶, 生物素标记的核苷混合物和蛋白酶K 储存于–20°C。
罗氏TUNEL使用说明书(中文)
罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序（In situ cell death detection kit-POD法）一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70％）、DAB工作液（临用前配制，5 µl 20×DAB＋1μL30％H2O2＋94 µl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5, 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
翻译好的 罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书 (2)
罗氏(R o c h e)公司T u n e l试剂盒操作说明书(Insitucelldeathdetectionkit-POD法)一、原理：TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1号（蓝盖）EnzymeSolution酶溶液：TdT10×、2号（紫盖）LabelSolution标记液：荧光素标记的dUTP1×、3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS）、ProteinaseK工作液（10-20μg/mlin10mMTris/HCl，pH7.4-8）或细胞通透液（0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase1（3000U/ml–3U/mlin50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mg/mlBSA）等。
TUNEL说明书
不适用于诊断，仅供生命科学实验使用。
仅供体外使用。
TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（标记POD）本试剂盒可标记DNA链末端，即TUNEL技术。
用于单个细胞水平凋亡（细胞程序性死亡）的免疫组织化学检测和定量分析。
光镜检测。
批号：11684817910一盒可用50次储存：-15—-25℃操作指南2006.01.1.2 试剂盒组成注意事项本品标记溶液含有二甲基砷酸盐，容易被吸入而产生毒性和导致呕吐；也含有二氯化钴，吸入后容易致癌。
因此应避免接触并遵循相关的操作说明。
使用过程中不能吃、喝和抽烟。
如果接触到皮肤，应立即用大量水冲洗干净。
如果感觉不适或者突发其它情况，应立即就医。
酶标反应应在致密的、无损坏的容器中进行，收集上清液后应标明成分。
垃圾应作为有毒废物进行处理。
注意：与先前的试剂盒/管不同，次试剂盒的酶溶解液不再含有毒的二甲砷基酸盐，因此瓶1没有毒性。
试剂盒组成请参照下表对比试剂盒组成试剂盒外自备仪器和试剂出上表所列试剂外，实验者需制备系列溶液。
下表列出了在不同实验步骤中所需要的试剂。
在每步操作前都给出了详细的说明。
2 引言2.1 产品描述实验原理在细胞凋亡过程中，基因组DNA 会断裂产生双链、低分子量的DNA 片段和高分子量的单链DNA 断端（缺口），这些DNA 链缺口可以利用酶标记核苷酸3’末端方法来识别。
应用原位细胞凋亡检测试剂盒具有准确、快速、简单、非辐射等特点，可以用来对细胞或者组织中的单个细胞进行检测并定量，因而次法被用在很多分析系统中，例如：●在基础研究和日常病理中检测冰冻和福尔马林固定的组织切片。
●在肿瘤研究和临床癌基因研究中确定某些恶性肿瘤对某种药物的敏感性。
●通过双染色操作，确定经历死亡的异常增生细胞的分型。
专一性TUNEL反应可以更好的标记通过凋亡产生的DNA链末端，因此就可以区分出凋亡与坏死，以及由抗肿瘤药物或者放射诱发的初始DNA链末端。
试验干扰假阴性：在某些形式的细胞凋亡中，DNA逃逸酶切或者不完全（37）。
tunel检测说明书
一、TUNEL试剂盒说明凯基一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法，可检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是绿色荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3'－OH末端，可用荧光显微镜检测。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被标记。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。
对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞。
本试剂盒特点●操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，只需一步染色反应，洗涤后即可观察。
●高灵敏度：可以单一检出初期的凋亡细胞。
●高特异性：能特异性染色凋亡细胞。
●快速操作：仅需约1-2个小时即可完成整体操作。
●方便观察：可使用荧光显微镜观察实验结果。
●高正确性：有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性●应用范围广：可以用于冷冻或石蜡切片中的组织细胞凋亡检测，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。
二、TUNEL试剂盒组分注意事项1．使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。
2．因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。
3．为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
4． TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
5. 用户自备：二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2、TritonX-100、柠檬酸钠、盖玻片、载玻片、染色缸。
三、操作流程概览细胞涂片、贴壁细胞爬片等细胞样本四、检测样本的预处理TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件（参照Page 10），如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。
TUNEL 凋亡染色-罗氏公司
TUNEL 凋亡染色
参照罗氏公司的TUNEL凋亡试剂盒说明书进行并适当改进
1、石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；
2、蒸馏水缓慢冲洗后室温下干燥；
3、切片置于250ml柠檬酸（0.1M，pH6.0，10.505g C6H8O7.H2O+500ml H2O）中微波加热至沸腾，静置5min后加入100ml ddH2O；
4、15min后取出切片，标本上滴上10%山羊血清（0.5%BSA），于37°C封闭15min（室温封闭45min）；
5、TUNEL试剂1和试剂2按照1:9比例充分混匀，离心，滴加至标本（试剂覆盖组织即可），37°C孵育1h；
6、PBS清洗3次，每次10min，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜摄像。
（5、6需避光操作）
7、去掉盖玻片，PBS清洗3次，每次5min；
8、滴加POD至标本，37°C孵育30min；
9、PBS清洗3次，每次5min，DAB显色；
10、苏木素复染，光学显微镜摄像。
凋亡指数（AI）计算：采用IPP随机选取5个高倍（X400）视野，计数至少1000个细胞，阳性细胞占细胞总数的百分比即为AI。
数据采用均数+/-标准差表示，采用SPSS17.0统计软件，多个样本均数比较采用ANVOA分析，以SNK-q检验进行均数间多重比较，以p<0.05有差异统计学意义。
翻译好的 罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书 (2)
罗氏(R o c h e)公司T u n e l试剂盒操作说明书(Insitucelldeathdetectionkit-POD法)一、原理：TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1号（蓝盖）EnzymeSolution酶溶液：TdT10×、2号（紫盖）LabelSolution标记液：荧光素标记的dUTP1×、3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS）、ProteinaseK工作液（10-20μg/mlin10mMTris/HCl，pH7.4-8）或细胞通透液（0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase1（3000U/ml–3U/mlin50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mg/mlBSA）等。
TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤
TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤一、试剂盒内容2.终止缓冲液：用于停止DNA链的合成反应，防止假阳性结果的产生。
3.蛋白酶K：用于溶解细胞质膜和核膜，使DNA暴露出来。
4.异硫氰酸荧光素（FITC）标记转移酶：用于检测dUTP与DNA标记的连接。
5.正控组织切片或细胞悬液：用于检验试剂盒的敏感性和特异性。
二、操作步骤1.细胞处理将要测试的细胞分成实验组和对照组，分别处理。
实验组是要测试凋亡的细胞，对照组是不会凋亡的细胞。
2.固定细胞用4%的乙醛或无氧乙醛等适当浓度的固定液固定细胞。
涂片上的细胞需要进行细胞穿孔，可以使用0.1%的Triton X-100进行细胞穿孔。
3.蛋白酶K消化将蛋白酶K溶解在PBS缓冲液中，加入溶液中胶原酶和蛋白酶蚀解，接着加入盛有细胞的离心管中。
将离心管放入37℃恒温水浴中，反应20-30分钟。
4.清洗细胞用PBS缓冲液洗涤细胞3次。
每次用PBS缓冲液冲洗细胞5分钟。
5.脱水将细胞离心，抽去PBS缓冲液，然后使用3%的过氧化氢来进行脱水。
6.TUNEL染色将细胞加入等量的TUNEL试剂液，轻轻混合后，将离心管放入37℃恒温水浴中，反应30-60分钟。
7.洗涤细胞用PBS缓冲液洗涤细胞3次。
每次用PBS缓冲液冲洗细胞5分钟。
8.反应终止使用终止缓冲液反应终止DNA链合成反应，将离心管放入室温中静置10分钟。
9.洗涤细胞用PBS缓冲液洗涤细胞3次。
每次用PBS缓冲液冲洗细胞5分钟。
10.展片与观察将细胞滴在载玻片上，并加入封片缓冲液。
在载玻片上覆盖盖玻片，用显微镜观察。
通过上述步骤，可以使用TUNEL细胞凋亡试剂盒对细胞进行凋亡分析。
该试剂盒可根据DNA末端的3'-OH羟基与终止缓冲液中标记的dUTP之间的连接，用显微镜观察细胞内是否存在凋亡现象。
荧光标记的dUTP可通过荧光显微镜直接观察，而酶标记的dUTP则需要加入相应的底物，通过酶的催化反应后可通过光学密度法或荧光显微镜来定量测定。
翻译好的 罗氏公司Tunel试剂盒操作说明方案 (2)
罗氏(R o c h e)公司T u n e l试剂盒操作说明书(Insitucelldeathdetectionkit-POD法)一、原理：TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1号（蓝盖）EnzymeSolution酶溶液：TdT10×、2号（紫盖）LabelSolution标记液：荧光素标记的dUTP1×、3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS）、ProteinaseK工作液（10-20μg/mlin10mMTris/HCl，pH7.4-8）或细胞通透液（0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase1（3000U/ml–3U/mlin50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mg/mlBSA）等。
TUNEL 凋亡染色-罗氏公司
TUNEL 凋亡染色
参照罗氏公司的TUNEL凋亡试剂盒说明书进行并适当改进
1、石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；
2、蒸馏水缓慢冲洗后室温下干燥；
3、切片置于250ml柠檬酸（0.1M，pH6.0，10.505g C6H8O7.H2O+500ml H2O）中微波加热至沸腾，静置5min后加入100ml ddH2O；
4、15min后取出切片，标本上滴上10%山羊血清（0.5%BSA），于37°C封闭15min（室温封闭45min）；
5、TUNEL试剂1和试剂2按照1:9比例充分混匀，离心，滴加至标本（试剂覆盖组织即可），37°C孵育1h；
6、PBS清洗3次，每次10min，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜摄像。
（5、6需避光操作）
7、去掉盖玻片，PBS清洗3次，每次5min；
8、滴加POD至标本，37°C孵育30min；
9、PBS清洗3次，每次5min，DAB显色；
10、苏木素复染，光学显微镜摄像。
凋亡指数（AI）计算：采用IPP随机选取5个高倍（X400）视野，计数至少1000个细胞，阳性细胞占细胞总数的百分比即为AI。
数据采用均数+/-标准差表示，采用SPSS17.0统计软件，多个样本均数比较采用ANVOA分析，以SNK-q检验进行均数间多重比较，以p<0.05有差异统计学意义。
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罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法)一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并和连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又和HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可使用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材和试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒和纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml–3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
三、实验步骤操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→和底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。
具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理4. 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的Proteinase K（400μg/mL）处理5 分钟。
其它替代方法：石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶K 处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：替代方法1: 将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液：0.1%TritonX-100 溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）替代方法2：将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于HCl PH2，胰蛋白酶0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ）替代方法3: 将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M 的柠檬酸缓冲液PH 6 的塑料盒中，置于微波炉中350W（低档）处理5 min。
5. PBS漂洗2次；6. 制备TUNEL反应混合液：处理组用50μl 1号液+450μl 2号液混匀；而阴性对照组仅加50μl 2号液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。
7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 2号液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。
8. PBS漂洗3次；9. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm）；10. 玻片干后加50μl 3号液（converter-POD）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
11. PBS漂洗3次；12. 在组织处加50~100μl DAB底物，反应15~25℃×10min；13. PBS漂洗3次；14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。
梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
15. 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200~500个细胞）并拍照。
可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）对于培养细胞的预处理：①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸，干燥后在去离子水中漂洗，干燥后4℃保存；②适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛中固定25min；④PBS浸洗二次，每次5min；⑤将吸附细胞的载玻片在0.2%的Triton X-100中处理5min；⑥PBS浸洗二次，每次5min；后续操作如同石蜡包埋切片的6-15四、注意事项1. 进行PBS 清洗时，每次清洗5 min。
2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。
3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
4. TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。
不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。
5. 如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。
6. 用甲基绿（Methyl Green）染液（3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸巴比妥PH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。
然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。
如果此时使用80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。
7. 2号液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。
8. 试剂保存；未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；3号液（converter -POD）液一旦解冻，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 m内稳定，避免再次冻存；TUNEL反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。
9. 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA 断裂或DNA 裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT 进入胞内反应，进而产生假阴性结果。
现象可能原因 建议 非特异性染色 TdT 酶的浓度过高 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀释 TdT 酶反应时间过长或TdT 酶反应过程中反应液注意控制反应时间，并确保TdT 酶反应液能常见问题的原因及推荐解决方案TdT dilution buffer ：60 mM KPB 缓冲液（pH7.2），150 mM KCl ， 1 mM 2-mercaptoethanol ， 50 % Glycerol 渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。
很好地覆盖样品。
光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本DNA 的断裂）尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂 在固定组织时样本DNA 已断裂（内源核酸酶的作用）确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定 使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液采用推荐的固定液 固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA 断裂用含有dUTP 和 dAPT 的溶液封闭 标记率低 如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能和蛋白质交联，而在操作中丢失）用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定 或福尔马林或戊二醛固定。
固定时间过长，导致交联程度过高减少固定时间，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定 荧光淬灭 Fluorescence 在普通光照10分钟就会严重淬灭，需注意避光操作促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低 1、 增加通透剂促渗时间2、增加通透剂的作用温度（15-25℃）3、优化蛋白酶K 的作用浓度和作用时间（如：以400ug/ml 作用5min ）4、0.1M 的柠檬酸钠70℃作用30min 。
荧光背景很高 支原体污染 请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染TdT 酶的浓度过高或反应时间过长 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀释或注意控制反应时间 红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。
宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA 断裂。
阳性对照没有信号 DNase I 的浓度过低 1、 冷冻切片使用3u/ml 的DNase I2、 石蜡切片使用 1500u/ml 的DNase I3、 一般样本使用10u/ml DNase I组织样本从载玻片脱落组织样本被酶从玻片消化下来 降低蛋白酶K 的处理时间。