2012级硕士研究生“微生物工程”考试要点

1、工业菌种改良的方法有哪些？

(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。

(2)增加前体物的浓度。(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。(4)抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。

2、基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性，有哪些方法，其原理是什么？

一、抗药性标志的筛选：如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr 或tetrr ，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。

二、β－半乳糖苷酶系统筛选：很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α－肽，它表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链。当宿主的细胞的β－半乳糖苷酶基因发生删除突变，缺失N－端的一段氨基酸序列，使酶失活，但在α－肽存在时可以互补使酶恢复活性。携带pUC质粒载体的大大肠杆菌在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-半乳糖苷,ITPG）的诱导下发生α－互补，可使呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷被分解产生蓝色。而重组子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal（5-溴-4-氯－3－吲哚-β-D-半乳糖苷）的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。三、菌落快速裂解鉴定法：从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有无插入片段存在，该法适于插入片段较大的重组子初筛。

四、内切酶图谱鉴定：经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶切割，释放出插入片断；对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入的方向。

五、重组DNA的鉴定

3、什么是微生物的生物转化？有什么特点？简述微生物转化的一般过程？微生物的生物转化反应定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用,使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物.最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。

微生物的生物转化特点：1、生物转化具有化学变化的单元反应多类型。由于微生物转化对甾体激素药物工业所起的重大作用，因此人们对微生物生

物转化反应的研究与其他化合物的微生物转化来比较，是研究得最为深人广泛的.微生物几乎对甾休的每个位置都能进行转化，涉及的反应类型也最为广泛；2微生物的生物转化起着立体专一性催化剂的作用.不同的化学变化单元反应类型，发生在化合物分子的不同位置。反应可在分子中通常因活性不足而不能用化学方祛生反应的位置进行。反应通常是含有几种酶的一种微生物来完成的。3.微生物的生物转化产物产率高。

微生物转化的一般过程：1、制备培养系统：选择优良的培养物，使其生活在合适的环境中，达到足够的菌体，这些菌体是生物转化反应的催化剂。2、加入底物：底物加入的时间与方法是重要的考虑因素。3、加入效应物：效应物是反应后未改变的化合物。效应物分抑制剂或激活剂。加入抑制剂，可以有效抑制副反应。这些化合物加入的时间和方法也十分重要。4、保温反应：在合适的环境条件下进行保温，直至转化反应完成。5、监测反应过程：间歇取样并监测底物与产物水平、pH、细胞量、能源和其他参数。6、终止反应：当样品分析表明产物积累停止，则移去活性细胞，停止反应。7、产物分离：生物转化的溶剂主要是水，产物在水中浓度相对较低，经过分离和纯化得到产物。

4、分解代谢物阻遏作用与环腺苷酸（cAMP）的浓度有什么关系？

分解代谢物阻遏作用与环腺苷酸（cAMP）的浓度有关。

①当存在容易利用的碳源时（如葡萄糖），cAMP浓度低→ cAMP－CRP 复合物不能形成→ cAMP－CRP复合物不与启动基因结合→RNA聚合酶不能结合到启动基因上→无法转录、翻译→不能合成酶；②当容易利用的碳源（如葡萄糖）不存在，cAMP浓度高→ cAMP－CRP复合物能形成→ cAMP－CRP复合物与启动基因结合→RNA聚合酶能结合到启动基因上→进行转录、翻译→进行酶的合成。

5、比较单级萃取、多级错流萃取、多级逆流萃取的优缺点？

单级萃取:流程简单，效率不高，增加萃取剂的用量会使产品的浓度降低，对萃取剂的处理、回收增加工作量。

多级错流萃取:溶剂分别加入各级萃取器，萃取推动力大，效果较好，仍需加入大量的溶剂，因而产品的浓度稀，需消耗多的能量回收

溶剂。

多级逆流萃取:收率高，溶媒用量少，工业上经济，普遍采用的流程。

6、论述超临界CO2萃取技术的应用前景与存在问题。

应用前景：(1)近年来，许多行业对利用超临界CO2流体萃取技术分离物质的组分进行了大量研究。在萃取设备和分析技术都有了较大的进步。在萃取成分分析方面，已采取萃取设备与GC、IR、MS、LC等联用，实现了提取、分析、质量检测一体化。能快速准确地反应出萃取物的结构、浓度和纯度。(2)所有研究都是从研究分析超临界二氧化碳萃取的主要工艺参数(压力、温度、时间、CO2流量、物料粒度)和辅助工艺措施(加入辅助溶剂、

控制温度及压力的升降方式)对萃取效果的影响，找出理想的工艺条件，对比常规物质组分分离方法，证明了该技术对某些物质分离的优越性。(3)从这些研究中可以看到，该技术在我国的研究及应用已扩展到许多行业，获得了大量研究成果和技术资料，研究水平也在不断提高。其在天然产物的深加工及中药现代化领域具有广阔的前景。

存在的主要问题：

(1) 技术理论尚不成熟，还没有公认的萃取过程的热力学模型。

(2)超临界萃取的工艺技术要求较高。

(3)由于萃取过程在高压下进行，所以对设备以及整个管路系统的耐压性能要求较高。

(4)传统的食品行业，是一个低投资的行业，而超临界萃取技术要想取得高产出，必须建成大型生产设备。

7、作为超临界CO2萃取装置中的关键设备，萃取釜和高压泵有什么特殊要求？

超临界CO2萃取装置中的关键设备（1）萃取釜：①属于高压设备；②设计、制造、材料、操作等方面要求较高；③密封结构的完善性。工业化萃取釜宜采用自紧式密封。（2）高压泵：①高压泵的作用是输送高压CO2流体并调节流量大小。要求其压力平稳，脉冲小，并能根据生产需要实现无级调速。②由于超临界CO2流体具有很强的溶解能力和渗透能力，因此须采用专用的CO2高压泵。

8、论述在什么情况下采用流加发酵方式？

为实现重组菌体的高密度和高表达培养时采用流加发酵方式。流加发酵的特点是能够调节培养环境中营养物质的浓度。一方面，可以避免某种营养成分的初始浓度过高而出现底物抑制现象；另一方面，能防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。很多重组菌体表达的物质不利于菌体自身的生长，若采用分批流加补料培养：可消除高浓度底物对细胞生长的抑制作用，还可以弥补低浓度底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控制了菌体的生长过程。

9、利用基因工程菌生产的特点是什么？论述重组大肠杆菌高密度、高表达培养的策略。

利用基因工程菌生产的特点：①基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。②基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。③基因不稳定性：生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生