第六章 补体结合反应技术

0.20
0.10
0.10
⑶操作法：按表 6-6 进行。摆 12 排反应管，由左向右加入不同稀释度的抗原 0.50ml。然后再由上向下，第一排的 9 个试管各加入 1∶10 灭能的阴性马血清 0.50ml。 第二排的 9 个试管各加入生理盐水 0.50ml。第三排至第七排试管分别加入不同稀释 度的强阳性血清 0.50ml。第八排到第十三排再分别加入不同的稀释度弱阳性血清
部分溶血
不溶血
试验中发生全部溶血的溶血素最大稀释倍数（即 1︰2 000），微溶血素的效价， 亦称一个溶血单位。做正式试验时，溶血素按二个单位稀释使用。在本例中，其使 用浓度应为 1︰1 000。
3．补体的效价测定 取健康豚鼠 3 只以上，饲喂前，每只从心脏取血 8ml～15ml， 注入培养皿内，放入 37℃温箱内 30min，取出置 4℃冰箱内，待血清析出后，吸入 离心管中，3 000r／min 离心 15min，取上清趁新鲜稀释使用。如一次采取大量补体， 可定量（1ml～2ml）分装于青霉素瓶内，置低温冰箱冻结保存。避免反复冻融。也 可从兽药厂购买冻干补体，在冰箱内可保存三年。
表 6-2 溶血素效价测定示例
稀释
溶血素
补体
血球
倍数 1 000 1 200 1 500 1 800 2 000 2 500 3 000 3 500 4 000
对照
对照
对照
溶血素 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
0.50
生理
1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
4.00
4.50
4.00
5.00
⑵血清稀释：取鼻疽强阳性血清和弱阳性血清各一份，用生理盐水按表 6-5 做成 5 种稀释液，在 60℃水浴中灭能 30min。
表 6-5 鼻疽阳性血清稀释表
稀释倍数
10
25
50
75
100
生理盐水
9.00
9.60
9.80
7.40
9.90
(ml)
血清（ml）
1.00
0.40
一个工作量抗原 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
致敏血球 结果
37℃水浴 20min
1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
部分溶血
全部溶血
1.00 不溶
补体结合反应是一种古老的血清学技术，Bordet 和 Gengou 在 1901 年设计这一 试验，由于有敏感性高和适应性广的优点，尽管操作繁杂，目前仍被有效地应用。
（一）补体及其作用特点 补体存在于哺乳动物血清中，各种动物比较，豚鼠血清中补体含量最高，成分 较全，效价稳定，采取方便，故通常将豚鼠的全血清作为补体。56℃30min 可使补 体失去活性，称为“灭能”或“非动”。 补体的作用为能与抗原—抗体复合物结合，但不能与抗原单独结合，也不易与 抗体单独结合；补体的作用没有特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合。它能 与红细胞（抗原）和溶血素（抗体）的复合物结合，引起红细胞破坏（溶血），也能 与细菌、病毒成分及其相应抗体的复合物结合。 （二）溶血反应 将红细胞多次注射于动物（如将绵羊红细胞多次免疫家兔）可使之产生相应的 抗体（溶血 素），这种抗体与红细胞结合，若有补体存在时，则红细胞被溶解，这种现象称为溶 血反应。红细胞和溶血素被称为溶血系统，常在补体结合反应中用作测定有无补体 游离存在的指示剂。 （三）补体结合反应及其原理 可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂、病毒等或者颗粒性抗原，与相应抗体结 合后，其抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能觉察。如再加入红细 胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相对应的抗原 和抗体。此反应即为补体结合反应。 补体结合反应中的抗体主要是 IgG 和 IgM。 反应的原理在于补体本身没有特异性，能与任何抗原抗体复合物结合。以检查 鼻疽病为例，先向试管中加入已知的抗原（鼻疽菌的浸出液），再加入被检马匹的血
•1•
清（抗体）和豚鼠血清（补体），这三种成分称为反应系统或溶菌系统。如果该马是
鼻疽病马，则血清中有抗鼻疽杆菌的抗体。抗原和抗体发生结合，吸附补体。如果
该马没有鼻疽病，血清中没有抗鼻疽菌的抗体，则不能形成抗原抗体复合物，不能
吸附补体，则补体游离存在。
由于许多抗原是非细胞性的，而且上述抗原、抗体和补体三种成分都是用生理
0.50 0.50 0.50
0.50 0.50
0.50
0.50
0.5
稀 释 血 清 0.50
0.50 0.50 0.50
0.50 0.50
0.50
0.50
0.50
（ml）
补体（ml）
0.50
0.50 0.50 0.50
0.50 0.50
0.50
0.50
0.50
37℃水浴 20min
致敏血
1.00
1.00 1.00
4．抗原效价测定 鼻疽补体结合反应抗原是用强毒鼻疽杆菌的混悬液，经高压 灭菌，并在冷处浸泡取其滤液制成的。鼻疽抗原可向兽药厂购买。使用时按出厂使 用说明书或标签标明的效价稀释应用。如因保存时间过久或其它原因，抗原效价可 能发生变化，使用前加以滴定。
⑴抗原稀释：用生理盐水将抗原原液作成 9 种稀释液，方法如表 6-4。 表 6-4 抗原稀释表
体过多，多余部分转向溶血系
抗体
溶血
统，发生溶血现象。又如抗原抗
素
体为非特异性，抗原抗体不结
合，不吸附补体，补体转向溶血
补体
红细 胞
溶血 素
溶血 （阴性）
系统，应完全溶血，但由于补体 过少，不能全溶，影响结果判定。 故补体量必须恰如其分。溶血素 量也有一定影响，例如阴性血 清，应完全溶血，但溶血素量少， 溶血不全，可被误认为弱阳性。
•5•
0.50ml。所有试管加入一个单位补体 0.50ml，混匀后置 37℃水浴箱 20min 取出，每 管加致敏血球 1.00ml，摇匀后，置 37℃水浴 20min，取出，观察反应结果。
表 6-6 抗原效价测定表
抗原稀
10
50
75
100
150 200
300
400
500
释倍数
抗原(ml)
0.50
另外，这些因子的用量又与其活
抗原 抗体
补体
红细 胞
溶血 素
不溶血 （阳性）
性有关：活性强，用量少；活性 弱，用量多，故在本试验之前， 必须精确测定溶血素效价、溶血 系统补体价、溶菌系统补体价 等，测定其活性以确定用量。
图 6-1 补体结合反应原理示意图
•2•
（五）补体结合反应的应用 补体结合反应是诊断人、畜传染病常用的血清学诊断方法之一。本法不仅可用 于诊断传染病，如鼻疽、牛肺疫、马传染性贫血、乙型脑炎、布氏杆菌病、钩端螺 旋体病、血锥虫病等，也可用于鉴定病原体，如对马流行性乙型脑炎病毒的鉴定和 口蹄疫病毒的定型等。
1.50
1.50
2.00
盐水
1:20
0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
—
0.50
—
补体
2.50％ 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
0.50
0.50
0.50
红细胞
37℃水浴 20min
结果
全部溶血
测定和使用补体时，按表 6-3 进行。 表 6-3 补体效价测定表
试管号
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
对照
1︰20 补体
0.10 0.13 0.16 0.19 0.22 0.25 0.28 0.31 0.34 0.37 0.40
—
生理盐水
0.90 0.87 0.84 0.81 0.78 0.75 0.72 0.69 0.66 0.63 0.60 1.00
表 6-1 溶血素稀释表
稀释倍数 1︰100 溶血素 生理盐水 全量
1 000 0.10 0.90 1.00
1 200 0.10 1.10 1.20
1 500 0.10 1.40 1.50
1 800 0.10 1.70 1.80
2 000 0.10 1.90 2.00
2 500 0.10 2.40 2.50
9.60g
蒸馏水
1 200ml
溶液配好后，高压（10 磅）灭菌 10min，也可通过蔡氏滤器灭菌。溶液盛于瓶
内，将绵羊血直接采入瓶内，血量应大致与阿氏液量相等。摇匀，置冰箱中保存，
可保存 3 周左右。
用时将血液移入离心管内，加 3～5 倍量生理盐水，离心沉淀洗涤三次，每次 2
000r／min，离心 10min，然后去掉上清液，血球泥用生理盐水配成 2.50％液应用。
3 000 0.10 2.90 3.00
3 500 0.10 3.40 3.50
4 000 0.10 3.90 4.00
•3•
另取小反应管一列，按次序从每一稀释液取 0.50ml 分别加入各管中，添加时应 由稀释度大的稀释液加起，这样可不必更换吸管。然后再加入生理盐水 1.00ml，1 ︰20 补体和 2.50％红细胞悬液各 0.50ml。在 37℃水浴槽中放 20min 后判定结果。详 细操作程序见表 6-2。
1.00
1.00 1.00 1.00
1.00
1.00
球（ml）
37℃水浴 20min
抗原效价测定的结果根据溶血百分数来判定 表 6-7 抗原效价测定结果示例
抗原稀释 10 50 75 100 150 200 300 400 500
阳 1:10
盐水或缓冲盐水稀释的比较透明的液体，所以补体不论是否被结合，都不能直接看
到，故无法判定。
因此，在反应系统的三种成分作用一定时间之后，再向其中添加指示系统—绵
羊红细胞和特异性抗体溶血素。如果抗原和病马血清中抗体特异性结合，吸附补体，
没有游离补体存在，加入指示系统，因无补体参加，不发生溶血，这种情况称为补
体结合反应阳性，即该马患有鼻疽病；反之，则该马未患鼻疽病。
(四) 补体结合反应的特点
补体结合反应操作繁杂，且需十分细致，反应的各个因子的量必须有恰当的
待测系统
溶血系统
比例。特别是补体和溶血素的用
量。补体的用量必须恰如其分，
红细
例如：抗原抗体呈特异性结合，
补体 胞
溶血
吸附补体，本应不溶血，但因补
（阴性)
2．溶血素效价测定 溶血素是用绵羊红细胞，经多次免疫家兔，抽取家兔血清，
加入甘油而成。在冰箱中可保存二年以上。每隔两、三个月测定效价一次。溶血素
可从生物制品厂购买。
溶血素效价测定的方法：先将溶血素稀释成 100 倍，即 0.20ml 的溶血素（溶血 素实量含 0.10ml）加入 9.80ml 生理盐水混合即可。然后按表 6—1 配成稀释液：
第六章 补体结合反应技术
（Complement fixation reaction technique）
一、 概况
可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂质和病毒等，与相应抗体结合后，抗原抗 体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入红细胞和溶血素，即 可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相应的抗原或抗体。这个反应 就是补体结合反应。
效价测完后，按下列计算原补体在使用时应稀释的倍数。 0.50／0.25×20.0＝40.00
即此补体应作 1︰40 稀释使用，每管加入 0.50ml，此即为 1 个单位补体。考虑 到补体性质不稳定，在操作过程中效价会降低，故此使用浓度比原效价大 10.00％左 右较为适宜。因此，本批补体应用 1︰36 稀释使用，每管加入 0.50ml。
二、 经典补体结合反应（以马鼻疽补反为例）
（一）预备试验
1．绵羊红细胞悬浮液的制备 通常用公绵羊红细胞，将绵羊血液采集于带有玻 璃珠的无菌容器中，充分振摇，使脱去纤维，此时血液失去凝固性，称脱纤血。
亦可用阿氏液保存血液，阿氏液配方如下：
葡萄糖
24.60g
氯化钠
5.04g
柠檬酸钠（含 2 个分子结晶水）
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
稀释倍数
10
50
75
100
150
200
300
400
500
生理盐水（ml）
9.00
4.00
6.50
13.5
1.50
2.00
3.00
3.00
4.00
抗原（ml）
1.00
1.00
1.00
1.50
3.00
2.00
1.50
1.00
百度文库
1.00
实存量（ml）
6.50
5.00
7.50
6.50
4.50
•4•
补体效价测完后，按表添加各种成分。所用的致敏血球是将 2 单位溶血素和 2.50 ％红细胞液等量混合后，置 37℃水浴中 15min，即成为致敏血球。
在 2 单位溶血素的存在下，能使 0.50ml 的 2.50％红细胞完全溶血的最小补体量， 即为该补体的效价。在本例中，补体效价为 1:20 稀释液 0.25ml。