蛋白裂解液(参考资料)

蛋白质的定位与蛋白质裂解液的选择：

全细胞：NP-40或RIPA

细胞质（可溶）：Tris-HCl

细胞质（细胞骨架）：Tris-Triton

细胞膜：NP-40或RIPA

细胞核：RIPA

线粒体：RIPA

RIPA裂解液配方

RIPA buffer 最终浓度

1M Tris-HCl (pH7.5) 5 ml 50mM

NaCl 0.87g 0.15 M

Na-deoxycholale 0.1g （0.1%）

0.5M EDTA(pH8.0) 0.8ml

NaF 41 mg

Nonidet P40 1 ml （1%）

Aprotinin10μg/μl100μl10μg/ml

加水到100ml

Aprotinin 10μg/μl ；用10mM HEPES-KOH（PH8.0）溶解，备用。

●Nonidet P-40简称NP-40，乙基苯基聚乙二醇,常用非离子性去垢剂。

●Na-deoxycholale，脱氧胆酸钠，离子型去垢剂。离子型去垢剂主要作用有：裂解细胞；溶解蛋白，尤其是可以溶解一些难溶于水的蛋白，如膜蛋白等；很适合做WB，但在Co-IP中使用，需要谨慎。

●亮抑霉肽（Leupeptin）：抑制丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、纤溶酶、猪胰激肽原酶）和半胱氨酸蛋白酶（包括木瓜蛋白酶和组织蛋白酶B）

●抑肽素A（Pepstatin A）抑制各种天门冬氨酸蛋白酶，例如组织蛋白酶D、肾素、胃蛋白酶、细菌天门冬氨酸蛋白酶和HIV蛋白酶；

●胰凝乳蛋白酶抑制剂（Chymostatin）抑制具有糜蛋白酶类特异性丝氨酸蛋白酶（包括糜蛋白酶、胃促胰酶、组织蛋白酶G）和大多数丝氨酸蛋白酶（包括组织蛋白酶B，H，L）

●抗木瓜蛋白酶（Antipain）抑制木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和纤溶酶。

●氟化钠抑制酸性磷酸酶

●正钒酸钠：抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶（tyrosine phosphatase）

●焦磷酸钠（sodium pyrophosphate）：抑制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶（serine－threonine phosphatase）。

在与蛋白相关的检测中，首先最关键的一步便是蛋白质的提取。蛋白质的提取过程中，我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。另外在磷酸化蛋白的研究过程中，磷酸酶抑制剂也是必不可少的，本文总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF，Leupeptin 亮肽素，Aprotinin 抑肽酶，Pepstatin胃蛋白酶抑制剂，EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠，Na3VO4 原矾酸钠，BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠，Na2P2O4 焦磷酸钠等。对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制，贮存液与工作液浓度，保存都做了详细的说明。

蛋白酶抑制剂

PMSF：

特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶（可逆的地面处理）。

溶解性：溶于异丙醇，乙醇，甲醇和丙二醇果>10mg/ml。在水溶液中不稳定。在100%异丙醇，+25℃时稳定至少9个月

分子量：174.2

使用：贮存浓度：200mM，工作浓度：1mM

Leupeptin 亮肽素

特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，纤溶酶，和组织蛋白酶B

溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。4℃一周稳定,分成小份冷冻在-20℃至少6个月

分子量：C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4:475.6

C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 x H2O:493.6

使用：贮存浓度：1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)

Aprotinin抑肽酶

特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶，激肽释放酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶的高活性。不抑制凝血酶或因子X。

溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如，tris，0.1M，pH8.0）。pH约7-8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。

分子量：6,512

使用：贮存浓度:1mg/ml, 工作浓度：0.06–2.0 ug/ml(0.01–0.3 uM)

Pepstatin胃蛋白酶抑制剂

特性：抑制天冬氨酸（酸）蛋白酶如胃蛋白酶，肾素，组织蛋白酶D，凝乳酶，许多微生物酸性蛋白酶

溶解性：溶于甲醇约1mg/ml；可溶于乙醇，过夜溶解可达到1 mg/ml；在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml。4℃稳定一周，分装储存于-20℃时可保存1个月

分子量：685.9

使用：贮存浓度：1mg/ml，使用浓度：0.7 μg/ml(1 μM)

EDTA-Na2

特性：金属蛋白酶抑制剂

溶解性：溶于水至0.5M，在pH8-9的条件下，4℃稳定至少6个月

分子量: 372.24

使用：工作浓度：0.2–0.5 mg/ml(0.5–1.3 mM)，不需现用现配，在溶液pH值调至8-9时再加入。

磷酸酶抑制剂

NaF氟化钠

溶解性：溶于水

分子量：41.99

使用：贮存液：5M 工作浓度：10-20mM

Na3VO4原矾酸钠

分子量：183.91

溶解性：溶于水，我们购买过来的是原矾酸钠.原矾酸钠需要经过处理以后才能成为激活的矾酸钠,激活的矾酸钠才具有抑制去磷酸化的作用.原矾酸钠变成激活的矾酸钠的过程是:

100mM原矾酸钠激活储存液配制

(1).取0.183克的原矾酸钠溶解于10ml的双蒸水中,加酸调节PH至10(颜色变黄)

(2).煮至无色

(3).室温冷却

(4).重调PH至10

(5)重复（１）（２）（３）（４）直至溶液保持无色，并且ＰＨ稳定于10,分装100ul/管,每10ml 裂解液加一管.(终浓度为1mM),-20度保存.

使用：贮存液：100mM 工作浓度：1mM

BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠

溶解性：溶于水

分子量：306.11

使用：贮存液：100mM 工作浓度：25mM

Na2P2O4焦磷酸钠

溶解性：溶于水

分子量：265.9

贮存液：100mM, 工作浓度：1-2 mM

SDS ，NP-40 ，TritonX-100这三种去垢剂的作用是不同的，或者说作用力量强弱不同。SDS属于离子型去垢剂，最厉害，基本可以把细胞完全破掉，DNA会释放出来，裂解液变得很粘稠。

NP-40是很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。

TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间，偏向于NP40，也是常用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用（SDS基本会使蛋白变性失活）。

Brij Buffer I

Tris-HCl (1M, pH 7.5) 1 millilitre (ml)

EDTA (0.5 M) 0.4 millilitre (ml)

NaCl (5M) 3 millilitre (ml)

Brji 96 (10%) 8.75 millilitre (ml)

NP40 (10%) 1.25 millilitre (ml)

ddH2O to 100 millilitre (ml)