细胞培养的必备设施、常用器材

一、细胞培养的必备设施
（一）无菌实验室 防止微生物污染和有害因素的影响 工作环境清洁、空气清新、干燥和
无烟尘。
（二）超净工作台
（三）恒温培养箱 变通电热恒温培养箱 CO2培养箱
(四)其他设备 倒置显微镜 电热鼓风干燥箱 电子天平 恒温水浴箱 离心机 压力蒸汽消毒器 液氮储存罐
（三）血清
血清必须贮存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃， 请勿超过一个月。
一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。 若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养 基内一起过滤，勿直接过滤血清。
瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): 20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶 后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装40～ 45 ml。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度 改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。
二、 灭菌
实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖， 高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置 于oven 中烘干。
实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌 170℃, 4 小时。
吸管、培养瓶、手术器械等置饭盒内高 压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置于 oven 中烘干。
（3）使用液（1×）配法
取母液甲和母液乙各一份，加双蒸水18份，以 115℃高压灭菌25分钟(以免葡萄糖破坏)，置 室温后4℃保存
（二）培养基（维持液、营养液）
目前常用的基础培养液均已商品化，如 RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可 根据培养需求合理选择，主要成分是氨 基酸、维生素、碳水化合物、无机离子 及其他一些辅助物质。
（三）橡皮器材（各种瓶或试管的塞子、 盖子）
5%NaOH煮，水洗，4%盐酸煮，水洗 8~10次，单蒸水洗三次、二蒸水洗一次。
（四）金属器材（剪刀、镊子、手术刀、 解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各 种型号针头等）
纸擦去表面的油脂，洗衣粉煮沸，或用 1%碳酸氢钠煮沸15分钟，水洗， 95% 酒精纱布擦干，包装灭菌������
8.77g
加去离子水或双蒸水至1000mL 乙液：0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液
磷酸二氢钠(无水) 2.4g 氯化钠 8.77g
加去离子水或双蒸水至1000mL 甲、乙液于4℃保存，使用时按比例配制
成所需pH浓度，高压灭菌后室温保存。
Hanks液 (1)母液甲(20x)配法 ① NaCl(A.R) 160g
对细胞附壁有利
保护作用解除毒性物质对细胞的毒性作 用；免受冻存，搅拌，损伤
其他：利于染色体分布良好
（二）其他溶液 pH调节液: 消化液: trypsin-EDTA （0.25%） 抗生素溶液 0.5%台盼兰(Trypan blue)液
司徒镇强
灭活（heat-inactivation）
是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之 血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此 热处理之目的是使血清中之补体成份 (complement) 去活化。除非必须，一般 不建议作此热处理。
血清对细胞的作用
提供细胞增殖所必须的生长因子（A因 子促进；B、C因子对细胞有抑制生长作 用；D因子促进细胞粘连）
（一）玻璃器材的消毒处理方法 清洁液（或用2%磷酸三钠或用洁消精）
浸泡 自来水冲数次，洗净，烤干 烤干干净玻璃器皿在酸缸 (洗液:浓硫酸+
高锰酸钾)浸泡24h以上 自来水冲数次，洗净后分别用一次与二次
去离子水冲洗干净 烤干，包装
（二）塑料器材的消毒处理方法
用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜（单 用或交叉处理），水洗，单蒸水，三蒸 水浸泡过夜，凉干，紫外线或辐射灭菌
粉末培养基配制(以1 升为例)：
取粉末培养基溶于800 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶 解。
称取适量之NaHCO3 粉末溶于水中，搅拌使其溶 解
混后溶液之pH 应为7.2-7.4，pH 试纸检测。若为太 碱，可再通入CO2 气体调整pH。（培养基以真空 帮浦通过过滤膜时，pH 会升高0.1-0.2）补水至900 ml。
酶标仪
第三节 细胞培养常用器材 和培养基
一、பைடு நூலகம்用器材
（一）玻璃器材 培养皿 滴流瓶 刻度吸管、离心管等 培养瓶 烧杯、量筒等 三角烧瓶
普通螺口瓶
螺口刻度血清瓶
中间螺口刻度离心管
（二）金属器材
二、细胞培养常用器材清洗方法
液体用10 % 蒸汽高压灭菌121 ℃, 15 lb, 20 分钟处理。
三、常用溶液、培养液及其配制
（一）平衡盐溶液 称量要准确 物质的纯度 物质的可溶性 物质的不稳定性 贮存液
磷酸盐缓冲液（PBS）
甲液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液 磷酸氢二钠(无水) 28.4g 氯化钠
细胞培养器械、用液的配制和消毒
本次课内容
掌握无菌操作 细胞培养常用实验器材（玻璃器皿、橡胶制品、
正负压除菌滤器、塑料制品）的清洗要领、清洗 步骤和注意事项。 掌握细胞培养常用器材的包装要领和要求 了解灭菌方法，掌握高压湿热灭菌方法及操作注 意事项。 掌握培养液的灭菌方法操作注意事项。
KCl(A.R) 8g MgSO4.7H2O（A.R) 2g
MgCl.6H2O(A.R) 2g 依次溶于800mL双蒸水中，前一物质溶后再 加后一种。 ②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL双蒸水中，溶时 不断搅拌（此液应单配，单溶）。 混合上述两溶液双蒸水补至1000mL，向其中 加2mL氯仿作为防腐剂，置4℃保存。
以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至 无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮 存于4℃。(血清亦可加入培养基中一起过滤)
液体培养基贮存于4℃ 冰箱，避免光照， 实验进行前放在37℃ 水槽中温热。
液体培养基(加血清) 存放期为六个月， 期间glutamine 可能会分解，若细胞生长 不佳，可以再添加适量glutamine。
(2)母液乙(20×)配法
① Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g
KH2PO4(A.R) 1.20g
葡萄糖(A.R) 20.0g
溶于800ml双蒸水中。
②0.4%酚红液0.4g酚红放在玻璃研钵后加 0.01 N NaOH 11.28mL，加水至100mL，过滤
用双蒸水补至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐 剂，置4℃保存。