流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制PPT演示课件

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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
5
4
3
2
1
0
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4w
12w
24w
10例患者治疗期间平均VL的变化情况
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12
提示
虽然CD4+T细胞计数是监测HIV病程的评价工具，但是 单独的CD4+T细胞数减少不是HIV感染的诊断检验。其它的 免疫缺陷状况也可以有辅助性T-淋巴细胞数量减少的结果:
- 丙球蛋白缺乏症 - 胸腺发育不全 (DiGeorge氏综合症) - 严重的联合免疫缺陷
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CD4 T cells/ml
Infection Seroconversion
HAART
CD4 T cell depletion
1000
Death
500
200 0 2-6 weeks
Flu-like Disease
mean of 10 years
Asymptomatic phase
Symptomatic phase AIDS
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CD4+ T细胞计数的方法
非FCM 技术
FCM 技术
优点
-简单 -低廉
缺点
-低通量 -难于质控
优点
-自动化方法 -可靠性高(变异系数低) -精密度、准确度和可重复性高 -高通量 -金标准技术
缺点
-设备昂贵 -试剂昂贵 - 需要熟练技术人员操作
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仪器的选择
1、中央级、省级、研究所、高校、医院：流式细胞 仪（ FACSCalibur、Coulter)
C2
B3
C3
CD4<200/ul和/或出现艾滋病指针性症状（如卡氏肺囊虫肺炎 等）时，就可定义为进入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。
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判断HIV感染者发生临床合并症的可能性并进行预防
CD4计数（/ul）
主要机会性感染的预防
任意值 <200 <100 <75
<50
结核（皮试阳性） PCP
弓形体病（抗体阳性）
MAC CMV（抗体阳性或血培养）隐球菌病
组织胞浆菌病球孢子菌病
《艾滋病诊断与治疗指导方案》（试行，2002年）
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确定抗HIV药物治疗开展的时机及进行疗效评价
病程
CD4+T淋巴细 胞
病毒载量
建议
症状期
任何值
任何值
治疗
无症状期
CD4+T细胞 <200/mm3
任何值
治疗
无症状期
CD4+T细胞 >200/mm3，但
价格：3美元/人份
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流式细胞术（flow cytometry, FCM）
流式细胞仪
BD-Calibur
BD FACSVantage
对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选
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●FCM的特点
保持细胞及细胞器或微粒的结构及功 能不被破坏
从分子水平获取多种信号 对细胞进行定量分析或纯化分选
2、地区级及示范区：专门的流式细胞计数仪 （ FACSCount、Guava)
3、现场及乡镇卫生院：（手工方法：如 Dynabeads） 4、除此之外，在不具备CD4检测的实验室，WHO建议
用总淋巴细胞来代替。（当总淋巴细胞小于 1000/ul时，强烈预示CD4细胞小于200 /ul。
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非流式细胞技术
免疫聚合磁珠 Dynabeads （利用光镜和免 疫荧光染色）
细胞球 Cytosphere （利用计数板和光镜）
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Dynabeads技术计数CD4细胞
原理 用抗CD4单克隆抗体(mAbs)包被的磁化粒子捕获与分 离全血中CD4T淋巴细胞
方法 将125ml新鲜血液，放入EDTA管，加350mlPBS，再加 入25ml mAbs磁化悬浮粒子，在摇床(Dynal Mechnical Rotator) 上置室温10分钟混和，以便去掉血液中的单核 细胞。磁化粒子用专门的磁性浓度计分离，并用PBS 洗涤2次，加入50ml Lysing溶液，着色，用 epifluorescent显微镜计数。
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成人及青少年艾滋病分期标准（CDC，美国，1993年）
临床阶段
CD4+T细胞 A 无症状或急性HIV感 染或持续性全身淋巴结 肿大
B 出现症状， 不是A或C
C 艾滋病指针性症 状
>500/ul （≥29%）
A1
200-499/ul （14-28%）
A2
<200/ul （<14%）
A3
B1
C1
B2
维持具有枢纽的功能。 CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞。
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HIV通过多种直接和间接的病理机制导致CD4+T细 胞数量的缺失，最终引起感染者免疫功能缺陷。
HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病作用 感染细胞-未感染细胞形成合胞体 程序性细胞死亡 自身免疫机制 特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用
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功能特点
（1）多参数定量分析每一个细胞；
（2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。
CD4绝对计数的原理、方法和 质量控制
张子宁 卫生部艾滋病免疫学重点实验室
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HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义
淋巴细胞
B淋巴细胞 CD19+
T淋巴细胞 CD3+
NK细胞 CD3-CD16+56+
T辅助/诱导细胞 CD3+CD4+
T抑制/细胞毒性细胞 CD3+CD8+
2
淋巴细胞在免疫应答中起核心作用。 CD4+T淋巴细胞对细胞免疫和体液免疫平衡的
<350/mm3
>30000（bDNA）或 >55000(RT-PCR)
建议治疗。另外还要根据 CD4+T细胞下降率和患者的 愿望
无症状期
CD4+T细胞 >350/mm3
<30000（bDNA）或 建议延迟治疗观察。未经治 <55000(RT-PCR) 疗者3年发展至AIDS<15%.
《艾滋病诊断与治疗指导方案》（试行，2002年）
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C D 4 ¸Ï û° ýÊ £¨ ö¸ / u l ©£
VL log copies/ml
350
333
300
309
250
266
200
150
165
100
50
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HIV感染后CD4+、CD8+T细胞变化
CD4+T细胞（Th细胞）绝对计数持续减少 CD8+T细胞（Ts细胞）增高，到疾病晚期时下降 T细胞亚群比例倒置，CD4/ CD8 <1.0 CD4+细胞功能受损
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外周血中CD4+T淋巴细胞的数量是HIV感染疾病分期、 预测疾病进程、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方 案以及评价治疗效果的实验室标准指标。