抗人CD138单克隆抗体以及重组双特异性抗体的开发及应用_陈丹

多聚体蛋 白 聚 糖(syndecan-1, CD138)属 于 黏 附 分子整合素跨膜黏结蛋白聚糖家族成员，它主要分布 于内皮细胞、上皮细胞、纤维母细胞、角质细胞表面， 通过其分子表面的硫酸肝素侧链可结合一系列配基， 如细胞黏附分子、基质成分、生长因子、酶和酶抑制物 等，以共受体（cell surface co-receptors）方式调节细胞 与微环境之间的相互作用，参与组织器官分化发育、 血管形成、组织再生等一系列生理过程的调节，与细 胞的增殖、黏附、迁移相关。 其可溶性 syndecan-1 分 子在组织损伤修复中可作为碱性纤维母细胞生长因 子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的拮抗剂或激 动剂[4]，参与损伤修复过程，同时也具有抑制肿瘤细胞 增殖的作用。 随着研究的深入，人们发现 syndecan-1 分子的表达在控制恶性肿瘤细胞生长和转移等过程 中具有重要作用，而且可作为判断肿瘤预后的指标[5]， 对指导临床诊断与免疫治疗具有重要意义[6-9]。
块，造成多发性肿瘤的问题，即称为“多 发性骨髓瘤 ” （multiple myeloma, MM）。 骨髓瘤肿瘤年发生率大约 为 4/100 000。 而男性患者远多于女性患者，黑人患骨 髓瘤的机率是白人的 2 倍以上[1]。 导致骨髓瘤发生的 因素较多，例如遗传、辐射或化学物接触等。 目前市场上 已 有 bortezomib [2]，PEGylated liposomal doxorubicin [3] 等药物用于治疗多发性骨髓瘤，且免疫调节药物 （IMiD）来 那 度 胺 联 合 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 硼 替 佐 米 和 地 塞米松可有效治疗骨髓瘤。 硼替佐米和来那度胺可 杀伤骨髓瘤细胞并克服其对传统治疗的耐药。 但多
分子克隆构建重组抗体，Protein A 纯化，综合运用 Western blot （WB）、Flow cytometry （FC）、ELISA 等实验方法进行相关的功能验
证。 结果 鼠源的 CD138 单克隆抗体特异性强，可用于后续重组抗体的制备，而且重组的抗人 CD138 单克隆抗体经流式验证，同
样可以与表达 CD138 的肿瘤细胞系（RPMI-8226，U266）进行结合，且不与 CD138-的肿瘤细胞系（Jurkat）结合，在此基础上构建的
双特异性抗体经功能验证，可以激活 T 细胞，从而对 CD138+的细胞系进行特异杀伤。 结论 基于鼠源单克隆抗体重组构建表达的
双特异性抗体 anti-CD138×CD3 具有靶向杀伤骨髓瘤细胞的生物活性，为细胞免疫治疗骨髓瘤疾病提供了临床研究基础。
抗人 CD138 单克隆抗体以及重组双特异性抗体的开发及应用
陈 丹，邹建炫，宗云辉，孟会敏，安刚力，杨 林*
[摘 要] 目的 制备鼠源抗人 CD138 单克隆抗体，经 Western blot 验证后，利用其基因序列构建重组抗人 CD138 抗体以及一种
能够同时靶向 CD138 分子和 CD3 分子的双特异性抗体并对其功能进行验证。 方法 通过杂交瘤技术获得鼠源抗人 CD138 抗体，
本文旨在制备鼠源的抗人 CD138 单克隆抗体， 构建重 组 的 抗 人 CD138 抗 体 ， 以 及 能 够 同 时 靶 向 CD138 及 CD3 分子的双特异性抗体， 此双特异性抗 体能够通过 CD3 分子激活 T 细胞， 从而有效的杀伤 CD138+的肿瘤细胞。 体外实验的有效杀伤给我们提 供了一个良好的初期结果，为后续研究多发性骨髓 瘤的免疫治疗打下夯实的基础，同时也为我们研究其 他有特异靶标分子的肿瘤免疫治疗提供了一个新的 思路。
基金项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 （81272476 ） ； 江 苏 省 科 技 支 撑 计 划 （BE2010649, BE2011682） 作者单位：215000，苏州大学唐仲英血液学研究中心 血液学协同创新 中心（陈 丹，邹建炫，宗云辉，孟会敏，安刚力，杨 林）；215000，百奇生 物科技（苏州）有限公司（邹建炫） * 通信作者：杨 林，Tel：512-65880877；E-mail：yanglin@
[关键词] 多发性骨髓瘤； CD138； 重组抗体
[中图分类号] R392.12
[文献标识码] A
Development and application of mouse anti-CD138 monoclonal antibodies and its recombinant bispeicific antibodies format
的小鼠，对其提取脾脏细胞，与骨髓瘤细胞融合，形成 杂交瘤细胞；将杂交瘤细胞在 HAT 培养基中培养，对 ELISA 检测呈阳性的单克隆细胞进行 ELISA 复筛 ， 再进行 WB 复筛，对 WB 阳性细胞进行亚克隆，经过 2 次亚克隆，筛选出能够稳定分泌抗体的单克隆细 胞 [10]；亚 克 隆 方 法 选 用 梯 度 稀 释 法 ； 通 过 亚 型 检 测 试 剂盒鉴定单克隆细胞的亚型类型，再将鉴定合格的阳 性的单克隆细胞注射到小鼠体内进行腹水生产，将产 生 的 腹 水 通 过 Protein A 层 析 纯 化 后 得 到 抗 CD138 单克隆抗体。 1.4 重组双特异性抗体（anti-CD138 & anti-CD3） 的 制 备 提 取 特 异 性 抗 CD138 单 克 隆 细 胞 的 总 RNA，获得 mRNA，以其为模板 ，反转录得到 cDNA， 最后克隆合成得到抗 CD138 单克隆抗体重链可变区 和轻链可变区， 经测序鉴定正确后， 基因合成 antiCD138 ScFv；接下来我们将 OKT-3 ScFv, anti-CD138 ScFv 构建到 pFuse-hIgG1-Fc1 载体上， 其中 OKT-3 ScFv 5’端和 3’端分别设计有 NcoⅠ和 BamHⅠ酶切 位 点 ，anti-CD138 ScFv 5’ 端 和 3’ 端 分 别 设 计 有 BamHⅠ和 BglⅡ酶切位点， 将获得的质粒转染 293T 细胞，收集的上清用蛋白 A 亲和柱进行纯化。 1.5 PBMC 提取 取健康成年人外周血，利用 FicollPaque Plus 进行 800 g 离心分离 30 min。 取其中的雾 状层，600 g 离心洗涤去除血小板以及其他 杂质，计 数，用于后续试验[11]。 1.6 免疫印迹（Western blotting, WB）分析 收集高 表达 CD138 的骨髓瘤细胞 U266， 肝癌细胞 HepG2， 蛋白裂解液冰上裂解 30 min，离心取上清，BSA 法测 定上清蛋白质量浓度，加入 loading buffer，10% SDSPAGE，120 V 凝胶电泳 90 min， 转膜 400 mA，90 min。 5%脱脂牛奶室温封闭 1 h，anti-CD138 抗体 4 ℃孵育 过 夜 ，PBST （ 含 0.1%Tween-20 的 PBS） 洗 涤 3 次 ， HRP-羊抗鼠 IgG（H+L）二抗室温孵育 1 h，PBST 洗涤 3 次，ECL 法显影，曝光 2 min。 1.7 流式细胞术（flow cytometry, FC）分析 收集高 表达 CD138 的细胞 U266， RPMI-8226 以 及 阴 性 对 照 Jurkat 细胞系，4%多聚甲醛室温固定 20 min，PBS 配制的 3% BSA 封闭液中室温放置 30 min，用重组抗 体 （1 μg/ml） 室 温 孵 育 1 h，PBST 离 心 洗 涤 2 次 ， FITC-羊抗人 IgG （H+L） 二抗避光共孵育 1 h，PBST 离心洗涤 3 次，去掉未结合上的荧光二抗，流式细胞 仪检测 CD138 阳性率。 1.8 ELISA 分析 重组人 CD138 蛋白 以 1.25 μg/ml 包被于 ELISA 孔板中，4 ℃孵育过夜，PBS 配制的3% BSA 封 闭 液 中 室 温 放 置 30 min， 用 抗 CD138 单 克
免疫学杂志 2015 年 1 月 第 31 卷 第 1 期 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 31 No. 1 Jan. 2015
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·论 著·
[文章编号]1000-8861（2015）01-0007-05； [DOI]10.13431/ki.immunol.j.20150002
1 材料与方法
1.1 细胞系及 PBMC 实验相关细胞系均购自于美 国 ATCC 公司。 健康成人 PBMC 来源于苏州独墅湖 高教区医院的志愿者。 1.2 细胞培养 多发性骨髓瘤细胞系 RPMI-8226 置 于 含 10% FBS 的 IMDM 培 养 基 中 进 行 培 养 ，20% FBS 的 1640 培养基用于培养 U266 骨髓瘤细胞 ，另 外，慢性髓性细胞系白血病 K562 以及 T 细胞白血病 细胞 Jurkat 均于 10% FBS 的 1640 培养基中进行培 养 ， 人 类 肝 癌 细 胞 系 HepG2 培 养 于 10% FBS 的 DMEM 中，培养环境条件：5% CO2，37 ℃。 1.3 抗 CD138 单克隆抗体的制备 用骨髓瘤肿瘤细 胞或 CD138 真核重组蛋白抗原分别免疫雌性健康的 Balb/c 小鼠，挑选出血清 ELISA、WB、FC 检测呈阳性
CHEN Dan1, ZOU Jianxuan1,2, ZONG Yunhui1, MENG Huimin1, AN Gangli1, YANG Lin1, * 1. Cyrus Tang Hematology Center & Collaborative Innovation Center of Hematology, Soochow University, Suzhou 215000, China; 2. Abgent (Suzhou) Biotechnology CO., LTD, Suzhou 215000, China *Corresponding Author: YANG Lin, E-mail: yanglin@
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