实验十二 薄层色谱法分离染料混合物

实验十二薄层色谱法分离染料混合物【实验目的】

1. 掌握薄层色谱法(TLC)的基本原理、薄板制作和Rf的计算方法。

2. 熟悉薄层色谱法的应用。

【实验原理】

薄层色谱法是将固定相均匀地涂布于玻璃板、铝箔或塑料板上，形成薄层而进行色谱分析的方法。

薄层色谱法（层析法）根据层析原理分为二大类：

吸附层析：利用被分离物质在吸附剂上被吸附能力不同，用洗脱液使组分分离，如硅胶G、氧化铝薄层层析。

分配层析：利用被分离物质在两相中分配系数不同使组分分离。如微晶纤维素层析、纸层析等。

本次实验我们主要讨论吸附薄层色谱法薄层色谱法。

常用的有吸附薄层色谱法，即将吸附剂（固定相，如硅胶）均匀地铺在光滑的薄板（常用玻璃板）上，然后将混合组分试样溶液点在薄层板的一端，在密闭的容器中用适当的展开剂（流动相，如苯、石油醚乙酸乙酯混合物）展开。此时混合组分不断地被吸附剂吸附，又被展开剂所溶解而解吸，且随之向前移动。由于吸附剂对各组分具有不同的吸附能力，展开剂对各组分的溶解、解吸能力也不相同，即各组分在同一色谱系中的分配系数不同。当展开剂在不断展开的过程中，各组分在两相间不断地吸附-解吸-再吸附-再解吸，从而达到分离的目的。

各组分展开后效果图如下：

图4-28 平面色谱示意图

样品展开后各组分在薄板上的位置用比移值（R f ）表示，即展开后各组分的R f 值不同，其计算公式为：

原点到溶剂点到溶剂前原点到斑点中心的距离

f R

在相同条件下，相同物质的R f 是一定的，因而比移值R f 可以进行物质的定性分析。还可用于定量分析：如刮下有色斑点，将被测物浸出后用比色法测定含量，或用薄层扫描仪直接测出被测物含量。

本实验将二甲黄、苏丹Ⅲ混合液滴加于薄层板上，用苯展开至距起始线15 cm 左右，则分成不同颜色的2个斑点，展开时间需50～60 min 。

【仪器与试剂】

色谱缸1个、玻璃板(10cm×20cm) 2块、乳钵1个、平口毛细管数根、直尺和铅笔（自备）、干燥器。

硅胶G 、石油醚、乙酸乙酯。

染料混合物：称取二甲基黄、苏丹Ⅲ各40 mg ，加纯的无水乙醇溶解后，于100 mL 容量瓶中稀释至刻度，摇匀，即得。

0.3%羧甲基纤维素钠（CMC-Na ）：称取CMC-Na 0.30 g ，加蒸馏水100 mL ，加热使其溶解，放置，澄清备用。

【实验步骤】

1. 制备薄层板 在乳钵中加入0.3%CMC-Na 水溶液14～16 mL ，将5 g 250目以下的硅胶G 慢慢洒入溶液中，调成均匀的糊状，将此糊状物倒在洁净的玻璃板上（玻璃板表面不能有指纹、油迹、水迹），利用糊状物的流动性，振动玻璃板，使其均匀分布于整块玻璃板上，平放晾干。要求薄层板各部位的厚度均匀一致，表面平整，无划痕，少气泡，牢固性好。

2． 活化 将晾干后的薄层板放入烘箱中，缓慢升温至105 ℃，恒温活化30～60 min ，取出，稍冷后置于干燥器中备用。

3． 点样 在距玻璃板一端2 cm 处用铅笔轻轻划一直线作为起始线，在起始线上用铅笔做一标记“×”，用毛细管蘸取染料混合物，手握毛细管与玻璃板

垂直，在做标记的地方进行点样，待溶剂挥发干后，再点样1～2次，其样点直径不能超过2 mm。注意毛细管不能将薄层板表面弄破，斑点间距为1cm。

4．展开层析缸需预先用展开剂饱和：在层析缸中加入展开剂石油醚:乙酸乙酯=15:1 45mL左右，盖上毛玻璃盖，密封缸顶，使系统平衡，约需15 min。然后将点好样品的薄层板放入层析缸的展开剂中，点样端朝下，浸入展开剂中（切勿将样点浸入展开剂中），密封层析缸盖，待展开至规定距离(一般为10～15 cm)，大概需时间50～60 min。取出薄层板，立即用铅笔划出前沿线，待展开剂挥发后用铅笔划出各斑点中心。

5．计算R f值用直尺量出原点至展开剂前沿的距离和原点至每个斑点中心的距离，分别计算出每个斑点的R f值。

【注意事项】

1．玻璃板要干净、干燥，取用时只能接触玻璃板边缘。

2．在薄层板上画起始线时，手指不得接触吸附剂表面

3. 点样时用力要均匀，不能在薄层板上点出洞穴。

4．点样时点要细，直径不要大于2mm，间隔1cm以上，浓度不可过大，以免出现拖尾、混杂现象。

5．将展开剂倒入层析缸后要用毛玻璃片盖住缸口，使展开剂蒸气饱和。

6．将薄层板取出时，要及时标出前沿线，否则无法计算R f值。

【思考题】

1．薄层板为什么要活化？怎样活化？活化后的薄层板应如何保存？

2．有A、B两瓶无标签的试剂，如何用薄层色谱法分析它们是否是同一化合物？

3．影响Rf值的主要因素有哪些？

（长沙医学院王翠琼）