抗体制备类型和工艺
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Ø
鞭毛抗原
Ø寄生虫体抗原:虫卵
血细胞抗原制备
细菌抗原制备: 多用液体或固体纯培养 物,经集菌后处理。
寄生虫和真菌抗原制备: 除用破碎法加 工粗提外,大多要加以适当纯化。
二、可溶性抗原
(一)组织和细胞可溶性抗原的粗提 Ø 1.组织细胞抗原的制备:
Ø 高速捣碎法-组织捣碎机捣碎 Ø 研磨法-用玻璃匀浆器或乳钵研磨
弗氏佐剂(Freund,s adjuvant): 弗氏完全佐剂-羊毛脂 与液体石蜡的混合物 弗氏完全佐剂-弗氏不 完全佐剂加卡介苗
乳化方法: 研磨法和搅拌混合法
弗氏佐剂(Freund adjuvant) 液体石蜡 + 羊毛脂 混合 弗氏不完全佐剂
抗原
卡介苗
完全乳化 加热 备用高 灭压 菌 弗氏完全佐剂
方法
差速离心
梯度密度离心
2.选择性沉淀法: 核酸去除法-氯化锰、鱼精蛋白 盐析法-硫酸铵、硫酸钠 有机溶剂沉淀法-乙醇、丙酮 聚合物沉淀法-聚乙二醇
盐析沉淀法
原理:利用各种蛋白质在不同浓度的盐溶液 中有不同的溶解度。
优点:方便、有效、不影响蛋白质活性 应用: 抗原的初筛
提取丙种球蛋白 抗原的浓缩
②作用条件温和; ③内含物成分不易受到破坏;
④细胞壁损坏的程度可以控制。
(3)反复冻融法
原理:因突然冷冻,细胞内冰晶的形成及胞 内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。
方法:将待破碎的细胞置冰箱内冻结,然后 置室温融化,如此反复两次,大部分组织细 胞及细胞内的颗粒可被融破。
特点:此法适用于组织细胞。
羧甲基纤维素 聚乙烯吡咯烷酮
2、半抗原与载体的连接方法
①物理方法 ②化学方法
碳化二亚胺法:
半抗原+载体 蛋白质
人工免疫原
混合
搅拌1-2h
R-
室温24h
NH透=C析H除-R去’未反应 的半抗原
戊二醛法:
半抗Байду номын сангаас-NH2
OHC-(CH2)3-CHO
混合
载体蛋白NH2
半抗原-N=CH-
(CH2)3-CH=NH-载 体蛋白
白蛋白 IgM IgG
Sephadex G-200凝胶
4. 离子交换层析法
原理: 利用带电离子基团的纤维素或凝胶,吸
附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋 白质的等电点不同,所带电荷不同,与纤 维素结合的能力有差别。
交联葡萄糖 琼脂糖
聚丙烯酰胺
离子交换 常用离子
纤维素
交换剂
离子化 细粉
交联树脂
★(三)免疫球蛋白片段的制备:
1. 解离二硫键 2. 溴化氰裂解法 3. 酶裂解法
三、半抗原
半抗原(无免疫原性)多肽、多糖、甾族激
+
素、脂肪胺、类脂质 、核苷、某些药物以
载体
及其他化学物品等。
完全抗原(具免疫原性)
机体 抗体/致敏淋巴细胞
1、载体的选择
①蛋白质:牛血清白蛋白、人血清白蛋白、 兔血 清白蛋白、牛甲状腺球蛋白 ②多肽聚合物:多聚赖氨酸 ③大分子聚合物:
5.亲和层析法
是利用生物大分子的生物学特异性, 即生物分子间所具有的专一性亲和力而 设计的层析技术。 特点:纯化效率高,速度快,有时仅一 步即可达到纯化目的。
★亲和层析支持物的选择: ①非特异性吸附低; ②液体流速快; ③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定; ④有合适丰富的化学基团 ⑤有丰富的微,以增加结合容量。
☆戊二醛是常用的带有两个活性基团的 双功能联接剂☆
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂(immunoadjuvant): 预先或与抗原同时注入体内,可
增强机体对该抗原的免疫应答或改 变免疫应答的类型的物质称为免疫 佐剂,简称佐剂(adjuvant)。
一、佐剂的种类
化合物 生物制剂
人体的佐剂:氢氧化铝、明矾、poly I∶C、胞壁酰二肽、细胞因子、热休 克蛋白 动物的佐剂:弗氏佐剂
水溶性非离子型聚合物沉淀法
常用的聚合物: 聚乙二醇(PEG)、硫酸葡聚糖
应用: 3%-4% PEG沉淀免疫复合物 6%-7% PEG沉淀IgM 8%-12% PEG沉淀IgG 12%-15% PEG沉淀其他球蛋白 25% PEG沉淀白蛋白
3. 凝胶层析法
样品溶液缓慢流经凝胶柱时,大分子短 时间内被洗脱出来;小分子物质缓慢地流 出分子筛柱;通过凝胶的分子筛作用,大、 中、小三类分子彼此间较易分开。 特点:简单易行,但掌握不好,分离效果 较差。
抗体制备类型和工艺
教学目的
掌握:颗粒性抗原的制备、可溶性抗原的 制备
熟悉:可溶性抗原的纯化--盐析法
第一节 免疫原的制备
免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体 并能与抗体发生反应的物质。
免疫原:颗粒性抗原 可溶性抗原 半抗原性免疫原
一、颗粒性抗原
Ø细胞抗原:绵羊红细胞
Ø细菌抗原:菌体抗原
(4)表面活性剂处理法
原理: 在适当的温度、pH及低离子强度的条件下, 表面活性剂能与脂蛋白形成微泡,使膜的渗透 性改变或使之溶解。
应用: ①破碎细菌,且作用比较温和 ②提取核酸时,常用此法破碎细胞
(二)可溶性抗原的提取和纯化
1.超速离心法: Ø 差速离心法-低速和高速交替进行 Ø 密度梯度离心法-区带离心法
组织和细胞成分混合抗原制备程序
所用材料必须是新鲜或低温保存的 去除包
洗去血迹 及污物
脏器进行灌洗
NS内含0.5g/L
膜或结 缔组织
NaN3
冷浴中组织剪碎
装入捣碎机筒内高速 粉碎制成组织匀浆液
上清液 澄清
去除细胞碎片 及微小组织
3000r/ min×10min
离心 取上清液
2.细胞可溶性抗原的破碎
Ø (1) 超声破碎法 Ø (2)酶处理法 Ø (3)反复冻融法 Ø (4)表面活性剂处理法
(1)超声破碎法
原理:利用超声波的机械振动而使细胞破碎 特点:①操作简单,重复性较好,节省时间
②多用于微生物和组织细胞的破碎
(2)酶处理法
常用酶类:溶菌酶(碱性环境) 方法:EDTA--革兰氏阴性菌细胞壁 特点:①此法适用多种微生物;
★配体的选择条件: ①抗原或抗体必须单一特异性; ②抗原与抗体具有较高的亲和力; ③配体必须有一个适当的化学基团。
★抗原或抗体与支持物的结合: ①活化:溴化氰; ②接“手臂”:带“手臂”琼脂糖有氨
基琼脂糖、羧基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖、 重氮盐衍生物琼脂糖、疏基琼脂糖。
★亲和层析条件的选择: ①封闭活性基团 ②除去未结合和结合不牢的蛋白 解脱剂: 3mol/L 硫氰酸钾(或钠)、 0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液