荧光定量PCR检测技术ppt课件
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荧光定量PCR工作原理及应用PPT课件
灵敏度高
由于采用了荧光信号，荧 光定量PCR具有较高的灵 敏度，能够检测低拷贝数 的基因表达。
重复性好
通过标准化和内参基因的 校正，荧光定量PCR具有 较好的重复性，结果可靠。
突变检测
检测范围广
荧光定量PCR可以检测各 种类型的基因突变，包括 点突变、插入和缺失等。
高通量
通过多重PCR和阵列技术， 可以对多个基因位点进行 高通量突变筛查。
准确性高
由于采用了实时监测和荧 光信号，荧光定量PCR能 够提高突变检测的准确性。
病原体检测与鉴定
快速准确
荧光定量PCR能够快速准确地检 测和鉴定病原体，为临床诊断和
治疗提供依据。
高灵敏度
对病原体进行特异性扩增后，荧 光定量PCR能够检测出极低浓度
的病原体。
鉴别分型
通过荧光标记的特异性探针，可 以对病原体进行分型和鉴别，有 助于了解疾病传播和流行病学调
特点
高灵敏度、高特异性、可定量分 析、可自动化等。
发展历程
01
02
03
04
1996年
美国PE-Cetus公司推出第一 台商业化荧光定量PCR仪。
1997年
ABI公司推出TaqMan荧光探 针技术。
2000年
实时荧光定量PCR技术开始广 泛应用于临床诊断和科研领域
。
2004年
数字PCR技术问世，实现了单 分子水平的检测。
荧光定量pcr工作原理及应 用ppt课件
目录
• 荧光定量PCR技术概述 • 荧光定量PCR工作原理 • 荧光定量PCR的应用 • 荧光定量PCR的优缺点 • 荧光定量PCR的未来发展
01
荧光定量PCR技术概述定义与特点 Nhomakorabea定义
荧光定量PCR原理及操作步骤ppt课件
参比荧光：管家荧光ROX
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
ROX校正效果
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
未结合SYBR Green 1 dye
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
SYBR Green I 应用范围
• 起始模板浓度定量
• 融解曲线分析
– ---可区分单一产物、变异产物、多种产物和（ 或）引物二聚体
模板
443.45 ng/ul
17.738 ng/ul
2♂
模板
686.75 ng/ul
26.47 ng/ul
①actin ③achi ⑤aly ②actin ④achi ⑥aly
⑦vlg ⑧vlg
⑨stat ⑩stat
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
定量PCR反应体系
模板cDNA Tag mixture 引物1 引物2 H20
4ul 10ul 0.5ul 0.5ul 5ul
①③⑤⑦⑨ ②④⑥⑧⑩
1♀
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
ROX校正效果
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
未结合SYBR Green 1 dye
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
SYBR Green I 应用范围
• 起始模板浓度定量
• 融解曲线分析
– ---可区分单一产物、变异产物、多种产物和（ 或）引物二聚体
模板
443.45 ng/ul
17.738 ng/ul
2♂
模板
686.75 ng/ul
26.47 ng/ul
①actin ③achi ⑤aly ②actin ④achi ⑥aly
⑦vlg ⑧vlg
⑨stat ⑩stat
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
定量PCR反应体系
模板cDNA Tag mixture 引物1 引物2 H20
4ul 10ul 0.5ul 0.5ul 5ul
①③⑤⑦⑨ ②④⑥⑧⑩
1♀
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
实时荧光定量PCR技术全面分析ppt课件
定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终 精确的对起始模板的定量分析
4
常规vs实时
优缺点比较 定量PCR
常规PCR
灵敏度高 高精确度 安全省时
只能进行半定量或定性 分析 不安全易污染 费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增 长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解
59
定量PCR的新 运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析
61
62
相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别
内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因 （内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的 误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合 信号 结果不准确
理想的PCR反应： 非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适 合光源激发，发射出荧光，反映产物 浓度
4
常规vs实时
优缺点比较 定量PCR
常规PCR
灵敏度高 高精确度 安全省时
只能进行半定量或定性 分析 不安全易污染 费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增 长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解
59
定量PCR的新 运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析
61
62
相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别
内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因 （内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的 误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合 信号 结果不准确
理想的PCR反应： 非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适 合光源激发，发射出荧光，反映产物 浓度
荧光定量PCR原理及操作步骤.课件
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荧光定量PCR的原理
• 在PCR反应过程中，随着DNA的扩增，荧光染料或荧光探针会 与新合成的DNA结合，产生荧光信号。荧光信号的积累与DNA 的扩增数量呈线性关系，通过荧光信号的实时监测，可以精确 地计算出起始模板的浓度。
荧光定量PCR的应用
• 荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体 检测和基因分型等领域。通过实时监测PCR反应进程，可以 精确定量目标基因的表达水平，检测基因突变，以及鉴定病 原体种类和基因型等。
实验结果解读注意事项
数据解读与处理
荧光定量PCR实验产生的数据需要进行解读和处理。实验人员应熟悉数据分析方 法，正确解读实验结果，避免因数据处理不当导致误判。
结果报告与交流
荧光定量PCR实验结果应按照相关规定进行报告和交流。实验人员应确保结果的 准确性和可靠性，避免因结果报告不准确导致误导或决策失误。同时，实验人员 还应与其他相关人员进行有效沟通，共同探讨实验结果和问题解决方案。
案例二：突变检测
总结词
荧光定量PCR是突变检测的有效手段，能够快速准确地检测DNA序列中的点突变、插入或缺失。
详细描述
针对目标基因的特定区域，设计包含突变信息的引物或探针，通过荧光定量PCR扩增后，利用熔解曲 线或高分辨率溶解分析等技术，判断是否存在突变。这种方法在遗传性疾病诊断、癌症研究等方面具 有重要应用。
解决方案3
对于引物二聚体问题，可以通过优化引物设计、 降低引物浓度等方法来解决。
建议3
在实验前对引物进行充分的评估和验证，避免使 用易形成二聚体的引物。
问题解决方案及建议
解决方案4
对于假阳性结果问题，可以通过 增加重复实验次数、设置阴性对 照等方法来避免。
PPT荧光定量PCR(共31张PPT)
➢ 3’端标记有荧光淬灭集团（Quencher，Q） ➢ 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发
荧光
➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光标记物的选择
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本 的量，绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的 拷贝数或浓度
以不同稀释度的标准品为模板进行定量PCR并获得对应的CT，即可制作 标准曲线
25
y = -3.2461x + 26.443
20
R2 = 0.9976
15
E=103.2647%
10
5
0
0
2
4
6
8
以lg（CT）为纵坐标，lg（拷贝数）为横坐标，绘制标准曲线 扩增效率（E）= （10-1/斜率-1） × 100% 相关系数（R2）应大于0.99，越接近1越好 E应介于95%与105%，越接近100%越好
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到荧光域值时所需的循环数。
✓ 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，
CT值越小
✓ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可 从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数
非特异性荧光标记 ➢ SYBR Green I
❖ 引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡 结构
❖ 跨越内含子设计引物
❖ Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出 1000 bp以下的非目的产物
方法
优点
缺点
适用范围
绝对定量
定量准确
工作量较大， 需额外绘制目 标基因的标准 曲线
所有
相对定量
荧光
➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光标记物的选择
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本 的量，绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的 拷贝数或浓度
以不同稀释度的标准品为模板进行定量PCR并获得对应的CT，即可制作 标准曲线
25
y = -3.2461x + 26.443
20
R2 = 0.9976
15
E=103.2647%
10
5
0
0
2
4
6
8
以lg（CT）为纵坐标，lg（拷贝数）为横坐标，绘制标准曲线 扩增效率（E）= （10-1/斜率-1） × 100% 相关系数（R2）应大于0.99，越接近1越好 E应介于95%与105%，越接近100%越好
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到荧光域值时所需的循环数。
✓ 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，
CT值越小
✓ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可 从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数
非特异性荧光标记 ➢ SYBR Green I
❖ 引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡 结构
❖ 跨越内含子设计引物
❖ Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出 1000 bp以下的非目的产物
方法
优点
缺点
适用范围
绝对定量
定量准确
工作量较大， 需额外绘制目 标基因的标准 曲线
所有
相对定量
荧光定量PCR基础原理ppt课件
荧光定量PCR基础原理
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探针完整时，汇报基团发射荧光信号被近距离淬灭基 团吸收；伴随PCR进行，Taq酶在链延伸过程中碰到与 模板结合探针， 其5‘－3’外切酶活性将探针酶切降解 ，使汇报荧光基团和淬灭荧光基团分离，游离于反应 体系中，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。
荧光定量PCR基础原理
荧光定量PCR基础原理
11/39
普通PCR技术检测模式
普通PCR仪器扩增， 约2.5小时
琼脂糖凝胶电泳， 约1小时
阴性
无法定量
样品检测结果
阳性
EB染色，约20分钟 紫外成像
荧光定量PCR基础原理
12/39
实时荧光定量PCR检测模式
荧光定量PCR仪器扩 增，约2小时
光滑S型指数曲线， 阳性
检测过程有实时监测 数据
Hybprobe探针和水解探针均基于 FRET （荧光共振能 量传递）原理设计。
荧光定量PCR基础原理
31/39
TaqMan探针法-水解探针
PCR扩增时在加入一对引物同时加入一个特异性荧光 探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在 两条引物之间。
TaqMan探针为一寡核苷酸，包含两个分子标识，探针 5′端标识有荧光汇报基团(Reporter, R)，如FAM、VIC 等，3′端标识有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如 TAMRA等。
绝对定量
病原载量定量
GMO成份评定
残留DNA测定
相对定量
基因表示差异比较
治疗伎俩效果评定
荧光定量PCR基础原理
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荧光定量PCR基础原理
39/39
荧光定量PCR基础原理
25/39
SYBR Green I荧光染料作用原理
荧光定量PCRPPT课件
仪器设备
确保PCR仪、荧光检测器 等设备正常运行，并按照 实验要求进行参数设置。
实验设计
根据研究目的和样本特性， 设计合理的荧光定量PCR 实验方案。
样本处理
样本收集
采集具有代表性的样本， 并妥善保存以备后续实验。
样本处理
将样本进行适当的处理， 如细胞分离、DNA/RNA 提取等，以获得足够的核 酸模板。
荧光信号检测
在PCR循环过程中，实时监测荧光 信号的变化，收集数据以供后续分 析。
结果分析
数据处理
结果应用
对荧光定量PCR实验数据进行处理， 如阈值设定、循环阈值（Ct值）计算 等。
将荧光定量PCR实验结果应用于后续 的研究或实际应用中，如基因表达分 析、病原体检测等。
结果解读
根据实验目的和预期结果，对荧光定 量PCR实验结果进行解读，并评估其 可靠性。
02
该技术利用荧光染料或荧光探针 标记特异性检测目标，通过荧光 信号的累积和检测，实现对目标 序列的实时定量分析。
荧光定量PCR技术的原理
在PCR反应过程中，随着DNA 的合成，荧光染料或荧光探针与
DNA结合，产生荧光信号。
随着DNA的扩增，荧光信号也 相应增强，通过实时监测荧光信 号的变化，可以计算出目标序列
基因突变检测
总结词
荧光定量PCR技术可用于检测基因突变，通过对基因序列的变异进行分析，有助于遗传性疾病的诊断、药物疗效 评估和个性化治疗。
详细描述
荧光定量PCR能够高特异性地检测基因序列的变异，包括点突变、插入和缺失等。通过比较正常组织和病变组织 的基因突变差异，有助于了解疾病的发生和发展机制，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。同时，基因突变检 测还可用于药物疗效评估和个性化治疗方案的制定。
荧光定量PCR的原理及其应用PPT课件
操作复杂
荧光定量PCR的操作过程相对复杂， 需要专业人员进行操作。
荧光染料和探针的干扰
荧光染料和探针有时会对PCR扩增产 生干扰，影响结果的准确性。
样本中存在抑制剂的可能性
某些样本中可能存在PCR抑制剂，影 响荧光定量PCR的检测结果。
05 荧光定量PCR的发展前景
技术改进与优化
01
02
03
高效多重检测
合成新的DNA链。
的DNA链结合，产生荧
光信号，通过检测荧光
信号的积累，可以实时
监测DNA的扩增过程。
02 荧光定量PCR的种类
SYBR Green I法
原理
SYBR Green I是一种荧光染料，可以与双链DNA结合并发出荧光信号。在PCR扩增过程 中，随着DNA的合成，SYBR Green I荧光信号会逐渐增强，通过监测荧光信号的增强程 度可以实时监测DNA的合成。
通过荧光定量PCR技术，可以检测肿瘤组织中特定基因的 表达水平，从而评估肿瘤的恶性程度、转移风险和预后情 况。
在传染性疾病诊断中的应用
传染性疾病的病原微生物种类繁多，荧光定量PCR技术可以用于快速检测和鉴定 病原微生物，为传染性疾病的诊断提供准确依据。
通过荧光定量PCR技术，可以检测出病原微生物的核酸序列，从而确定传染性疾 病的病原体类型、感染部位和传播途径。
结合微流体技术和数字 PCR技术，实现单分子检 测，提高检测的灵敏度和 分辨率。
纳米材料增强
利用纳米材料增强荧光信 号，降低背景噪声，提高 检测的信噪比。
基因编辑技术
结合基因编辑技术，对基 因组进行定点编辑和改造， 为疾病治疗和基因治疗提 供新手段。
未来发展方向与展望
临床应用拓展
实时荧光定量PCR技术ppt课件
斜率与扩增效率
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
荧光定量PCR化学原理
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个
2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率：
2 –ΔΔCT=表达量的比值
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
平台PCR仪介绍
ABI 7500 fபைடு நூலகம்st
特征：
使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直
观
ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差
（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光
性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性
（如孔间、批间温度的波动）
Rn= Normalization = Reporter / Referenc
基因在不同组织中的表达差异
药物疗效考核
耐药性研究
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
《荧光定量PCR》幻灯片PPT
根据未 • 知样品的c 值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。
质粒 • DNA和体外转录的RNA常作为绝对定量的标准品。相对
定量指 • 的是在一定样本中靶基因相对于另一参照基因的量的变
化。
实时荧光定量PCR技术的原理及 应用
(Real time Quantitative PCR)
原理
• 其定量的根本原理是在 PCR 反响体系中参加非 特异性的荧光染料〔如： SYBR GREEN I 〕或特 异性的荧光探针〔如： Taqman 探针〕，实时 检测荧光量的变化，获得不同样品到达一定的 荧光信号〔阈值〕时所需的循环次数： CT 值 〔 Cycle Threshold 〕；
•
当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸〔DNA或
RNA〕序列通过氢键严密相连，随后，未被杂交的多余探针被
洗去。最后，根据方法来判断样品中是否，或者何位置含有被测
序列〔即与探针互补的序列〕。
探针设计原那么
• 1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。理论 上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。 2. Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确 保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃，这样可保证探针在退火时 先于引物与目的片段结合。 3. 确保探针中GC含量在30-80%。 4. 防止探针中多个重复的碱基出现，尤其是要防止4个或超过4个的G 碱基 5. 探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连 时， 也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。 6. Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条 链上的 上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一 个碱基。 7. 防止探针与引物之间形成二级构造。 8. 对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的 中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。
质粒 • DNA和体外转录的RNA常作为绝对定量的标准品。相对
定量指 • 的是在一定样本中靶基因相对于另一参照基因的量的变
化。
实时荧光定量PCR技术的原理及 应用
(Real time Quantitative PCR)
原理
• 其定量的根本原理是在 PCR 反响体系中参加非 特异性的荧光染料〔如： SYBR GREEN I 〕或特 异性的荧光探针〔如： Taqman 探针〕，实时 检测荧光量的变化，获得不同样品到达一定的 荧光信号〔阈值〕时所需的循环次数： CT 值 〔 Cycle Threshold 〕；
•
当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸〔DNA或
RNA〕序列通过氢键严密相连，随后，未被杂交的多余探针被
洗去。最后，根据方法来判断样品中是否，或者何位置含有被测
序列〔即与探针互补的序列〕。
探针设计原那么
• 1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。理论 上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。 2. Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确 保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃，这样可保证探针在退火时 先于引物与目的片段结合。 3. 确保探针中GC含量在30-80%。 4. 防止探针中多个重复的碱基出现，尤其是要防止4个或超过4个的G 碱基 5. 探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连 时， 也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。 6. Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条 链上的 上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一 个碱基。 7. 防止探针与引物之间形成二级构造。 8. 对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的 中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。
实时荧光定量PCR技术原理ppt课件
样本处理与RNA提取
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
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未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
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Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
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研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起 始拷贝数越多，Ct值越小。
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13
实时荧光定量
Ct 18 and Ct 22, 2^(4 Ct shift) = 16 fold difference
;
14
实时荧光定量PCR原理
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数 的对数，纵坐标代Ct值。因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上 计算出该样品的起始拷贝数。
;
22
（一）选择靶基因
TaqMan技术主要用于检测，所以其扩增的基因必须是特异的，如： 某种病原微生物所共有的保守基因
（检测某种病原微生物）； 某个血清型所特有的基因序列
（区分检测某个血清型）； 选择决定毒力强弱的基因
（区分强毒和弱毒）等。
;
23
（二）选择探针
选择探针需要同时满足以下条件： 1、在靶基因的保守区域 2、G+C含量在40%以上； 3、相同碱基连续不超过4个； 4、Tm值在71±2℃;
以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 （baseline），荧光域值 的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
;
9
实时荧光定量PCR原理
如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值 循环数（Ct）。
;
24
（二）选择探针
5、内部自身配对较少； 6、5’端不为G； 7、G数目比C数目少；
如果6和7难以满足的时候，就要考虑用互补序列作探针。
;
25
（三）选择引物
探针选好之后，在探针的上下游分别选择合适的引物序列，引物应满足如下的条 件:
1、在靶基因保守和无二级结构的区域； 2、与探针所在区域不重叠；
Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。
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10
什么是C(t)值
பைடு நூலகம்
C(t) Threshold（域值）
;
11
为什么要引入C(t)值
96 replicates of B7 gene molecular beacon Ct ;
Endpoi 12
实时荧光定量PCR原理
上游引物
TaqMan检测技术 原理示意图
荧 完好探针 光
荧 光 淬
物
灭
质
物
质
模板负链
DNA合成
探针水解，释放荧光
;
20
Donor dye (Repo rter)
TaqMan® 探针
Accepto r(hQedruy)eenc未探结针合的
Lig ht
Ta q
Lig ht
Energy transfer
;
26
（三）选择引物
3、与靶基因其他区域配对较少； 4、G+C含量在40%以上； 5、相同碱基连续不超过4个； 6、Tm值比探针Tm值低10±1℃;
;
27
（三）选择引物
7、探针与两条引物之间的各种组合形成的二聚体都较少，特别是引物3’端与探针 配对很少；
光发射或者以热量形 式散失
探针、引物与目的片段结 合，FRET
Light Emission
Ta
Taq 水解探针，报告荧光素与淬灭
q
荧光素分离
;
21
TaqMan检测技术的设计
与普通PCR的设计基本相同，区别在于引物与探针的设计一般需要特定的软件， 如美国ABI公司开发的Primer Express软件。
;
4
实时荧光定量PCR原理
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加， 最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。
在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产 物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。
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5
利用电泳定量
;
7
实时荧光定量PCR原理
在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进 入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。
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8
实时荧光定量PCR原理
为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设 定一定荧光信号的域值（threshold）。
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15
标准曲线
如何定量 未知样品的C(t) 值
定量
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16
荧光化学
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。 荧光探针：TaqMan荧光探针 荧光染料：SYBR荧光染料
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17
一、TaqMan检测技术原理
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡 核苷酸，与扩增片断内部某一段系列相同或互补，两端分别标记一个报告荧光 基团和一个淬灭荧光基团。
;
18
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’ －3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光 监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现 了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
;
19
PCR扩增前 PCR扩增时
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2
是一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合的定量PCR方法。 PCR的高效扩增特性 核酸探针的高特异性 光谱技术的高灵敏性和可计量性
;
3
实时荧光定量PCR
定义 利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控
目的 对起始模板进行定量
优点 灵敏，重复性，动态范围宽，高通量
原理 Ct 值与起始模板浓度的对数成比例
11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference
;
6
实时荧光定量PCR原理
在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分 析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘 制成一条曲线。
荧光定量PCR检测技术 （FQ-PCR, Fluorescence quantitative PCR）
;
1
实时荧光定量PCR技术
所谓real-time FQ-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的 方法。
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实时荧光定量
Ct 18 and Ct 22, 2^(4 Ct shift) = 16 fold difference
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实时荧光定量PCR原理
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数 的对数，纵坐标代Ct值。因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上 计算出该样品的起始拷贝数。
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（一）选择靶基因
TaqMan技术主要用于检测，所以其扩增的基因必须是特异的，如： 某种病原微生物所共有的保守基因
（检测某种病原微生物）； 某个血清型所特有的基因序列
（区分检测某个血清型）； 选择决定毒力强弱的基因
（区分强毒和弱毒）等。
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（二）选择探针
选择探针需要同时满足以下条件： 1、在靶基因的保守区域 2、G+C含量在40%以上； 3、相同碱基连续不超过4个； 4、Tm值在71±2℃;
以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 （baseline），荧光域值 的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
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实时荧光定量PCR原理
如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值 循环数（Ct）。
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（二）选择探针
5、内部自身配对较少； 6、5’端不为G； 7、G数目比C数目少；
如果6和7难以满足的时候，就要考虑用互补序列作探针。
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（三）选择引物
探针选好之后，在探针的上下游分别选择合适的引物序列，引物应满足如下的条 件:
1、在靶基因保守和无二级结构的区域； 2、与探针所在区域不重叠；
Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。
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什么是C(t)值
பைடு நூலகம்
C(t) Threshold（域值）
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为什么要引入C(t)值
96 replicates of B7 gene molecular beacon Ct ;
Endpoi 12
实时荧光定量PCR原理
上游引物
TaqMan检测技术 原理示意图
荧 完好探针 光
荧 光 淬
物
灭
质
物
质
模板负链
DNA合成
探针水解，释放荧光
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Donor dye (Repo rter)
TaqMan® 探针
Accepto r(hQedruy)eenc未探结针合的
Lig ht
Ta q
Lig ht
Energy transfer
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（三）选择引物
3、与靶基因其他区域配对较少； 4、G+C含量在40%以上； 5、相同碱基连续不超过4个； 6、Tm值比探针Tm值低10±1℃;
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（三）选择引物
7、探针与两条引物之间的各种组合形成的二聚体都较少，特别是引物3’端与探针 配对很少；
光发射或者以热量形 式散失
探针、引物与目的片段结 合，FRET
Light Emission
Ta
Taq 水解探针，报告荧光素与淬灭
q
荧光素分离
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TaqMan检测技术的设计
与普通PCR的设计基本相同，区别在于引物与探针的设计一般需要特定的软件， 如美国ABI公司开发的Primer Express软件。
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实时荧光定量PCR原理
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加， 最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。
在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产 物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。
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利用电泳定量
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实时荧光定量PCR原理
在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进 入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。
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实时荧光定量PCR原理
为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设 定一定荧光信号的域值（threshold）。
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标准曲线
如何定量 未知样品的C(t) 值
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荧光化学
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。 荧光探针：TaqMan荧光探针 荧光染料：SYBR荧光染料
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一、TaqMan检测技术原理
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡 核苷酸，与扩增片断内部某一段系列相同或互补，两端分别标记一个报告荧光 基团和一个淬灭荧光基团。
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探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’ －3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光 监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现 了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
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PCR扩增前 PCR扩增时
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是一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合的定量PCR方法。 PCR的高效扩增特性 核酸探针的高特异性 光谱技术的高灵敏性和可计量性
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3
实时荧光定量PCR
定义 利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控
目的 对起始模板进行定量
优点 灵敏，重复性，动态范围宽，高通量
原理 Ct 值与起始模板浓度的对数成比例
11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference
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实时荧光定量PCR原理
在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分 析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘 制成一条曲线。
荧光定量PCR检测技术 （FQ-PCR, Fluorescence quantitative PCR）
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实时荧光定量PCR技术
所谓real-time FQ-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的 方法。