滴定法测定棒酸发酵液中甘油含量

第27卷第3期河北工业科技

V ol.27,No.32010年5月

H ebei Jour nal of Industr ial Science and T echno log y

M ay 2010

文章编号:1008 1534(2010)03 0189 03

滴定法测定棒酸发酵液中甘油含量

康 辉,刘桂军,孙凤卿,赵 霞

(石药集团河北中润制药有限公司,河北石家庄 050041)

摘 要:为了消除发酵液中还原糖的影响,建立了高碘酸钠滴定法测定棒酸发酵液中甘油含量的方法,该方法的回收率为98.5%,RSD 值为1.69%。本法操作简便,成本低廉,适用于发酵液中甘油含量的测定。

关键词:棒酸发酵液;滴定法;甘油;含量中图分类号:T Q460.7 文献标志码:A

Determination of glycerol content in clavulanic

acid fermentation broth by titration

KANG H ui,LIU Gui jun,SU N Feng qing,ZH AO Xia

(Hebei Zhong run P har maceutical Company L imited,Shijiazhuang Phar maceutical Gr oup,Shijiazhuang Hebei 050041,China)

Abstract:T he met ho d fo r the deter minatio n o f glycero l co ntent in the clavulanic acid ferment ation bro th by so dium per iodate

titr ation is established so as to eliminate the infect ion of reducing sug ar in the bro th.T he averag e recover y r ate is 98.5%,and RSD is 1.69%.T he method is convenient and accurate with low cost.It can be applied t o the deter minatio n of g lycer ol content in the fer mentat ion broth.

Key words:clavulanic acid fermentatio n bro th;titration;g ly cer ol;content 收稿日期:2010 01 14;修回日期:2010 03 16责任编辑:张士莹

基金项目:国家 十一五 科技支撑计划项目(20007BAI26B00)作者简介:康 辉(1975 ),女,河北石家庄人,工程师,主要从事抗生素研发方面的工作。

棒酸是由棒状链霉菌代谢产生的一种 内酰胺酶抑制剂,与 内酰胺类抗生素连用对产生 内酰胺酶的耐药菌有抑制作用,因具有抑制 内酰胺酶的作用,所以棒酸具有可观的医用及经济价值,其年产值可达几十亿元。由于其具有广泛的药理学特性,所以临床需求量不断增加,棒酸原料药的需求量也在不断增加。甘油是棒酸生物合成的直接前体,其在发酵过程中的浓度直接影响棒酸的发酵单位。因此,开发适用于工业化生产的棒酸时,发酵液中甘油的检测分析方法是保证高发酵单位的关键。精确分析甘油含量的方法有高碘酸氧化法、分光光度法[1]、原子吸收法、气相色谱法、近红外光谱法、高效

液相色谱法[2]和甘油激酶法[3]等。但在微生物培养基和代谢产物成分十分复杂的发酵液中,由于含有其他多羟基醇类的类似产物,故影响了甘油的测定结果,而国际上用来测定发酵液中甘油含量的试剂盒方法价格昂贵,成本较高,故不适合发酵生产过程中对甘油含量的监控。

笔者参照!中国药典∀(2005版)中甘油含量的测定方法

[4]

,根据棒酸发酵液的特性,建立了一种快

速、简便、准确测定发酵液中甘油含量的方法,并验证了其检测的精确性。

1 方 法

1.1 原理

甘油与高碘酸钠发生反应生成酸,剩余的高碘酸钠用乙二醇中和,最后由氢氧化钠滴定生成酸。由于发酵液中的单糖也和高碘酸钠发生反应生成

酸,所以应检测单糖的量,计算其消耗的氢氧化钠的量,再经计算得出甘油消耗的氢氧化钠的量,继而计算得出甘油的含量(全文指质量浓度)。

1.2 试剂配制

2.14%(质量分数,下同)高碘酸钠溶液:称取21.4g高碘酸钠,加入978.6g水中,溶解即可;乙二醇(体积分数为50%):将500mL乙二醇加入500mL水中,摇匀即可。

1.3 操作过程

1.3.1 还原糖对甘油含量的影响

准确称取2.15g葡萄糖,用水定容至100mL 的容量瓶中。取5mL至碘量瓶中,加入45mL的水,加入25mL质量分数为2.14%的高碘酸钠溶液,摇匀,加盖,于暗处放置15min。再加入5mL 的乙二醇(体积分数为50%),暗处放置20m in。然后加入0.5m L酚酞指示剂,用0.1mo l/L的氢氧化钠滴定至溶液由无色变为粉红色,消耗的氢氧化钠的体积为10.159mL。

1m L质量分数为2.15%的单糖消耗氢氧化钠的体积为10.159/5= 2.0318mL;同时进行平行试验,取质量分数为2.15%的葡萄糖溶液1m L,如上操作,消耗氢氧化钠的体积为2.0230mL。由以上结果可得,1mL质量分数为2.15%的单糖消耗氢氧化钠的体积为(2.0318+2.0230)/2=2.0274mL。

1.3.2 多糖对甘油的影响

取淀粉2.0g,加水定容至100m L的容量瓶中,分别取5m L和2mL至碘量瓶中,加入45mL 的水,加入25m L质量分数为2.14%的高碘酸钠溶液,摇匀,加盖,暗处放置15min。再加入5m L的乙二醇,暗处放置20min。然后加入0.5m L酚酞指示剂,用0.1mol/L的氢氧化钠滴定至溶液由无色变为粉红色,消耗的氢氧化钠的体积分别为0.1320mL和0.0640mL,计算1mL质量分数为2.0%的多糖消耗的氢氧化钠的体积分别是0.0264 (0.1320/5)mL和0.0320(0.0640/2)mL,平均值为(0.0264+0.0320)/2=0.0292m L。

以上试验表明:多糖消耗氢氧化钠的体积很小,可忽略不计。

1.3.3 棒酸发酵液中甘油含量的测定

1)反应原理

C3H8O3+2N aIO4=H COOH+2H CH O+ 2NaIO3+H2O,

H COOH+N aOH=H COONa+H2O。

2)测定方法

精密量取棒酸发酵液(滤液或者上清液)5.0mL 于碘量瓶中,加入45mL的水,精密加入25mL的高碘酸钠溶液,摇匀,加盖,暗处放置15min。再加入5mL乙二醇溶液,暗处放置20min。加入酚酞指示剂8~10滴,用0.1m ol/L的标准氢氧化钠溶液滴定至溶液的颜色由无色变为粉红色,消耗的氢氧化钠的体积为V0,同时测定棒酸发酵液中还原糖[2]的含量W(质量浓度),计算出还原糖消耗的氢氧化钠的体积:V1=W#2.0274#5/2.15,甘油消耗的氢氧化钠的体积为V0-V1。

甘油的质量浓度=

(V0 V1)#M#9.21

0.1#5.0。

式中:V0为发酵液消耗的氢氧化钠的体积, m L;V1为还原糖消耗的氢氧化钠的体积,m L;M为氢氧化钠标准滴定液的实际浓度,mo l/L;9.21为1mL氢氧化钠(0.1m ol/L)相当于9.21mg的甘油;5.0为发酵液的取样体积,mL。

2 方法学验证

2.1 加样回收率试验

称取分析纯甘油1.05g,用棒酸甘油空白发酵液(各种配料均相同,不加甘油)定容至100m L,配成甘油质量浓度为10.5m g/m L的发酵液,用上述方法进行测定,6次测定结果见表1,其中还原糖质量浓度为0.564g/mL;氢氧化钠浓度为0.09831 mol/L;还原糖消耗的氢氧化钠的体积V1=0.564# 2.0274#5.0/2.15∃2.66mL。表1结果表明该方法的回收率良好。

表1 加样回收率试验结果

T ab.1 Recover y r ate result

项 目指 标

试验次数/次123456 V0/mL8.458.408.458.308.358.35质量浓度/

(mg%mL-1)

10.5210.3910.5210.0410.3010.30

回收率/%100.1098.95100.1095.6298.1098.10平均回收率/%98.50

RSD值/% 1.69

2.2 与甘油酶试剂盒方法检测结果对照试验

在2008010批次试发酵试验中,取连续中控发酵液样品,同时用甘油酶试剂盒方法(方法1)与高碘酸钠滴定法(方法2)测定甘油含量,并对照2种方法测定结果,见表2,甘油含量趋势图见图1,甘油酶试剂盒法与高碘酸钠滴定法测定结果对应关系见图2。

190河 北 工 业 科 技 第27卷