生物素-探针实验步骤
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罗丹明-探针实验步骤
1）贴壁细胞系在15cm平板中15ml培养基中生长至约90％。去掉培养基，用PBS洗涤细胞2次，然后加入新鲜培养基（15ml）。
（2）加入探针（探针终浓度为0.001-10μM或者终浓度为2μM），振荡摇匀，然后在37℃温育1小时。温育后，除去培养基，用15ml PBS洗涤细胞3次。
（3）收获细胞，用PBS清洗两次，然后加入裂解液，4℃，30min。探针超声，高速离心（16000g，4℃，15min）。
（4）BCA法测量蛋白浓度。（3mg/ml）。
二、Click反应
（1）取43ul的样品，加入终浓度为20 μM生物素叠氮化物，1mM TCEP，100μM TBTA和1mM CuSO4，并使终体积为50μl，混匀。反应在室温下进行1小时。（2）点击结合后，加入冰-80℃（甲醇：水：氯仿=4：3：1）10倍量，-20℃，4h。后用5mL冷甲醇洗涤3次。用UB（8M的尿素0.1M Tris/HCL PH8.0所配）复溶蛋白。
（3）加入12.5ul的5*sds，煮样，跑胶，扫描凝胶，
(4)银染，
(5)胶内酶解
(6)除盐
(7)测质谱
生物素-探针实验步骤
一、细胞处理
（1）贴壁细胞系在15cm平板中15ml培养基中生长至约90％。去掉培养基，用PBS洗涤细胞2次，然后加入新鲜培养基（15ml）。
（5）加入探针（探针终浓度为0.001-10μM或者终浓度为2μM），振荡摇匀，然后在37℃温育1小时。温育后，除去培养基，用15ml PBS洗涤细胞3次。
（6）收获细胞，用PBS清洗两次，然后加入裂解液，4℃，30min。探针超声，高速离心（16000g，4℃，15min）。
（7）取上清留样（input），BCA法测量蛋白浓度。（3mg/ml）。
二、Click反应
（1）取430uL的样品，加入终浓度为200 μM生物素叠氮化物，1mM TCEP，100μM TBTA和1mM CuSO4，并使终体积为500 μl，混匀。反应在室温下进行1小时。
（2）点击结合后，加入冰-80℃（甲醇：水：氯仿=4：3：1）10倍量，-20℃，4h。后用5mL冷甲醇洗涤3次。用UB（8M的尿素0.1M Tris/HCL PH8.0所配）复溶蛋白。
三、还原烷基化
（1）加入500μl 50mM DTT（UB所配），室温votex 10s 后，室温孵育30min；（2）加入500μl 50mM IAA（UB所配），室温votex 10s 后，室温避光孵育30min.
（500ul的蛋白样品，500ul的DTT,500ul的IAA）
（3）使尿素浓度降到1M以下防止尿素析出（加入7mlPBS），随后加入平衡好的beads，4℃孵育过夜。
四、Streptavidin pulldown
（1）平衡beads：
A．取50ul beads混合液到一干净的EP管中；
B．用磁力架吸附beads后去上清；
C．加入1ml PBS ，颠倒混匀10s后，用磁力架吸附beads后去上清；
D．重复C，2遍；
（2）样品孵育：
A. 将beads加入样品中；
B. 4℃孵育过夜
C. 离心，留部分上清（SUP）做WB，其余舍弃；
D. 加入1ml Wash Buffer，颠倒混匀30s后，离心后去上清；
E. 重复D，3遍；
Wash Buffer:
Wash Buffer 1：
2% SDS。
Wash Buffer 2：
0.1% deoxycholate，1% Triton X-100，500 mM NaCl，1 mM EDTA，and 50 mM Hepes（pH 7.5）。Wash Buffer 3：
250 mM LiCl，0.5% NP-40，0.5% deoxycholate，1 mM EDTA，and 10 mM Tris（pH 8.1）。Wash Buffer 4：
50 mM Tris（pH7.4），and 50mM NaCl 两次。
取10% beads用10ul 1X SDS loading Buffer煮样，使样品Elute，收集样品至一干净EP管；剩下的90% beads用作后续的on-beads-Digestion
五、样品酶解，on-beads-Digestion
（1）在剩余的90% beads中加入500ul 8M UB，室温votex 10s 后，用磁力架吸附beads，去上清；洗三次。
（2）加入500ul ABC，室温votex 10s 后，用磁力架吸附beads，去上清；洗三次。
（3）加入100ul含适量Trypsin（1：50~1：100）的ABC溶液，37℃下孵育16h；（4）用磁力架吸附beads，收集上清至一干净EP管中，
（5）在beads中加入50ul 含5% ACN的ABC，votex 1min后，用磁力架吸附beads，收集上清至同一EP管中；
（6）重复（5），1遍。
六、样品肽段除盐
（1）装柱：
C18量一般为10mg左右;为蛋白量的100倍。
（2）活化：
200ul ACN，0.3g，5min试离心，一次。
（3）平衡：
200ul 0.1%甲酸，0.3g，5min试离心，两次
（4）上样：
上样前调样品PH为3;每次70ul样品，0.7rpm，15min试离心
（5）冲洗：
200ul 0.1%甲酸，0.1g，10min试离心，三次
（6）洗脱
70ul75% CAN，25%的0.1%甲酸，0.7rpm，15min试离心，两次
真空干燥，甩干。不检测的话-20℃存放。
六、nano-LC-MS检测
（1）肽断用5%ACN,0.1%甲酸复溶；除杂质：13000rpm，5min，或者用滤膜。（2）质谱进样量最少0.6ug
八、分析数据