示差光度法

粒子性
E
单色光、复合光、互补色光
单色光 复合光 光的互补 ? ?
绿蓝 橙 蓝绿 绿 黄绿 黄
?
蓝 紫 紫红
红
问题:光与物质如何发生作用?
物质的颜色与光的关系
光谱示意
复合光
表观现象示意
完全吸收
完全透过
吸收黄色光
1.分子能级图：微观上表现为能级跃迁 E电子 + E振动 1～200ev 0.05～1ev 可见、紫外 红外
0.5
n
cM / c
0.33
CR/CM
cM / c
M:R=1:1 M:R=1:2
饱和法(摩尔比法)
等摩尔连续变化法
补充习题1：
准确称取1.00mmol指示剂HIn5份，分别溶解于1.0升
不同得缓冲液中，用1cm比色皿在650nm下测得数据
如下： pH A 1.00 0.00 2.00 0.00 4.70 0.588 10.0 0.840 11.00 0.840
0 C
< 104 =104 ~105 > 105
=1.1 104
10.2 分光光度计及吸收光谱 10.2.1 分光分度计
分光光度计基本部件 氢灯，氘灯，185 ～ 350 nm； 光源 卤钨灯，250 ～2000 nm. 单色器 玻璃棱镜， 350 ～ 2500 nm 石英棱镜，185 ～ 4500 nm 光栅 玻璃比色皿，石英比色皿 光电管，光电倍增管
5.0
5.0
50.0
5.0
5.0
5.0
50.0
5.0
50.0
50.0 50.0
50.0 50.0
(2) 以1号试剂空白为参比在510nm处测量2-7号吸光
度A值. (3) 以1-5号标液铁含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘 制A-c标准曲线，求曲线方程与。 (4) 由曲线方程分别求出或从标准曲线上分别查出6 号和7号对应的铁含量： 6号～ Fe2+ ； 7号～ Fe2+ +Fe3+ ； 7号-6号～ Fe3+。
10.6 吸光光度分析法的应用
单组分的测定
微量铁的测定 氨基酸的测定 蛋白质的测定 总磷的测定 邻二氮菲法 茚三酮法 考马斯亮蓝法 磷钼蓝法 10.6.3 食品分析 10.6.2 临床分析 10.6.1 工业分析
海水中营养盐的测定
10.6 吸光光度分析法的应用
多组分的测定 1. 解联立方程法
y y x x A1 A A bc 1 1 x 1 1bc y

三 维 谱 图
A max C
10.3 显色剂及其影响因素
10.3.1 显色反应与显色剂
有机化合物 官能团强吸收 官能团弱吸收 无机化合物
Fe2+
直接测定
UV-VIS
衍生化反应 UV-VIS
显色反应
显色反应
3
+
2+
N N N N Fe
3
3
邻二氮菲
桔红色 max
1.显色反应的选择
显色反应： M + R MR a.灵敏度高、选择性好； b.有色化合物的组成恒定；
C6H5
二苯硫腙
Pb2+ =1.3 ×104 max =520nm
10.3.2 影响显色反应的因素
吸收曲线
A
显色剂用量曲线
A
酸度曲线
A

VR
pH
A
温度曲线
A
时间曲线
A
工作曲线
T
t
C
10.4 吸光光度分析及误差控制
10.4.1 测量波长的选择和标准曲线的制作 1.测量波长的选择
无干扰，选择 max A A 有干扰
c： g ·L
–1
K a
A acb
摩尔吸光系数的意义
1.摩尔吸收系数～反映吸光物质对光的吸收能力,取决于 分子结构,是物质定性依据。 2.摩尔吸收系数～反映光度分析方法的灵敏度．
Fe2+
+
3
N
N
N
N Fe
3
3
2 +
A bC
A
邻二氮菲
桔红色 508
低灵敏度 中等灵敏度
高灵敏度



2.标准曲线的制作 c1 c2 c3 c4 A1 A2 A3 A4
标准系列 0.80 Ax 0.60 0.40 未知试液 0.20
c5 A5
cx Ax
A＝ b c 工作曲线法 A
*
cx
0.00 0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)
3.参比溶液的选择
被 测 物 M 无 色 无 色 或 有 色 干 扰 N 显 色 剂 R 无 色 有 色 无 色 掩 蔽 剂 L 无 色 或 有 色 或 有 色 辅助 试剂 (缓冲 液等)
+
E转动 0.05ev 红外
2.分子吸收光谱图：宏观上表现为光吸收
（1） KMnO4吸收曲线（2）定性、定量依据
E v3 v2 v1 v3 v2 v1 E2
吸 光 程 度
吸收光谱
E1
r2 r1
E0
入
10.1.2 光吸收的基本定律
入射光 I0 透射光 It
透光率定义：
It T I0
T ~ ？~ C
HR R
AHB C AB C

A HB [ HB ] B [ B ]
C = [HB] C = [B-]
AHB HBC
AB BC
HB
B
pKa lg
AB A A AHB
pH
10.6.4 其它应用 2.络合物组成的测定
A
M nR=MR n
化学分析 电分析 分析化学 原子吸收光谱 原子发射光谱 吸光光度法 ……
仪器分析
光分析
色谱分析
10.1 物质对光的选择吸收和光吸收的基本定律 10.2 分光光度计及吸收光谱 10.3 显色剂及其影响因素 10.4 吸光光度分析及误差控制
10.5 其他吸光光度法 10.6 吸光光度分析法的应用
吸光光度法:是基于被测物质的分子对光具有选择吸收 的特性而建立的分析方法。
10.4.3 吸光度测量的误差
A= b C dA= b dC dc dA Er c A A lg T 0.434 ln T
dA 0.434 dT T
dc dA dT Er c A T ln T
如何减少吸光度测量的误差？
T%
90 80 dT=1% 10.7 5.6 dT=0.5% 5.4 2.8
c.显色对比度大：MRmax Rmax nm
2.显色剂
无机显色剂：利用络合反应和氧化还原反应 有机显色剂：利用配位、螯合、缔合反应 结构特点： -N=N- 等共轭双键 生色团 有 = .. = 、 助色团 有 -NH、-OH等含孤对电子的基团 形成有色有机化合物的类型：
配合物 螯合物 离子缔合物
Fra Baidu bibliotek
A
50
A
0.5
T = 100.0 % A = 0.0
0
0
C
吸光系数
A kcb
K 比例常数
b ～cm c～ g ·L –1或mol ·L –1 物质的性质 入射光波长 温度
c：mol ·L
–1
K
A cb
摩尔吸光系数 L ·mol –1 ·cm -1 吸光系数a L ·g –1 ·cm -1
全部吸收 全部透射
T = 0.0 % T = 100.0 %
朗伯-比耳吸收定律的推导 I I0 I-dI It dI ∝ N I N = N0 c dS db N = k’ c db dI ∝ N I = I k’ c db db b 积分 或 dI = - I k c db , dI / I = - k c db
编号 铁标液/mL 1 2 3 4.00 4 5 6 / 7 /
0.00 2.00
6.00 8.00
待测试液/mL
盐酸羟胺/mL 邻二氮菲 /mL
/
1.0 2.0
/
1.0 2.0
/
1.0 2.0
/
1.0 2.0
/
1.0 2.0
5.00
/ 2.0
5.00
1.0 2.0
pH5缓冲/mL
定容至/mL
5.0
2 0
20
0.7
(36.8) 40
0.4 0.434
60
0.2
80
0.1
T% A
10.5 其他吸光光度法
10.5.1目视比色法
标准系列 未知样品
I0 Ax lg bcx 普通光度法: 以空白溶液为参比 Ix 示差光度法: 以标准溶液Cs为参比 （Cx > Cs）
A A′
10.5.2 示差光度法
I
It
0
dI k b cdb I 0

得 得
It ln kcb I0
lg
It kcb Kcb I 0 2.303
lg T Kcb
吸光度与透光率
令：A lg T kcb
A： 吸光度
1.0
T 10 A 10 Kbc
T
100
T = 0.0 % A=∞ T%
化合物
MRn NLn
参比溶液 内容
H2 O NLn+R+ 缓冲液 NLn+R+ 缓冲液 NLn+M+ 缓冲液
名称 溶剂 空白 试剂 空白 试液 空白
无 色 或 有 色 或 有 色
无色
有 色 有
无 色 或 有 色 或 有 色
无色
色
有 色
无色
有 色
有 色
有 色
有 色
无色
有
色
有
色
NLn+M+L+R
样品池 检测器
信号输出
表头显示、数字显示、屏幕显示、记录
单波长单光束分光光度计
0.575
光源
单色器
吸收池
检测器
显示
（计算机）
单波长双光束分光光度计
光束分裂器 光源 单色器
比值
吸收池
检测器
显示
10.2.2 吸收光谱
KMnO4溶液的吸收光谱
吸收光谱与吸收定律的关系
吸 收 定 律 A 吸 收 光 谱 C A
10.1 物质对光的选择吸收和光吸收的基本定律
10.1.1 物质对光的选择性吸收
光的电磁波性质

10-2 nm 10 nm
射 线 x 射 线
102 nm 104 nm
紫 外 光 红 外 光
0.1 cm 10cm
微 波
103 cm
105 cm
无 线 电 波
可
见
光
光的波粒二象性 波动性

hc E h
CH3 C N OH 2 CH3 C N OH
+ Ni
2+
CH3 CH3
O O C N N C CH3 Ni + 2 H+ C N N C CH3 O H O
C6H5 N N 2 C H 6 5 N H N N N C6H5 H C
2+ SH + Pb
H C6H5 N N C S S Pb N C N N + 2H+ N C6H5
70 4.0 2.0
60 3.3 1.7
50 40 30 20 10 5 2.9 2.7 2.8 3.2 4.3 6.5 1.5 1.4 1.4 1.6 2.2 3.3
Er
10 8 6 4
c 0.434T c T lg T ( T 0.01) Er
A=0.8 T=15%
A=0.2 T=65%
+ 缓冲液
褪色 空白
10.4.2 对朗伯-比尔定律的偏离
1.非单色光引起的偏离
2.介质不均匀引起的偏离
胶体溶液、乳浊液、悬浊液
3.溶液本身化学反应引起的偏离
解离、分解
4.显色反应的干扰及其消除方法
• 控制溶液酸度
• 加入掩蔽剂 • 改变干扰离子的价态 • 选择合适的参比 • 增加显色剂的用量
二元：M—R 三元：M—R—表面活性剂 多元： （增敏、增溶、增稳）
OH
磺 基 水 杨 酸
COOH
H3C H3C
C C
N N
OH OH
N
N
SO3H
丁二酮肟
Ni2+ =1.3 ×104 max =470nm
H
邻 二 氮 菲
Fe3+ =1.6 ×103 max =520nm
Fe2+ =1.1 ×104 max =508nm
A Ax As b(cx cs)
bcx
△Cx
普通光度法: 示差光度法:
T=0
△C
T 2
示差光度法的实质?
T1
T=5% T=10% 1 Cx C s 1
A=0
A=
50%
T=100%
10.5.3 双波长光度分析法
X
A
x A1
x 1
A 2
x
x
A
Y
（ 2）bC x
1 单色器 光 源 单色器
切 光 器 狭 缝 吸 收 池
2

检测器
10.5.4 导数分光光度法
一阶导数信号与试样浓度呈线性 关系: dI/dλ ＝－Ｉ0 bc dε /dλ 测定灵敏度依赖于摩尔吸光系数
对波长的变化率dε /dλ 。吸收曲
线的拐点处dε /dλ 最大，故其灵 敏度最高(见图）。 同理可以导出其二阶和三阶导数 光谱（略）
求该指示剂的pKa。
分析方案设计
☞ Fe2+ +Fe3+混合液
☞ Cr(III) + Cr (VI)混合液 显色剂？ 显色条件？测定波长？ 参比溶液？
例1：分析Fe2+ +Fe3+混合液中微量Fe2+ 和Fe3+的
含量（ug/mL）
2+
N
3
N
+
Fe2+
N N Fe
3
λ
max
= 510nm
解：(1) 标准系列与待测试液的配制
y x y x A 2 A A bc 2 2 x 2 2bc y
A
X
Y
1 2 A

解联立方程，可求得Cx, Cy 2.双波长光度分析法
x
1
x
Cs(x)
2
10.6.4 其它应用 1.弱酸弱碱离解常数的测定
A HR R
pH pH (b=1cm)
pH < < pKa-1 pH > > pKa+1