尿蛋白定量测定方法及有关问题

摘要 尿蛋白定量对肾脏疾病的诊断、 分期、 治疗监测和预后判断有着非常重要的意义。现 就 目前常用及部分新的尿蛋白定量检测方法进行回顾 , 并 对其准确性、 灵敏度以及对各种蛋白质成分 的 测定一致性、 干扰因素等方面进行评价wenku.baidu.com讨论 , 以期为相关人员正确选择分析方法和判断检测结果 提 供帮助。 关键词 蛋白尿 ; 肾脏疾病 ; 诊断技术和方法
尿蛋白定量对肾脏疾病的诊断、 分期、 治疗监测 和预后判断有着非常重要的意义。无论什么目的 , 对 其采用的方法要求必须准确可靠。蛋白定量的方法 很多, 如紫外吸光法、 折光测定法、 克氏定氮法、 L ow ry 法( 福林 酚法 ) 、 双缩脲比色法、 考马斯亮蓝 G 250 法 等。但尿液中蛋白浓度很低 , 因此要求采用的方法敏 感度也必须非常高。目前已有的尿蛋白定量测定法 包括比浊法、 比色法、 染料结合法、 免 疫测定法、 红外 测定法、 电阻法、 高压液相法等。每种方法各有其特 点, 理想的方法, 必须准确性好、 灵敏 度高, 对各种蛋 白质成分的测定一致性较好 , 并且操 作方便、 干扰因 素少。其中, 双缩脲比色法是目前较 好的方法, 通过 沉淀剂 ( 高氯酸、 钨酸盐或乙醇乙二醚等 ) 对蛋白的沉 淀, 白蛋白和 球蛋白都能得到较准确的测量, 已被 国内检验界普遍 采用。但 它灵敏 度低, 所需 标本量 多, 不能自动化。本文将就目前常用及部分新的尿蛋 白检测方法进行讨论 , 对其准确性、 灵敏度、 对各种蛋 白质成分的测定一致性及干扰因素等进行评价 , 并对 相关问题进行回顾, 以期为实验人员正确选择分析方 法, 为临床和科研提供准确的信息 , 同时也希望对临 床医生正确判断检测结果有所帮助。 比浊法 ( t urbidomet ric method) 包括苄乙氯铵( benzethonium chloride, BEC) 法、 苄烷氯铵 ( benzalkonium chloride, BAC) 法、 三氯乙酸 ( t richloro acetic acid, T CA) 法又称 Bo ssak 法、 磺基水 杨 酸 硫 酸 钠 ( sulphosalicy lic acid, SSA ) 法 又 称 Meulem ans 法等。其中磺基水杨酸 硫酸钠法和高氯 酸法虽然操作简便, 但因线性范围窄, 易受温度、 pH 、 药物 ( 磺胺、 青霉素、 有机碘等) 及多肽类物质等多种 因素影响 , 重复性差 ; 此外 , 对球蛋白和白蛋白反应灵 感度明显不一致 , 因此目前已少用。目前常用的是苄 乙氯铵法。 苄乙氯铵比浊法是比浊法中最好的方法, 无论是
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国外医学临床生物化学与检验学分册 2005 年 11 月第 26 卷第 11 期 Sect Clin Biochem & Lab M ed Foreign Med Sci, November 2005, Vol 26, N o. 11
综述
尿蛋白定量测定方法及有关问题
严静霞 综述 裴华颖 于连英 审校
情况下会干扰结果, 1 酸性糖蛋白有轻度抑制作用 , 蛋白栋、 氨基酸、 抗生素对其无影响 [ 3] 。其缺点是线 性范围窄 , 且污染比色杯、 不易洗净。反应环境为酸 性环境, 而很 多蛋白难 溶于或 不溶于 酸性 溶液。此 外, 染料与蛋白质的结合会随蛋白质的种类和转录后 修饰而有所不同。在其原 始的方法 中, CBB 对白蛋 白、 球蛋白反应性不一 , 经 Real 等改进方 法后, 即在 试剂中增加 CBB G 250 的浓度及增加磷酸的用量, 对 不同蛋白 质 的 敏 感 性 增 加。 此 外, 在 试 剂 中 加 入 SDS, 可增加对轻链蛋白的敏感性。 2. 邻 苯 三 酚 红 钼 ( pyrog allol red m oly bdat e, PRM) 法 : 其原理为邻苯三酚红与钼酸盐结合形成红 色复合物。在酸性条件下, 该 复合物与蛋白结合, 从 而使蛋白的最大吸收波长由 467 nm 转换为 598 nm , 并产生蓝紫色。样品中的蛋白浓度可在 600nm 处测 量。 球蛋白的呈色反应为白蛋 白的 70% 。若每升 试剂中添加 25 m g 的 SDS, 则两者的呈色反应一致。 与双缩脲法的相关系数为 0. 951。它具有简单、 快速、 敏感、 经济等优点, 既可自动化 , 又可手工操作。显色 稳定 , 且对白蛋白、 球蛋白的反应基本一致 , 不像其他 染料法, 它对比色杯染色弱。试剂 非常稳定, 4~ 8 可保存 1 年。但它易受表面活性剂的干扰 , 染料质量 常影响试验结果。线性范围为 10~ 16 000mg/ L, 超 出线性范围的 标本以 75mm ol/ L KCl 稀释。正常值 为 28~ 141mg / 24h 。反应条件为 37 10m in。 SDS 浓度超过 1g/ L 、 T rit on X 100 浓度超过 1% 对本反应 有干扰。 3. 丽春红 S 法 : 丽春红 S 中有干扰因 素少的优 点, 但需用三氯乙酸沉淀 , 操作较繁琐 , 若离心沉淀不 完全也可影响测定结果。 4. 酸性紫 6B 法: Iijima 等 [ 4] 发明了一种新的尿蛋 白测 定 方 法, 称 为 色 素酸 性 紫 6B ( acid violet 6B, AV6B) 法。它对 尿 蛋白 中 的 球 蛋白、 T H 蛋 白、 IgG 、 IgA 、 转铁蛋白反应 性与 PRM 法 一致。一项关 于 AV6B 法、 CBB 法和 PRM 法 3 种方法比较的研究 表明 , CBB 法 敏感 性低 于其他 2 项, 而 AV6B 法比 CBB 法和 PRM 法更敏感, 因此它更适用于低浓度的 尿蛋白测定。 近红外光谱测定法 Pezzaniti 等 [5] 利用近红外光谱仪 ( FT IR spectros copy) 在( 1 350~ 1 800) nm 和( 2 050~ 2 375) nm 处可以 准确地测定尿蛋白含量。除蛋白外 , 还可测定糖、 酮体、 尿素、 肌酐等。其优点是快速、 样品准备简单、 不需试 剂、 能对多个指标进行监测、 能实现自动化。 电阻法 Event ov 等 发明了一种新的尿蛋白测定方法及 仪器。它利用尿液中的蛋白含量不同所产生的电阻
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上样测定。 2. 双辛丁酸( bicinchoninic acid, BCA) 法: 其原理 是在碱性溶液中 , 蛋白质把 Cu 2+ 还原为 Cu+ , Cu+ 与 双辛丁酸结合, 形成稳定的紫色络合物, 在 562nm 处 有一最大吸收波峰。吸光度与蛋白质的量成比例 , 检 测 562nm 处吸光度 , 可测量蛋 白浓度。线性 范围为 0. 02~ 2g / L 。适合于低蛋白 ( 或其他还原物) 浓度的 液体分析。反应 温度 和时间 为 37 30min 或 室温 2h 。若采用强化方案即 60 30m in, 可进一步增加灵 敏度, 线性范围 5~ 250mg/ L。双辛丁酸是一敏感、 稳 + 定的 Cu 特异性较强的显色剂, 也被用于监测尿酸和 2+ 糖还原 Cu 的 能力。 BCA 法的优点 包括: ( 1) BCA 是一水溶性、 性质稳定的化合物 , 能与系统中的其他 试剂共处 ; ( 2) 它的线性范围较宽 , 但又不失其敏感 性; ( 3) 对酪氨酸、 色氨酸的呈色反应较少。它与考马 斯亮蓝法相比 , 对不同的蛋白反应差 异性较少, 能在 碱性环境中应用。与 L ow ry 法相比, 它具有简单、 一 步化、 能自动化操作、不需要分步及定时添加试剂等 特点。该法不受去污剂的影响。巯基可与 BCA 铜试 剂反应, 干扰其测定的准确性。若在 BCA 铜试剂加 入前 , 以 10 倍以 上摩尔浓 度的吲 哚乙酰 胺 ( 不与 BCA 反应 ) 与蛋白溶液孵育, 可阻止巯基与 BCA 铜 试剂反应。 染料结合法 甲基橙、 氨基黑 10B 、 溴酚蓝等曾用于染料结合法 测定蛋白质。由于灵敏度不高 , 已弃用。目前采用的 考马斯亮蓝 G 250 法及邻苯三酚红钼法具有灵敏度 高、 操作简便、 快速、 重复性好、 试剂配制简单、 能自动 化等优点 , 但对不同的蛋白显色反应不一。其原因现 认为与染料的纯度和浓度及 SDS 的添加等有关。 1. 考马斯 亮蓝 G 250 ( Coomassie brilliant blue G 250, CBB G 250) 法: 1976 年由 Bradfor d 建立, 又叫 Bradfor d 法。 CBB G 250 具有红色和青色两种色调, 在游离状态下 , 呈红色型 , 一旦与蛋白质结合即变为 青色 , 色素的最大吸收波长从 465nm 转移到 595nm 。 测定 595nm 处的光密度值, 即可进行定量。线性范围 为 1~ 1 500mg / L 。正 常值为 36mg / 24h ( 范围 12~ 114m g) , 正常值上限为 120m g/ 24h; 蛋白肌酐比的正 常值为 34m g/ g ( 范围为 12~ 106mg/ g) 。反应条件为 室温 5m in。 CBB G 250 使用浓度在 0. 15~ 0. 18g / L 时不同蛋白质的敏感性较一致。 CBB G 250 主要与 碱性氨基酸及芳香族氨基酸 ( 尤其是精氨酸) 残基结 合。其优点是所受干扰因素较少 , 重 复性好, 敏感性 高, 操作简单, 可用于自动化仪器。对不同的蛋白尿 类型 ( 小管性、 小球性 ) 反 应性基本 上与双缩 脲法一 致, 但对本 周氏蛋白测定的结果略为偏低。一般不受 还原剂( 如还原性糖、 巯基等还原性底物 ) 的干扰, 不 受氨基糖甙类抗生素影响 , 但某些去污剂在浓度高的
作者单位 : 050000 石家庄 , 河北医科大学第二附属医院肾脏科
敏感性还是准确性, 以及对白蛋白和球蛋白的反应均 一性都优于其他比浊法。苄乙氯铵在碱性条件下 , 与 蛋白形成稳定的沉淀物 , 在 660nm 处进行比浊测定 , 可对蛋白进行定量。其敏感度为 60mg / L , 对各种蛋 白反应性一致 , 不受氨基糖甙类抗生素影响。线性范 围广 , 敏感性高 , 精确性高, 重复性好 , 回收率高, 可用 于自动化分析。由于试剂及方法稳定 , 可用于样品微 量化测定 , 样 品量 0. 1ml。若 BEC 的使用 浓度增加 12 倍, 可使其更加微量化, 仅需 10 l 样本。有时会有 部分结果不稳定 , 可能与尿中干扰物质有关, 如尿黑 酸会干扰 BEC 对尿蛋白的测量。 有研究者对 T CA 、 SSA 、 BEC、BAC 4 种沉淀剂 进行比较发现, 使用酸性 ( T CA 、 SSA) 沉淀剂结果偏 低, 使用 BEC 结果偏高。相对来说 , BAC 结果比 BEC 结果稳定 , 异常结果少, 因而认为它更适于尿蛋白的 自动化比浊法测定[ 1] 。 比色法 1. 双缩脲( Biur et ) 法 : 其原理是蛋白质的肽键 ( CO NH ) 在碱性溶液中与 Cu2+ 络合显蓝色( 又叫双缩 脲反应) 。测量 546nm 处的吸光度 , 能对蛋白质进行 定量。在实际应 用中, 常先将 样品中 的蛋白 进行沉 淀, 再进行双缩脲反应。双缩脲比色法为蛋白质定量 的经典方法, 是尿蛋白定量的精确度较高的方法 , 其 显色稳定、 重复性好 , 对各种蛋白 ( 如白蛋白、 球蛋白 ) 反应性一致。其主要缺点为灵敏度低 , 对样品的使用 量要求较多。对低蛋白浓度的体液如脑脊液、 尿液等 不够敏感。线性范围为 ( 10~ 100) g / L 。反应温度和 时间为 37 30min 。 由于目前的双缩脲比色法在加双缩脲试剂后 , 需 再进行离 心, 所 以在自动 化生化仪 器上的应 用不方 便。最近 , 北京人民医院建立 了一种方法, 不需要再 进行离心 , 从而可将双缩脲比色法用于尿蛋白测定的 自动化生化仪器上 [ 2] 。该方法具体是在分析前对标 本进行酸化, 加钨酸沉淀尿蛋白。10min 后 , 离心、 去 上清 , 吸干残留液, 以 0. 2 mol/ L NaOH 溶解沉淀后