亲和色谱
9 亲和色谱
然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在 有利于固定相配基与目的物质形成络合物的条 件下进入层析柱。
16
这时，混合液中只
有能与配基发生结合反
应形成络合物的目的物
质（图中· 分子）被吸附。
不能发生结合反应
的杂质分子（图中△分 子）直接流出。
17
经清洗后，选择适当的洗脱液或 改变洗脱条件进行洗脱（图中c），
22
配体的选择：
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶 联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体， 辅酶等。
优良配体须具备的条件：
1）与待纯化的物质有较强的亲和力。 2）具有与基质共价结合的基团。
23
目的产物与相应的配基
所要分离的目 的产物
酶 抗体 凝集素 激素
相应的配基
底物、抑制剂、辅酶（辅因子） 抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白
亲和配基选择（很困难）：
组合化学肽库：小肽亲和配基。
噬菌体展示技术筛选：目标蛋白与噬菌体结合。
SELEX技术筛选：：与蛋白质相匹配的寡核苷酸 6
9.1 生物亲和作用
9.1.2 影响亲和作用的因素
离子强度 pH值
抑制氢键形成的物质
温度 螯合剂
7
9.1 生物亲和作用
9.1.3 亲和作用体系
8
9.2 亲和色谱原理
使被分离物质与固定相配基解离，
即可将目标产物分离纯化。
18
9.3 亲和色谱介质
一般情况下，需根据目标产物选择合适 的亲和配基来修饰固体粒子，以制备所需的
亲和吸附介质（固定相）。 固体粒子称为配基的载体。
19
作为载体的物质应具有（6点）： ①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度， 使用寿命长； ③具有亲水性，无非特异性吸附； ④含有可活化的反应基团，利于亲和配基的固
分析化学 第十章_亲和色谱
配基的选择
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分 为两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体 （general ligand）。 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等 生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、 酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的 特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的 特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异 性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的 生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实 验。
通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的 蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（lectine） 可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋 白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异 性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分 辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容 量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了 广泛的应用。
常见亲合作用体系
特异性 高特异性 亲和体系 抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶－底物、产物、抑制剂 免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶 凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质-肝素 酶、蛋白质-活性色素（染料） 酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等） 酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）
（2）抗体 利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析 （Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间具有 高度特异性结合能力，结合常数一般为107～1012L/mol。 因此，利用免疫亲和层析法，特别是以单抗为配基的免疫 亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。
亲和色谱法
亲和色谱法亲和色谱法是一种用于分离、纯化生物大分子的技术，它利用生物分子之间的亲和作用来进行分离、纯化。
它的基本原理是：在柱子的表面放置一种可以与目标生物分子发生亲和作用的固定化剂，然后将待测样品通过柱子进行流动。
当目标生物分子与固定化剂发生亲和作用时，就会被吸附在柱子的表面；而其他的杂质分子则不会被吸附，经过柱子流出。
最后，再通过适当的方法将目标生物分子从柱子上解离出来，即可得到高纯度的目标生物分子。
亲和色谱法的优点是分离效率高，可以得到高纯度的生物分子；缺点是分离的速度较慢，而且对于某些生物分子可能难以得到较好的分离效果。
亲和色谱法主要应用在生物学、药学、食品工业、环境监测等领域，并在这些领域取得了巨大的成功。
在生物学领域，亲和色谱法常用于抗体分离、酶的纯化、抗原的分离等；在药学领域，亲和色谱法常用于药物的纯化、抗体药物的生产等；在食品工业中，亲和色谱法常用于食品添加剂的分离、蛋白质的纯化等；在环境监测领域，亲和色谱法常用于水质监测、空气监测等。
亲和色谱法的原理是基于生物分子之间的亲和作用，因此选择固定化剂时需要考虑到固定化剂与目标生物分子之间的亲和作用。
常用的固定化剂有抗体、酶、抗原、细胞表面蛋白等。
选择固定化剂时，需要考虑到固定化剂的稳定性、选择性、可交换性、可再生性等因素。
亲和色谱法的实验过程大致分为固定化、流动、洗脱、解离四个步骤。
在固定化步骤中，需要将固定化剂放在柱子中，然后将柱子浸泡在预处理溶液中，使固定化剂与柱子结合起来。
在流动步骤中，需要将待测样品通过柱子进行流动。
在洗脱步骤中，需要通过适当的洗脱溶液将非目标生物分子从柱子上洗脱出来。
在解离步骤中，需要通过适当的方法将目标生物分子从柱子上解离出来。
亲和色谱法的优点是分离效率高，可以得到高纯度的生物分子。
缺点是分离的速度较慢，而且对于某些生物分子可能难以得到较好的分离效果。
因此，在使用亲和色谱法时，需要根据实际情况来选择适当的固定化剂和洗脱溶液，并适当调整流速，以提高分离效率。
亲和色谱模拟分离过程
亲和色谱，也称为亲和层析，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。
该方法依赖于键合在固定相上的配体与生物活性目标分子间的特异性识别与可逆的亲和力作用，实现生物分子选择性分离。
在实际操作过程中，首先将待分离的物质连接到凝胶过滤色谱柱上，并确保连接的分子与待分离物质有一定的结合能力，这种结合是可逆的，即在改变流动相条件时可以相互分离。
然后通过调整流动相条件使得待分离物质与基质之间的相互作用增强或减弱，从而实现分离。
亲和色谱法具有高分辨率、高选择性的特点，因此被广泛应用于复杂样品的分离纯化过程。
例如，可以利用亲和色谱法从混合物中纯化或浓缩某一特定分子，也可以用于去除或降低混合物中特定分子的含量。
此外，亲和色谱还可以用于从变性或功能不同的版本中分离活性生物分子，以及从大量粗样品中分离低浓度的纯化合物。
亲和色谱PPT
免疫亲和色谱 固定化金属离子亲和色谱 其他亲和色谱
免疫亲和色谱
免疫亲和色谱(Immunoaffinity Chromatography, IAC)是 利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和 力进行分离的方法。
IAC的特点
1. 2. 3.
专一 高效 灵敏 ……
IAC的应用
1. 2.
抗体的分离纯化——Protein A亲和色谱 快速诊断测试 ……
固定化金属离子亲和色谱
固定化金属离子亲和色谱(Immobilized Metal ion Affinity Chromatography, IMAC) 主要根据蛋白质中组氨酸、色氨酸或半胱氨酸等氨基酸 残基与色谱柱上的金属离子螯合作用形成络合物，从而 实现分离 产物变性 • 渗漏
谢谢
亲和色谱 Affinity Chromatography
黄岳
生研1502
亲和色谱概述
概念：利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种色谱技术
原理和基本过程
原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质 上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子 进行分离纯化。
亲和色谱的类型
1. 2. 3.
配基稳定性高 ，不易脱落 金属离子配基价格低廉 ，再生成本低 省去了脱盐的预处理步骤 容易洗脱目标蛋白
IMAC的应用——Ni-Agarose His标签蛋白纯化技术
其他亲和色谱技术
生物亲和色谱 拟生物亲和色谱 分子对亲和色谱 共价亲和色谱 凝集素亲和色谱 ……
亲和色谱需要考虑的问题
亲和色谱
Chitin
Trypsin
A
B
C&D
以凝胶电泳检验亲和色谱 操作过程各步骤样品→
Ate 吸附剂：
羟基磷灰石
(Ca5(PO4)3OH)2
可选择 NaCl 或 磷酸 等不同洗脱条件
Bio-Rad CHT
●疏水性层析法：
●●●●● ●●●
-NH2
●● ● ●
硫醇基 -SH
X
■ 可与各种配体基团反应的载体：
配体基团 親 和 性 载体
CNBr-activated Sepharose 4B
Pharmacia
反应方式
直接反应 加 EDC*
反应基团
-C≡N -COOH N-OH-succinimide Oxirane环氧己烷
■ Hydrophobic interaction 色析法：
Ammonium sulfate (% sat.) 25
0 10
Protein concentration
20
15
20
10
5
30
40
50
100
200
300
400
Elution volume (mL)
Pharmacia HIC
Ethylene glycol (%)
亲和色谱(AC)
（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定相表面存在的 某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应 性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接 上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将 只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作 用而被保留。改变淋洗液后洗脱。 亲和洗提 酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂 上，然后用适当的底物特异地洗提。
第9章 亲和色谱
硅胶的活化
硅烷化试剂 配基的固定化 直接固定法(慢) 间接固定法(氧化法，碳二亚胺法，戊二醛活化法)
生物分离工程 第8章 亲和色谱
配基密度对蛋白质吸附的影响
通常情况下，目标产物的吸附容量随配基固定化密度 的提高而增大。但是，当配基固定化密度过高时，配 基之间会产生空间位阻作用(steric hindrance)，影响 配基与目标产物之间的亲和吸附，配基的有效利用率 降低； 因此，配基固定化密度也不宜过高，通常存在最佳密 度值范围。
模型分析(前述吸附理论和模型均可用于亲和色谱的分析)
生物分离工程 第8章 亲和色谱
8.6 亲和色谱的应用
组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的纯化-酶的抑制剂为 亲和配基
t-PA是一种糖蛋白，是治疗血栓等心脑血管疾病的蛋 白药物； t-PA主要存在于动物心脏组织中，但含量很低； 目前主要利用重组DNA动物细胞生产t-PA 赖氨酸、精氨酸、氨基苄脒常用作配基
生物分离工程 第8章 亲和色谱
间隔臂的作用(消除空间位阻的影响)
配基
目 标 分 子
间隔臂
生物分离工程 第8章 亲和色谱
8.4 亲和吸附平衡
吸附等温线
基本上可用Langmuir或Freundlich方程描述
色素亲和吸附平衡
色素配基研究得最多的是辛巴蓝(Cibacron Blue 3GA, CB) CB与蛋白质的结合机理
具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁 孔”的关系是亲和作用的必要条件，但并不充分， 还需要分子或原子水平的各种相互作用才能完整 地体现亲和结合作用，包括：
生物分离工程 第8章 亲和色谱
静电作用：亲和作用分子对的结合部位上带有相反电 荷时，产生静电引力。如果满足“钥匙”和“锁孔” 的关系，在近距离发生的静电引力 很强烈的； 氢键：如果亲和作用分子对的一个分子中含有O原子或 N原子，结合部位之间可以产生氢键作用，形成O-H-O 或O-H-N的氢键结合，但氢键的产生与否受结合部位 之间位置关系的严格制约，O-H-O或O-H-N需排列在一 条直线上； 疏水性相互作用：如果亲和作用分子对的一个分子中 含有芳香环或烃基链等疏水基，另一方的结合部位上 也含有疏水区，则两者之间可发生疏水性相互作用， 如含有脯氨酸等氨基酸残基的蛋白质，胶原与单宁的 结合可通过疏水键结合； 配位键：如果亲和作用分子对均与同一金属离子配位， 则两者之间可通过金属配位键结合；
亲和色谱分离
中等盐浓度的缓冲液能稳定溶液中蛋白质并
防止由于离子交换所引起的非特异性相互作 用。
5 操作方法
3. 柱操作
柱的大小取决于吸附剂的容量和所需纯
化的蛋白质的量。一般地说，高的容量
② 流速控制
不能太快
延长时间可促进吸附
③ 吸附时间的控制
④ 进样量的大小
减少进样量，可提高吸附效果。
4 亲和色谱操作条件的选择
2. 清洗条件的选择
洗涤缓冲液的强度应介于目的分子吸附
条件与目的分子洗脱条件之间
4 亲和色谱操作条件的选择
3. 洗脱条件的选择
在实际操作过程中，应该在洗脱强度和 耐受程度之间做好平衡。
1. 载体的选择
常用的亲和色谱载体主要有多孔玻璃载
体、聚丙稀酰胺载体、纤维素载体、葡
聚糖凝胶载体、琼脂糖凝胶和交联琼脂
糖凝胶载体等。
2. 配基的选择
根据配基应用和性质，可将其分为两
类：特殊配基和通用配基。亲和层析
中常用的特殊配基有某一抗原的抗体、
某一酶的专用抑制剂、某一激素的受
体等。通用配基可适用于一类物质的
分离提纯，如用NADH作脱氢酶类亲和
层析的通用配基。
2. 配基的选择
首先，应当仅仅识别被纯化的目的物(配 体)。其次，配体与配基应该有足够大的亲 和力。再次，配基与相应目的物之间的结
合应具有可逆性。第四，配体具有足够的
稳定性，能够耐受反应条件以及清洗合再 生等条件。最后，配基的分子大小必须合 适。
3. 载体的活化与偶联
载体由于其相对的惰性，往往不能直接与配基
亲和色谱
亲和作用
亲和作用：生物分 特异性
亲和体系
子能够区分结构和 性质非常接近的其
高特异性
抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白
他分子，选择性地
酶－底物、产物、抑制剂
与其中某一种分子
相结合，生物分子
群特异性
免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶
间的这种特异性相
凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面
分类
名称
作用原理
应用
免疫亲和色谱
抗原与抗体专一性识别
抗原或抗体
固定化金属亲和色谱 锌、镍离子与蛋白表面组氨酸特异性识别 含有组氨酸的蛋白
染料亲和色谱
染料与蛋白之间的特异性识别
激酶、脱氢酶
核苷酸亲和色谱
核苷酸与蛋白之间的特异性识别
激酶、脱氢酶
凝集素亲和色谱
凝集素与糖之间转移性可逆结合
糖蛋白
蛋白亲和色谱
对 类似的抗体的转移性
免疫蛋白等
操作流程
❖ 找与底物专一可逆结合 的配基；
❖ 将配基通过共价键偶联 到基质；
❖ 配基与底物吸附； ❖ 洗脱目标物。
例子
免疫亲和色谱
❖ 抗原和抗体的作用具有高度的专一性, 并且它 们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将 抗原或抗体结合到吸附剂上, 便可有效地分离 和纯化免疫物质。
条件； 3、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品
中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。
影响因素
❖ 上样体积---若目标产物与配基的结合作用较强，上 样体积对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力 较弱，样品浓度要高一些，上样量不要超过色谱柱 载量的5%~10%。
第八章 亲和色谱
第八章亲和色谱( Affinity chromatography)第一节生物亲和作用•生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合——生物分子间的这种特异性相互作用称生物亲和作用，通过亲和作用发生的结合称为特异性结合或亲和结合。
一、生物亲和作用的概念•亲和作用是分子之间的结合作用，自然界普遍存在的现象，生物分子间的亲和作用具有更高的选择性二、亲和作用的本质必要条件：钥匙和锁孔的关系此外，还需要具备相互作用：静电作用；氢键；疏水性相互作用；配位键；弱共价键•(1) 离子强度三、影响亲和作用的因素静电引力减弱或完全破坏亲和作用氢键疏水相互作用亲和作用增大静电引力在亲和作用中占重要地位，所以一般可以用高盐洗脱•蛋白质为多价两性电解质，含有许多解离基团，不同解离基团的解离常数不同。
•(2) pH 值如果，静电引力对亲和作用的贡献最大，pH 就会严重影响亲和作用。
溶液pH 值选择非常重要。
•(3) 抑制氢键形成的物质•(4) 温度•(5) 离液离子•(6) 螯合剂四、亲和作用体系第二节亲和色谱原理•将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固定粒子共价偶联，可以特异性吸附或结合另一种分子，使另一种分子容易从混合物中得到选择性分离纯化。
•亲和作用分子对中被固定的分子称为其亲和结合对象的配基，亲和色谱的固定相是键合亲和配基的亲和吸附介质。
•操作一般分为进料、杂质清洗、目标产物洗脱和色谱柱再生等4个步骤。
配基不溶性母体载体或担体当用小分子化合为作为配基时，由于空间位阻作用，难于与配对的大分子亲和吻合，常在母体与间隔臂以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。
第三节亲和色谱介质•①酶的抑制剂与酶的活性部位结合•生物大分子或小分子化合物•②抗体单抗和多克隆抗体免疫亲和色谱•③A蛋白相对分子量约42000,与抗体结合,但不影响抗体与抗原结合可用于分离抗体-抗原复合体•④凝集素与糖特异结合的蛋白质的总称,如刀豆蛋白可用作糖蛋白、多糖、糖脂等的亲和配基。
《亲和色谱》课件
生物工程技术
利用生物工程技术改造蛋白质 或酶，提高亲和色谱的特异性
。
光学检测技术
结合光学检测技术，实现高灵 敏度、高分辨率的亲和色谱分
析。
亲和色谱在各领域的应用前景
生物医药领域
用于蛋白质、细胞、病毒等生物分子 的分离和纯化，为药物研发和疾病诊 断提供支持。
环境监测领域
用于水体、土壤、空气等环境样品中 污染物的分离和检测，为环境治理和 保护提供依据。
农药残留检测
亲和色谱可用于农药残留的检测，通过与农药分 子的特异性结合，实现对农药残留的高灵敏度检 测。
食品营养成分分析
亲和色谱可用于食品营养成分的分析，如维生素 、矿物质等，通过与特定配基的结合，实现对营 养成分的高效分离和检测。
亲和色谱在环境监测领域的应用案例
有毒有害物质检测
亲和色谱可用于有毒有害物质的检测，如重金属、有机污染物等， 通过与特定配基的结合，实现对有毒有害物质的高灵敏度检测。
食品安全领域
用于食品中农药残留、添加剂、毒素 等有害物质的检测和分离，保障食品 安全。
农业领域
用于植物生长调节物质、农药残留等 的分离和检测，促进农业可持续发展 。
亲和色谱的发展趋势和未来展望
智能化发展
通过自动化、智能化技术，提高亲和色谱的 分离效率和准确性。
高通量、高分辨率
开发高通量、高分辨率的亲和色谱技术，满 足大规模样品分析的需求。
稳定性差
亲和色谱的配体和载体在某些条件下可能不稳定，影 响实验结果。
适用范围有限
亲和色谱的适用范围相对较窄，仅适用于具有特异性 相互作用的目标分子。
亲和色谱的改进方向
开发通用型配体
通过研究不同类型分子间的相互作用，开发 出适用于多种目标分子的通用型配体，降低 实验成本。
亲和色谱法
2 间隔臂 在亲和色谱固定相中，需通过间隔臂将配位体连 接在基体上，由于间隔臂占据一定的机动空间。当配 位体与被测定的生物分子（尤其是生物大分子）产生 亲和作用时，有利于克服空间阻碍作用。 通式：
NH2 (CH2 )n R
R可为羧基、胺基或配位体自身
3 配位体 （1）染料配位体 大多是三嗪染料，主要用于蛋白质的分离与纯 化。 （2）定位金属离子配位体 它是将具有鳌合作用的有机官能团键合在间隔 壁的机体上，然后与Cu2+ ， Ni2+ ， Fe2+ ， Fe3+ 等金属离子生成稳定鳌合物，利用螯合物中的定 位金属离子与生物分子的特效亲和作用实现生物 分子的分离与纯化。
（6）共价配位体 主要用于含硫蛋白质分离。
三、亲和色谱的流动相 需使用pH值接近中性稀缓冲溶液，以保持其 生物活性。
亲和色谱使用的流动相：由磷酸盐、硼酸盐、乙酸 盐、柠檬酸盐具有不同pH值的缓冲溶液体系，有机碱三 羟甲基甲烷与盐酸顺丁烯二酸构成的缓冲溶液体系也有 较多应用。 此外，在生物大分子亲和色谱中，还广泛使用生物 研究中常用的非离子缓冲物。 如：N-(2-) 乙基-N-（2-磺化乙基）-哌嗪 （HEPES）、N,N,N',N'-四乙基乙二胺（TEEN）。
• 在载体（无机填料）上键合间隔臂（如环 氧，联氨等），再连接上配基（酶，抗原 等）。与和配基之间有亲和力的生物大分 子作用，对其进行分离。
一 、分离原理（生成锁匙结构络合物） 亲和色谱固定相上键合的配体与被分离的生物活 性分子间的相互作用，可用锁匙结构合物的生成来 表示：
二、 亲和色谱法的分类
（3）包合配合物配位体 包合配合物配位体是由主体分子与客体分子 间的特殊亲和作用而形成的。常用的主体分子为 β-环糊精、冠醚等。
色谱分离技术—亲和色谱分离技术
亲和层析介质
亲和配基
常用的亲和配基： 辅酶和磷酸腺苷
某些酶需要在辅酶存在的情况下才能表现出催化活性，即辅酶能与脱氢酶 和激酶之间通过亲和作用相互结合，因此这些辅酶可用作脱氢酶和激酶的亲和 配基。
主要的辅酶有NAD、NADP、ATP。
亲和层析介质
亲和配基
常用的亲和配基： 过度金属离子
铜、镍、锌等可与氮、硫、氧等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表 面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸吲哚基发生亲和结合作用。
的亲和能力有决定性影响。
亲和色谱法的操作方法
1.配基固相化（样品制备、装柱、平衡） 2.亲和吸附 3.解吸附 4.色谱柱再生
亲和色谱法的操作方法
1.配基固相化 将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和
吸附剂后装柱（称亲和柱），用一定pH和离子强度的缓冲液对柱子进行平衡。 2.亲和吸附
即进料和杂质清洗。将含有目标产物的料液连续通入亲和柱，目标产物吸 附在柱上，之后用缓冲液淋洗色谱柱除去未被吸附的杂蛋白。
亲和色谱法的操作方法
3.解吸附 解吸附即目标产物洗脱。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和
柱上的目的产物洗脱出来。
亲和色谱法的操作方法
4.色谱柱再生 用几倍体积的起始缓冲液进行再平衡，一般足以使亲和柱再生，但一些未
亲和层析介质
亲和层析介质由载体和配基组成
亲和载体
载体应具备的条件： 1.载体必须具有较好的理化稳定性和生物惰性，非专业吸附小。 2.具有大量可供活化和配基结合的化学基团，以供与配基共价连接之用。 3.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。 4.载体必须有稀松的网状结构使大分子能自由进入。 5.载体要有良好的机械性能，颗粒均匀。
亲和色谱名词解释
亲和色谱名词解释
亲和色谱（Affinity chromatography）是一种基于生物分子之间特异性相互作用的层析技术，用于分离和纯化特定的生物大分子，如蛋白质、核酸、糖等。
亲和色谱依赖于亲和剂（affinity ligand）与目标分子之间的特异性相互作用。
亲和剂通常是一种高度特异性结合到目标分子的物质，可以是抗体、酶、亲和标靶蛋白等。
这种特异性相互作用可以是通过离子交换、亲水性、金属离子的配位、疏水性等作用机制实现的。
亲和色谱的原理是将亲和剂固定在固定相上，并将混合物溶液通过柱床进行层析分离。
由于亲和剂与目标分子之间的特异性相互作用，目标分子可以选择性地结合到亲和剂上，而其他非目标分子则通过柱床被洗脱。
最后，目标分子可以通过改变缓冲条件、温度或添加特定的竞争性配体等方式进行洗脱。
亲和色谱具有选择性高、纯度好、操作简单等优点。
它广泛应用于生物医学研究、药物开发、生物制药等领域，特别适用于从复杂的混合物中高效分离纯化目标分子。
第九章_亲和色谱
9.3亲和色谱的介质
亲和吸附介质是必备材料，过程的关键。商品化 介质不能满足需要时，要自制其过程是首先选择适当 的配基，然后修饰固定相制成吸附剂。 亲和吸附介质的组成：
载体（骨架） 配基
间隔臂
（1） 载体： 载体为固定配基提供了基质，理想的载体应具备以下性 质： a.具有亲水性 b.具有大量化学基团 c.机械强度好 d.稳定性好 e.颗粒大小及孔径均匀 琼脂糖是应用最 普遍的，见右图。其他 还有纤维素、多孔玻璃 及其他化学合成介质。
C.配基的分类 ： a.特异性配基
只针对单一的物质进行特异的结合，特异性随条件变化，对不同的 分离对象为获得特异性配基常常需要实验筛选，这类配基选择性高，方 便，种类少；
b. 通用性配基或群特异性配基
可与一类或几种生物分子作用，配基为小分子。优点是容量高，花 费低。通过改善吸附和洗脱条件，可以弥补特异性较差的缺点。广泛采 用的有：三嗪染料、金属螯合物组氨酸、核苷酸等。
亲和作用体系: 亲和作用体系由亲和作用的分子对组成，可以是 大分子－大分子、大分子－小分子、大分子－细胞和 细胞－细胞各种体系。 常用体系：分为两类 高度特异性体系：分 子成一对一的关系 群特异性体系： 一个分子与同类基团 的各种分子相结合。
（3）间隔臂： 引出的原因：存在几何位阻； 定义：配基和载体中间加入一定长度的有机基团，称间隔臂。 见下图。 对间隔臂的要求：长度适当，具有亲水性。 常用的间隔臂：乙二胺，己二胺，6-氨基己酸，β-羟基丙氨 酸。 理想的间隔臂：长度合适，不进行非特异的吸附，无外加的 活性吸附点，有双功能反应基团。
亲和色谱
亲ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ层析原理图
影响亲和色谱的因素
• 1、上样体积 若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积 对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力较弱，样品浓度 要高一些，上样量不要超过色谱柱载量的5%~10%。 • 2、柱长 亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。如果 亲和介质的载量(同上 求解释T ^T)高，与目标产物(目标物)的 作用力强，可以选择较短的珠子(柱子);相反，则应该增加柱 子的长度，保证目标产物与亲和介质有充分的作用时间。 • 3、流速 亲和吸附时目标产物与配基之间达到结合反应平衡 需要一个缓慢的过程。因此，样品上柱的流速应尽量的慢， 保证目标产物与配基之间有充分的时间结合，尤其是二者间 结合力弱和样品浓度过高时。 • 4、温度 温度效应在亲和色谱中比较重要，亲和介质的吸附 能力受温度影响，可以利用不同的温度进行吸附和洗脱。一 般情况下亲和介质的吸附能力随温度的升高而下降，因此在 上样时可选择较低的温度，使待分离物质与配基有较大的亲 和力，充分地结合;而在洗脱时刻采用较高的温度，使待分离 物质与配基的亲和力下降，便于待分离物质从配基上脱落。 例如，一般选择在4℃进行吸附，25℃下进行解
亲和色谱法
生物工程领域 2016-6-13
生物亲和作用
• 定义：生物物质，特别是酶和抗体等蛋白 质，具有识别特定物质并与之相结合的能 力。这种识别并结合的能力具有排他性， 即生物分子能够区分结构和性质非常相近 的其他分子，选择性地与其中一种分子相 结合。这种特异性的相互作用称为生物亲 和作用（bioaffinity）或简称亲和作用 (affinity)。
例：抗原抗体的特异性结合
电镜图片
抗原抗体结合示意图
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亲和色谱分离蛋白质原理
亲和色谱分离蛋白质原理
亲和色谱是一种利用生物分子之间的特异性相互作用来分离和纯化蛋白质的色谱技术。
它的基本原理是利用固定在色谱柱上的亲和配体与目标蛋白质之间的特异性亲和力，从而实现蛋白质的分离和纯化。
具体来说，亲和色谱分离蛋白质的原理包括以下几个步骤：
1. 固定亲和配体：选择一种与目标蛋白质具有特异性亲和力的配体，并将其固定在色谱柱上。
常用的固定方法包括共价键结合、离子交换、亲和吸附等。
2. 上样：将待分离的蛋白质混合物加载到色谱柱上。
3. 特异性结合：目标蛋白质与固定在色谱柱上的亲和配体发生特异性结合，形成复合物。
4. 洗涤：用适当的缓冲液冲洗色谱柱，以去除未结合的杂质和非特异性结合的蛋白质。
5. 洗脱：改变缓冲液的条件，如pH、离子强度等，使目标蛋白质与亲和配体之间的亲和力降低，从而将目标蛋白质从色谱柱上洗脱下来。
亲和色谱具有高选择性、高效率、高纯度等优点，在蛋白质分离和纯化中得到广泛应用。
它可以用于分离和纯化各种蛋白质，如酶、抗体、受体等。
同时，亲和色谱也可以与其他色谱技术结合使用，如
离子交换色谱、凝胶过滤色谱等，以进一步提高分离效果和纯度。
亲和色谱
第五节 一般实验方法
是否有类专一吸附剂 有 溶胀Gel 无 选L
选偶联Gel 偶联L
装柱
安装仪器
平衡（2～3Vt） 加样吸附 洗去非吸附物
亲和柱
再生
洗脱液
脱盐
一、亲和吸附柱的预备
㈠. 亲和吸附剂选择或制备 效能小试： 据资料等先选择始缓冲液种类、I、pH、t ①. 用10Vt始缓洗，若目的物未流出，说明吸 附性能好，α＞0.9 ②. 不断加样到目的物流出，确定吸附容量 ㈡. 柱 H/D 高度专一 短 类专一 长 平衡 一般2～3Vt始缓
Specific eluents
+
Competing ligand in solution Elution of enzymes from Blue Sepharose by free NADH
+
Competing binding substance in solution Elution of glycoproteins from Con A Sepharose by a-D-methylmannoside
洗去杂蛋白
5倍床体积的起始缓冲液洗去未吸附物质，直至 紫外纪录曲线回到基线 亲和柱上存在较多的非特异性吸附，而目标分子 结合牢固，可选用介于起始缓冲液和洗脱缓冲液 之间的条件洗杂蛋白 例：起始缓冲液 0.05mol/L磷酸缓冲液 洗脱缓冲液 含1mol/L NaCl的磷酸缓冲液 可用含0.5 1mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗去杂蛋白
NADP
NADP依赖性脱氢酶
苯基硼酸盐 糖蛋白 Cibacron Blue F3G-A NAD(P)依赖性脱氢酶、激 酶、磷酸酶、白蛋白、干 扰素
Procion Red NAD(P)依赖性脱氢酶、干 HE-3B 扰素、抑制蛋白、纤溶酶 原
亲和色谱法的定义
亲和色谱法的定义
亲和色谱法是一种分离分析技术，基于物质之间的亲和性进行分离。
它利用亲和剂与待测物质之间的相互作用，通过固定在色谱柱上的亲和剂与样品中的目标分子间的相互作用，使目标物质与其他成分分离开来。
亲和色谱法可用于分离和纯化蛋白质、酶、抗体、受体以及其他生化分子。
它可以选择性地提取目标分子，同时不影响其他成分的分离。
亲和色谱法的广泛应用使得它在生物医学研究、制药工业以及其他领域得到了广泛的应用。
亲和色谱法原理
亲和色谱法原理
亲和色谱法是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。
亲和色谱法基于生物分子之间的特异性相互作用，如抗原-抗体、酶-抑制剂、激素-受体等之间的相互作用，来实现目标分子的纯化和分析。
亲和色谱法的原理是在固定相上固定亲和剂（affinity ligand），该亲和剂可以选择性地与所要分离的目标分子结合。
利用目标分子与亲和剂之间的非共价相互作用进行分离，从而实现目标分子的纯化目的。
在亲和色谱过程中，亲和剂与目标分子结合牢固，但其他非目标分子则能够快速通过。
亲和色谱法可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。
在亲和色谱过程中，流动相中的目标分子与固定相上的亲和剂结合，而非目标分子则随流动相快速通过。
通过改变流动相条件，亲和色谱法可以实现目标分子与亲和剂的可逆结合和分离。
总之，亲和色谱法是一种基于生物分子之间特异性相互作用的分离技术，利用固定相上的亲和剂与目标分子之间的非共价相互作用实现分离和纯化。
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聚丙烯酰胺-琼脂糖 多孔玻璃
1,6-己二胺, 6-氨基己酸 氨基丙基, 氨基己基
第四节 亲和吸附剂的制备
一、要求 ㈠. ㈡. 结 L与基质结合，对L-S结合无干扰； L为小分子有的需“手臂”，使L-S
合更有效； ㈢. 非专一吸附不大，以免吸附杂质； L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。
二、
偶联用Gel的选择 需考虑： ㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
第二节 亲和色谱配基 (ligand L) ㈠ 作为配体的条件
亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活
㈡常用系统
酶: 底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物 核酸: 互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物 激素: 受体、运载蛋白 抗体: 抗原、病毒、细胞 外源凝集素: 多糖、糖蛋白、细胞
亲和层析常用配体
连接臂先偶联至载体后接配体
四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备 Sep-(CH2)6-NH2 L-COOH AH-Sep Sep-(CH2)6-COOH L-NH2 CH-Sep 碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：
第三节 亲和层析载体
一、作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好
二、载体的选择
1.琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose） 2.聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污 剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力 比较弱的物质。 3.葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔径小。 4.纤维素： 非特异吸附严重，廉价，易得。 5.多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。
4.3
亲和色谱(层析)
Affinity Chromatography, AC 第一节 概述
原理 利用生物体中许多高分子化合物具有和 某些相对应的分子可逆结合的特性建立的 色谱法。 一、特点 高效、高收率、有浓缩效应，使用局限性
二、应用 高效从复杂混合物中得某一种物质； 基于生物功能可把有活性与无活性分开 三、基本过程 须找配基（它与底物专一可逆结合如下图）
例：酶 有单底物反应、双底物反应
单 E
A EA
P
E
EP
底物A、产物P或它们的类似物都可以
双底物依次
E
A
B
P Q
E EPQ EQ
EA EAB
须选择A、若选B则吸附时须加A
双底物随机
A（B） B（A） P（Q） Q（P） E E EA EA（B） EPQ
A、B都可选择 对A、B的选择仅取决于它们亲和势的 大小和固定化的难易程度。
三、手臂（Spacer arm） 在载体和配基间引入适当长度的“手 臂”，减少载体的空间阻碍，增加配基的 活动度。 示意图如下：
连接臂往往为由烃链组成的疏水性手臂（其长短 对吸附的影响大）或具氨基、羧基的亲水性手臂 （其长短对吸附的影响不大）； 疏水性手臂具体选择应考虑： ⑴ 分离物质分子量大小 ⑵ 亲和势大小 ⑶ 过长手臂易弯曲、折叠等； 最常用的连接臂有6-氨基己酸、1,6-己二胺和 3,3’-二氨基二丙胺。
亲和吸附剂的制备过程
封闭未反应的活化基团
载体上活化基团浓度
5~25mol/ml 偶联上的配体浓度 1~10mol/ml 封闭试剂 pH8.0，1mol/L乙醇胺 甘氨酸 巯基乙醇 室温反应1h
配体浓度评估 差示分析法
直接测定法 放射分析法 水解法
连接臂的连接 连接臂先接配体后偶联至载体
含组氨酸的多肽或蛋白 质
㈢ 配体的浓度
一般使用较高的固定化配体浓度 配体亲和力高，且本身带电则浓度须降低 配体浓度过高引起色谱畸变。 (与很多物质发生非特异性结合)
㈣ 配体的选择
1. 考虑亲和势 L+S LS Kl= [L][S]/[LS] 要求Kl在10-4～10-8mol/L之间 2. 与L的偶联不破坏L与S的结合 3. 需了解L-S的作用机制 如……
NADP
NADP依赖性脱氢酶
苯基硼酸盐 糖蛋白 Cibacron Blue F3G-A NAD(P)依赖性脱氢酶、激 酶、磷酸酶、白蛋白、干 扰素
Procion Red NAD(P)依赖性脱氢酶、干 HE-3B 扰素、抑制蛋白、纤溶酶 原
赖氨酸 纤溶酶、纤溶酶原、纤溶 酶原激活剂
单克隆抗体
特定抗原
过渡金属离 子
亲和层析过程演示
亲和吸附剂的构成 载体（基质）、配体、连接臂
说明： 1.偶联用Gel（须是活化偶联介质） 2.亲和吸附剂 高度专一亲和吸附剂 类专一亲和吸附剂
3.按相互作用力划分： 次级键——亲和色谱 配位键——螯合色谱 共价键——共价色谱 疏水键——疏水色谱
亲和层析的必要条件: 合适的配体（配基、ligand) 合适的载体（Matrix) 合适的吸附和洗脱条件
接有连接臂的亲和层析用载体
载体
连接臂 3-氨基丙基和琥珀酰氨基丙基 3,3’-二氨基丙基和琥珀酰二氨基丙基
供应商 Bio-Rad Bio-Rad ICN Pharmacia Serva Miles IBF Merck
琼脂糖
1,2-二氨基乙烷, 1-二氨基己烷, 3,3’-二氨基二丙胺 1,6-己二胺, 6-氨基己酸 3,3’-二氨基丙基胺, 对苯甲酰基-3,3’-二氨基丙基 胺 氨基烷基(2,4,6,8,10)
三、 由CNBr活化型Sep.4B制备 商品名：CNBr-Sepharose
一般步骤：
冻干粉பைடு நூலகம்
溶胀洗涤 溶解L ①
混合反应 ②
掩蔽 ③
洗去L（未结合）
成品
㈠.
溶胀和洗涤 用1mol/L HCl 溶胀洗涤除细碎粒子 ㈡. 偶联条件 注意： 前处理、偶联密度、缓冲液种类及pH ㈢. 掩蔽 偶联后有部分氰酸酯未偶联上 L，常利用 含-NH2的缓冲液或含-NH2的分子处理，将其 掩蔽。 ㈣. 洗去未结合L 用高-低交叉pH来洗（4～5次）
配体 目标分子 配体 目标分子
5’-AMP
ATP NAD
NAD依赖性脱氢酶、ATP 依赖性激酶
ATP依赖性激酶 NAD依赖性脱氢酶
Poly(U)
凝集素 蛋白质A /蛋白质G 钙调蛋白 肝素
真核mRNA、Poly(U)结 合蛋白
糖蛋白 IgG或IgG对应抗原 钙依赖性酶 某些凝固蛋白、血浆蛋 白、脂蛋白、核酸相关 酶、受体等