黑曲霉植酸酶液体发酵工艺研究

第14卷第3期武汉科技学院学报Vo1.14No.3 2001年9月JOURNAL OF WUHAN INS TITUTE OF SCIE NCE AND TECHNOLOGY Sep.2001

黑曲霉植酸酶液体发酵工艺研究

王亚林严建芳

(武汉工业学院生物与化学工程系武汉430022)

摘要研究了黑曲霉液体培养生产植酸酶的发酵工艺,研究了培养基碳源、诱导物、表面活性剂等因素对产酶的影响,对发酵时间、p H变化规律等进行了研究和分析。

关键词植酸酶黑曲霉发酵X

中图分类号Q815;Q814.9

植酸酶作为一种饲料和食品添加剂,在国内外已开始得到广泛应用,特别是由于其在改善环境方面的作用,更是受到人们的极大关注。植酸酶主要存在于植物及微生物中,由于在微生物中含量较高而具有较大的开发价值。目前,美国、荷兰和丹麦等国已先后运用发酵法生产植酸酶,我国也已在进行这方面的研究开发。可以预计,植酸酶制剂将有良好的市场前景。

1材料与方法

1.1菌种

黑曲霉(Aspergillus niger)W S201,武汉工业学院微生物室保存。

1.2培养基

1.2.1种子培养基:豆芽汁蔗糖培养基。

1.2.2摇瓶发酵培养基(%):葡萄糖3.0,淀粉7.0,NH4NO30.5,蛋白胨0.2,CaCl20.2,MgSO4# 7H2O0.05,KCl0.05,MnSO4.4;H2O0.03,pH值5.5。

1.3培养方法

配制培养基时适当加热、摇动或搅拌,使淀粉溶解成液态或胶状,121e灭菌20min。在30?1e下摇床培养3~5d(转速220~250r/min)。

1.4植酸酶的测定

植酸酶活力的定义:37e,pH5.5条件下每分钟从植酸钠中释放出1L mol无机磷所需的酶为1u。

酶活测定方法:取0.1ml含酶液加至一洁净试管中;加入0.9ml反应液,反应液为含0.5%植酸钠的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5),在37e恒温反应30min;加入1ml10%三氯醋酸终止反应;加入2ml显色液,摇匀后静置15~30min显色,显色液由1%钼酸铵50ml与3.66

X收稿日期:2001-06-26

作者简介:王亚林,男,副教授,在读博士生;研究方向:发酵工程、生化工程

32武汉科技学院学报2001年

g FeSO4#7H2O混合配制。将以上蓝色溶液在721分光光度计上于750nm处比色,读出吸光度A750nm,查标准曲线计算酶活(标准曲线为KH2PO4中磷含量与A750nm的关系曲线)。

2结果与讨论

2.1发酵培养基的研究

2.1.1培养基碳源含量的影响

选择葡萄糖和玉米淀粉为黑曲霉培养的碳源,葡萄糖和玉米淀粉用量之比为3B7,培养基碳源的含量指葡萄糖和玉米淀粉用量之和。不同碳源用量发酵试验结果见表1(每个试验均做2~3个重复,结果取平均值,下同)。

表1培养基碳源的含量对产酶的影响

试验编号12345

碳源含量(%)7.08.510.011.513.0

酶活(u/ml)32.346.536.137.434.0

试验中发现当碳源用量超过10%时,培养基粘度过大,造成培养基供氧不足,菌丝生长不良,产酶下降且残糖过高。因而碳源用量以8.5%为宜。

2.1.2植酸钠的添加效果

植酸酶为一种诱导酶,理论上底物或底物类似物对植酸酶的产生应该有一定的诱导作用。本试验选择植酸钠为诱导物,在培养基中少量添加,诱导植酸酶的产生,发酵产酶结果见表2。

表2植酸钠添加对产植酸酶的影响

试验编号123456

植酸钠(%)00.050.100.150.200.25

酶活(u/ml)13.824.124.531.022.925.8

表2结果表明:少量添加植酸钠后产酶迅速增加,说明植酸钠有明显的诱导作用。植酸钠用量在(0.05~0.15)%范围内时,产酶量可稳定在一个相对较高的水平,植酸钠用量过大则意义不大。

2.1.3表面活性剂的添加效果

黑曲霉产生的植酸酶是一种胞外酶,在培养基中添加少量的表面活性剂可提高细胞的通透性,有利于酶的产生。本试验选用吐温-80(TW-80)为表面活性剂,设计了几种不同的用量,发酵产酶结果见表3。

表3TW-80添加对产植酸酶的影响

试验编号12345

TW-80(%)00.050.100.150.20

酶活(u/ml)35.953.358.175.355.5

从表3结果可见,TW-80添加量为0.05%时,与不添加相比产酶增加明显;TW-80添加量为0.15%时,酶活达75.3(u/ml),产酶提高2倍以上;TW-80添加量继续增加,则产酶开始下降,这是因为过量的表面活性剂会对细胞产生伤害之故。2.2 发酵条件与过程研究2.2.1 培养时间与产酶的关系

黑曲霉的发酵培养分为两个阶段,细胞生长阶段和产酶阶段,发酵应在产酶高峰期结束。本试验研究了发酵时间与产酶的关系,试验结果见图1。

从图1可见,发酵前两天产酶水平极低,之后迅速提高,其中在72~84h 产酶维持在较高的水平,然后产酶开始缓慢下降。因此,发酵时间应为72~84h 。2.2.2 pH 值与产酶的关系

培养基初始pH 值与发酵产酶的关系见图2。结果表明pH 值为5.5效果较好。

试验中发现,接种后黑曲霉生长导致pH 下降,培养24h 其pH 值从5.5降至3.8左右,之后pH 值缓慢回升。为观察pH 值与产酶的关系,在培养至24h 人为调节pH 为5.5继续培养,结果显示这种调节对其产酶有一定的促进作用,但效果不是特别明显,这方面的工作有待继续,结果见图3、图4

。

图1 培养时间与产酶的关系 图2 培养基初始pH

值对产酶的影响

图3 发酵液p H 值随时间的变化 图4 发酵过程pH 、酶活随时间的变化

33第3期 王亚林 等: 黑曲霉植酸酶液体发酵工艺研究