黑曲霉发酵提取柠檬酸

黑曲霉发酵提取柠檬酸
实验一黑曲霉保藏菌的复苏
实验目的：了解黑曲霉保藏菌的生长状况和保藏菌的活化处理过程。

实验原理：能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉中的一些菌株都能够利用淀粉质原料大量积累柠檬酸。

目前国内主要利用黑曲霉（Aspergillus niger）通过固体发酵或液体深层发酵生产柠檬酸。

发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是微生物产生糖化霉首先将淀粉转变为葡萄糖，葡萄糖经过糖酵解途径（EMP）转变为丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶的作用下乙酰辅酶A和草酰乙酸合成为柠檬酸。

产生的柠檬酸经碳酸钙作用形成柠檬酸钙沉淀，再经稀硫酸作用释放出柠檬酸。

实验步骤：1、观察保藏菌的生长状况，记录PH
2、黑曲霉复苏培养基的配制
（1）、分别称取蔗糖30g，KNO3 1g, K2HPO4 1g, 麸皮10%，MgSO4.7H2O 0.5g, KCL 0.5g, FeSO4.7H2O 0.01g, 于500ml搪瓷缸中。

（2）、加蒸馏水100ml，调节pH至7.0-7.2
（3）、牛皮纸包扎，灭菌
3、保藏菌的活化扩增
（1）配制5ºBe’麦芽琼脂培养基
（2）20℃麦芽汁，糖度为5
（3）加0.7%的琼脂
（4）加热，使其沸腾
（5）分装与试管中，每管约3ml
（6）包扎灭菌，制成斜面培养基
（7）在超净工作台上划菌，包扎
（8）置于28~30℃培养箱中培养
实验要求：分析复苏和保藏培养基的区别，原因，营养成分的差异和操作的目的和意义。

并加注参考文献。

实验二黑曲霉一级种子的制备
实验目的：了解种子扩大培养的程序，比较复苏均至一级种子的生境变化。

实验原理：黑曲霉在生长过程中不仅需要有充足的营养成分，而且还需要一定的氧气环境等。

通过拌菌等增加菌种与培养基营养成分的充分接触，获得良好的生长。

实验步骤：1、观察活化的保藏菌生长状况，并记录。

2、在超净工作台上，将2-4管/组，活化的保藏菌分别加入约3mL双蒸水。

3、在混匀器上，将活化的保藏菌制成孢子悬液。

4、在超净工作台上，将孢子悬液一次倒入察氏培养基中。

5、用灭过菌的玻棒，将菌液和培养基充分拌匀。

6、测定此时的pH值，并记录。

7、取5ml充分拌匀的菌液培养基，用滤纸过滤。

8、收集滤液于20ml 离心管中。

9、3000r/min, 离心5min。

10、收集上清于试管中，标记后置于-4℃冰箱中。

11、每隔2天，用灭过菌的玻棒，在超净工作台上拌菌。

同时测定pH，并取5ml样品，以上述做法，将收集的上清液保藏于-4℃冰箱中。

注意：标记时，要标明实验日期，组别，班号。

实验三黑曲霉二级种子培养基的制备
实验目的：了解菌种扩大培养基的成分差异及作用。

实验原理：根据黑曲霉种子生长的不同阶段和培养目的的不同，所需营养成分也有差异。

并为了使黑曲霉种子能够更好的适应发酵培养基的生长而要进行不断的种子驯化。

实验步骤：1、观察黑曲霉复苏种子的生长状况，并记录。

2、配制二级种子培养基（每组含量）
（1）分别称取麸皮30g，膨化大豆粉12g，于500ml搪瓷缸中。

（2）加入蒸馏水100ml，充分拌匀。

（3）调节pH值至5.0
（4）用折叠成8层的纱布覆盖搪瓷缸口。

（5）用牛皮纸包扎，灭菌。

实验四黑曲霉二级种子的培养
实验目的：了解种子扩大培养的级数确定和种子的驯化。

实验原理：为了有效的获得一定数量的发酵菌种，必须对复苏培养的菌种进行扩大培养，并使菌种能够更好的适应发酵培养基，而对二级种子培养基的营养成分做了调整。

实验步骤：1、在操作台上，迅速将一级种子拌入二级种子培养基中
2、用灭过菌的玻棒充分拌匀。

3、测定pH值
4、取出约5ml的拌种后的培养基
5、将剩余培养物，用8层纱布+牛皮纸包扎。

6、放于28℃恒温培养箱中培养
7、将取出的5ml培养物用滤纸过滤（注意多冲洗数次）
8、放于20ml离心管中，3000r/min, 离心5min。

9、收集上清于试管中，标记后置于-4℃冰箱中。

10、每隔2天，测定pH，并取5ml培养物，以上述做法，将收集的上清液保藏于-4℃冰箱中。

实验五黑曲霉发酵培养基的制备
实验目的：了解发酵培养基的基本成分。

比较发酵培养基与种子培养基的成分差异。

实验原理：黑曲霉发酵培养的目的是获得柠檬酸次生代谢物，因此要求在低氮高碳源的环境条件。

而黑曲霉种子培养在高氮高碳源的培养基中，更有利于种子的健壮生长。

实验步骤：1、观察黑曲霉二级种子培养基，并取样做记录。

2、分别称取玉米面200g，麸皮25g，膨化大豆粉25g于500ml搪瓷缸中。

3、加水200ml，搅拌均匀。

4、测定pH值。

5、包扎、灭菌。

6、同时将小搪瓷盘包扎灭菌，每组1个。

实验六黑曲霉生长过程中碳含量的变化测定
实验目的：了解培养基中糖含量的变化，描绘碳源在黑曲霉生长过程中的代谢含量的变化。

实验原理：黑曲霉生长过程中所需的碳源主要通过糖来提供，糖的提供方式有多种，如淀粉、玉米粉、麸皮和葡萄糖等，无论哪种糖都是要水解成单糖参与黑曲霉的生长代谢。

因此，我们用总糖含量的测定，来探究黑曲霉生长过程中的碳源走向。

实验步骤：1、葡萄糖标准曲线的制备
精确称取标准葡萄糖4mg于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成0.04mg/mL的葡萄糖标准溶液。

分别精确吸取0.0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL和2.0mL，加水至2.0mL，然后加入6%苯酚溶液1.0mL，边摇边迅速滴加5.0mL浓硫酸，摇匀，静置l0min，在490nm 处测定溶液的吸光值。

以吸光值为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2、糖含量的测定方法
取2.0mL溶液，加入6%苯酚溶液1.0mL及浓硫酸5.0mL，静置10min，摇匀，沸水浴15min后冷却至室温，使用可见分光光度计测定其吸光
值。

实验七黑曲霉生长过程中铵根离子的测定
实验目的：黑曲霉生长过程中需要消耗大量的碳源和氮源，氮源的提供途径有很多，参与代谢的只有N+,因此通过对NH4+ 的测定来探究氮源的代谢。

实验原理：铵根离子的测定方法为苯酚一次氯酸盐法。

试验步骤：1、配制A液:5g苯酚和25mg硝普钠溶于100ml水中;
2、配制B液:2ml次氯酸钠溶液和2.5g氢氧化钠溶于100ml水中。

3、测定时吸取0.2ml样品溶液于试管中，
4、加入3.8ml0.03mM硫酸（pH3.5)，
5、分别加入A、B液各0.5ml，
6、37℃水浴加热20min，
7、于625nm处测定吸光度。

分别取0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM的硫酸铵做成标准
曲线
实验六黑曲霉发酵菌的接种及培养
实验目的：了解黑曲霉发酵原理及发酵过程中的影响因子有哪些？实验原理：黑曲霉生产柠檬酸需要经过EMP和戊糖磷酸HMP途径共同完成。

其比率为EMP/HMP=2:1。

首先糖被氧化生成丙酮酸经氧化脱羧酶体系，生成乙酰辅酶A 经TCA生成中间代谢产物异柠檬酸脱氢脱羧生成а-酮戊二酸
HMP途径主要存在于孢子形成阶段，它提供合成核酸所需的前体物质。

因此EMP途径在黑曲霉柠檬酸产生菌中起主要作用。

实验步骤：。