病毒血凝和血凝抑制试验以新城疫为例
新城疫抗体水平检测
新城疫抗体水平检测文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-新城疫的血凝和血凝抑制试验高若开 一、实验目的1.掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法。
2.分析血凝和血凝抑制试验的影响因素，用以确定最佳免疫时间、判定免疫效果和辅助疾病诊断。
二、实验内容1.血凝试验(HA)检测新城疫抗原2.血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体 三、实验原理1.血凝试验（HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA ）,也称直接血凝反应。
2.血凝抑制试验（HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。
这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI ）反应，也称血凝抑制反应。
病毒颗粒红细胞四、实验材料离心机、恒温箱、冰箱、振荡器、96孔血凝版（5块）、微量移液器（20-100微升可调）、吸液尖（若干）、洗耳球、离心试管、普通试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、ND 标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。
五、实验步骤 （一）抗凝剂的配制将1克柠檬酸钠用25毫升生理盐水稀释备用。
1毫升抗凝剂可用于采集9毫升血液。
（二）10%红细胞悬液的配制1、用注射器吸取0.5毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞4.5毫升。
2、1500转离心5分钟，吸弃上清液。
3、用5-10倍生理盐水1500转洗涤3次，前两次5分钟，后一次10分钟。
4、吸弃上清液，用吸量管吸取红细胞，配制成10%红细胞悬液。
5、2-6摄氏度储存，备用。
（三）血凝试验（HA)1.在血凝板上第一排的1－12孔内各加入50ul 生理盐水抗体抗原2.将系苗用生理盐水5毫升稀释，在第1孔内加入50ul病毒抗原，然后依次倍比稀释至第11孔，最后弃50ul。
01实验一 病毒血凝和血凝抑制试验
弃 去 25
25 25
振荡混 合后 37℃ 1030min 振荡混 合后 37℃ 45min
血清
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
1%红 细胞
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
结果
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
抑制 价
32
16
8
4
2
1
1：21
1
孔号
1
原液
2
1：21
3
血抑制试验（HI） 4 5 6 7 8 9 10
1：23 1：24 1：25 1：26 1：27 1：28 1：29
11 12
1： 210
备注
稀释 度 生理 盐水
1：22
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
病毒 液
25
25
从上一稀释孔的混合液中吸取25 μ L致下一孔
三、实验材料 新城疫病毒液0.1mL 1%鸡红细胞50mL 生理盐水50mL 阳性血清0. 5mL 96孔“U”形或“V”形微量反应板 25μ L定量移液管 滴头
四、实验内容及操作程序 1．血球凝集试验（HA） 以新城疫病毒为例，操作 过程如下（表10-1） • （1）在96孔“V”形微量反应板上进行，自左至 右各孔加25μ L生理盐水。 • （2）于左侧第1孔加25μ L病毒原液或收获液，混 合均匀后，吸25μ L至第2孔，混合均匀后，吸 25μ L至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃 25μ L，稀释后病毒稀释度为第1孔1:2，第2孔1:4， 第3孔1:8……。最后1孔为对照。
实训九 病毒的血凝及血凝抑制试验(ok)
实训九 NDV的血凝及血凝抑制试验（微量法）目的要求熟练掌握病毒的血凝及血凝抑制试验（微量法）的操作方法及结果判定，明确其应用价值。
仪器及材料pH7.2生理盐水、1％鸡红细胞悬液、NDV、新城疫病毒待检血清、微量血凝板（96孔V型板）、微量移液器（带吸头）、微型振荡器、温箱、离心机、天平、注射器。
方法与步骤（一）病毒的血凝（HA）试验1．1％鸡红细胞悬液的制备（1）采血先在注射器中吸入抗凝剂（3.8％枸橼酸钠液）1ml，采成年健康鸡血，心脏或静脉采血3-4ml。
（2）离心洗涤共3次，每次2000r/min，5min，每次离心后弃去上清液和白细胞，仅留纯的红细胞，最后读出红细胞的体积。
（3）配制用生理盐水将纯的红细胞稀释成体积比为1%的红细胞悬液。
2．操作术式振荡1min，室温(18℃～20℃)下作用30～40min,或置37℃恒温培养箱中作用15～30min观察结果（1）加生理盐水 1-12孔，每孔中分别加入50μl。
（2）NDV病毒液倍比稀释换吸头，吸取50μl病毒液，加于第1孔的生理盐水中，并用移液器吹打3～5次使液体混和均匀，然后取50μl移入第2孔，混匀后取50μl移入第3孔，依次倍比稀释到第11孔，第11孔中液体混匀后从中吸出50μl弃去。
第12孔不加病毒抗原，作盐水对照。
（3）加1%红细胞悬液换吸头，1-12孔，每孔中分别加入50μl。
加样完毕，振荡1min ，室温（18～20℃）下作用30～40min ，或37℃恒温箱中作用15～30min ，观察并判定结果。
3．结果判定及记录完全凝集（＋）：红细胞呈伞状分布于反应孔底层。
伞完全不凝集（－）：红细胞呈点状沉淀于反应孔底层。
点不完全凝集（±）：介于＋与－之间。
病毒的血凝价（或称血凝滴度）：能使一定量红细胞发生完全凝集的病毒最大稀释倍数为该病毒的血凝滴度，或称血凝价。
（二）病毒的血凝抑制（HI ）试验采用同样的血凝板，每排孔可测1份血清样品。
血凝抑制实验报告3篇
血凝抑制实验报告（通用3篇）血凝抑制试验报告篇1一、原理流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体的结构，HA试验由此得名。
HA蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而消失抑制现象。
二、应用该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采纳的试验方法。
可用于流感病毒分别株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型全都的感染或免疫抗体。
三、缺点只有当抗原和抗体HA亚型相全都时才能消失HI现象，各亚型间无明显交叉反应；除鸡血清以外，用鸡红细胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非特异凝集素；需要在每次试验时进行抗原标准化；需要正确判读的技能。
四、试验步骤1 阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。
（3.8%枸橼酸钠（3.8g枸橼酸钠，100ml超纯水），101 kPa,20min高压灭菌，4℃保存备用,保存期1个月）。
2 10%和1%鸡红细胞液的制备2.1采血用注射器吸取阿氏液约1mL（3.8%枸橼酸钠），取至少2只SPF 鸡（假如没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合（3.8%枸橼酸钠），放入装10mL 阿氏液（生理盐水）的离心管中混匀。
2.2 洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500～1800 r/min 离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液（生理盐水），轻轻混合，再经1500～1800 r/min 离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20 mL（生理盐水），轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。
2.3 10%鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800 r/min 8分钟，弃去上清液，精确观看刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合匀称。
鸡新城疫血凝和血凝抑制实验只是分享
• 【病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：L） 】
孔号 滴度lg2 材料
8单位病毒 4单位病毒 被检鸡血清
0.6%红细胞
结果观察
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
病
1
2 3 4 56 78
9
10
毒对 照
对照
50 50 50 50 50 50 50 50
50 50 50 50 50 50 50 50
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
（二）加样
1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50L 生理盐水。
2. 于左侧第1孔加50L病毒液，混合均匀后，吸 50L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50L； 第12孔为红细胞对照。
3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液 50L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。
• 【方法】 • 1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。 • 2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，先在第1孔加50L生
理盐水。 • 3.自第3孔至12孔各加50L 4个血凝单位的新城疫病毒液。 • 4.第１孔加被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L至第2孔，依此倍比稀释至第
二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)
• 【材料】 除血球凝集试验所用材料外，血清
取鸡免疫血清。
鸡群卵黄抗体的制备
1.取鸡蛋卵黄20ml，加入等量生理盐水， 振荡，摇匀。
2.加入等量氯仿40ml，振荡30分钟。 3.取振荡的卵黄液3000～4000rpm30分钟。 4.取上清液作为抗体检测材料
二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)
血凝试验（HA）和血凝抑制试验 (HI)
血凝抑制实验报告三篇
血凝抑制实验报告血凝抑制实验报告三篇血凝抑制实验报告一禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。
该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。
但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。
一、血凝试验操作程序1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。
2、吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。
3、从第1孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25 μL。
第三排孔至第四排孔同上操作。
4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。
5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30 min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。
6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。
以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）二、血凝抑制试验操作程序1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。
（即1HAU抗原除以4）2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25 μLPBS。
3、在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25 μL。
4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。
5、在第1~12孔各加入25 μL 4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30 min。
新城疫抗体水平检测
新城疫的血凝和血凝克制试验高若开一、实验目的1.掌握血凝和血凝克制试验的基来源理、操作方法和结果判断方法。
2.剖析血凝和血凝克制试验的影响要素，用以确立最正确免疫时间、判断免疫成效和协助疾病诊疗。
二、实验内容1.血凝试验 (HA) 检测新城疫抗原2.血凝克制试验 (HI) 检测新城疫抗体三、实验原理1.血凝试验（ HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝聚，这类凝聚红细胞的现象称为血凝（HA ）,也称直接血凝反响。
病毒红颗细粒胞2.血凝克制试验（ HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这类抗体的量足以克制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不可以与病毒颗粒或血凝素直接接触。
这时红细胞的凝聚现象就被克制，称为红细胞凝聚克制（HI ）反响，也称血凝克制反响。
抗原抗体I am late！四、实验资料离心计、恒温箱、冰箱、振荡器、 96 孔血凝版（ 5 块）、微量移液器（ 20-100 （若干）、洗耳球、离心试管、一般试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、微升可调）、吸液尖ND 标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。
五、实验步骤（一）抗凝剂的配制将 1 克柠檬酸钠用25 毫升生理盐水稀释备用。
1 毫升抗凝剂可用于收集9 毫升血液。
（二） 10%红细胞悬液的配制1、用注射器汲取 0.5 毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞 4.5 毫升。
2、 1500 转离心 5 分钟，吸弃上清液。
3、用 5-10 倍生理盐水 1500 转清洗 3 次，前两次 5 分钟，后一次10 分钟。
4、吸弃上清液，用吸量管汲取红细胞，配制成10%红细胞悬液。
5、 2-6 摄氏度储藏，备用。
（三）血凝试验（ HA)1.在血凝板上第一排的1－ 12 孔内各加入 50ul 生理盐水2.将系苗用生理盐水 5 毫升稀释，在第 1 孔内加入 50ul 病毒抗原，而后挨次倍比稀释至第11 孔，最后弃 50ul。
实验一_鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法
鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法1．本次实验的目的和要求掌握鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。
2．实验内容或原理某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HA)。
这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验(HI)。
3．需用的仪器或试剂等动物健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。
器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。
药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS）；（3）Alsever细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清4．实验步骤(1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。
(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。
（3）免疫机体抗体效价的测定：3.鸡新城疫（ND）的HA和HI（1）试验准备①抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原，进行试验。
②0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。
如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。
红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。
再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。
血凝和血凝抑制试验
血凝和血凝抑制试验随着养殖业的飞速发展和广大养殖户科学意识的不断提高，人们普遍认识到实验室检测技术在临床应用的重要性。
下面简单介绍一下鸡新城疫微量血凝试验和血凝抑制试验的注意事项及操作方法。
应用：用于新城疫、产蛋下降综合征和传梁性支气管炎等的母源抗体的检测、雏鸡首免日龄的确定、疫苗免疫后的免疫应答的监测、临床鸡病的鉴别诊断等。
下面以新城疫病毒为例，介绍血凝和血凝抑制试验的方法：注意事项：一、样本要具有代表性：所采样本要能代表整体，通常采用四角加中间的随机取样法，并且确定适当的样品数量，一般1000只以下的鸡群采样率在2～5%；5000只以下1～2%；5000只以上0.5～1%。
对产蛋期间的鸡群可采鸡蛋；对雏鸡或青年鸡，可采血。
方法是：取青霉素小瓶，洗净后用蒸馏水冲洗、控干水分，并注意不要用消毒剂，以免影响结果。
每只鸡采血量在1ml左右，最好不低于1ml，在室温下静置至血清自然析出。
二、四单位抗原的准确性：要获得准确的监测效果，先做红血球的凝集试验，即测得抗原的血凝价，尔后前移2孔作为四单位抗原的稀释度。
三、红血球洗脱的充分性：原则上，新城疫检测所用的红血球应来源于非疫苗免疫过的健康公鸡，但实际上却多采用免疫过疫苗的健康公鸡，有时甚至是病鸡。
因此，对红血球的洗脱的次数要多、要充分，并注意转速和时间，通常采用五次变速离心法：前四次为每分钟1500转，每次5分钟，最后一次为每分钟3000转，持续7～8分钟。
另外，洗红血球过程中，应注意动作要轻，玻璃仪器之间尽量减少碰撞，以免造成红血球破裂而影响结果。
四、结果判定的及时性：检测中，每次试验均应设抗原与生理盐水对照，加入红血球后，每隔5分钟观察一次，一旦两列对照孔图像清晰地显示出来时，应立即对样本进行结果判定，过早过晚都会影响判定结果的准确性。
血凝与血凝抑制试验的操作方法一、材料与仪器：新城疫抗原、1%鸡红血球、抗凝剂、生理盐水、被检血清、离心机、吸管、滴管、洗耳球、烧杯、量筒、注射器、长针头、96孔V型医用血凝板、微量移液器、微量振荡器、恒温培养箱、冰箱等。
鸡新城疫血凝(HA)及血凝抑制(H1)试验
鸡新城疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验（一）目的意义：1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法；2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。
(二)基本原理：许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。
血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。
（三）器材及试剂:待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。
（四）实验步骤：一、血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul 为红细胞对照；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12 。
3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。
4、室温静置10-30分，观察结果（见下表）。
5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI 效价，用2n表示。
二、血凝抑制试验（HI）取一96孔板，按以下步骤操作：1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。
2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释倍数为21~212 。
3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀；4、室温静置20min；5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。
鸡新城疫病毒的红细胞凝集试验和凝集抑制试验操作方法
鸡新城疫病毒的红细胞凝集试验和凝集抑制试验操作方法摘要：NDV是引起新城疫的病原体，新城疫又叫亚洲鸡瘟。
本病具有高度的传染性，发病急，致死率高。
对养禽业发展构成了严重威胁，是世界养禽业最重要的疾病之一。
为有效地控制新城疫病毒，对21日龄的1000雏鸡注射鸡新城疫灭活苗进行免疫，并对其抗体效价进行监测。
红细胞凝集试验和凝集抑制试验是监测鸡新城疫免疫状态的一种简便，快捷，经济的血清学方法。
次试验可作为监测鸡群免疫效果，疫苗使用效果和制定合理免疫程序的依据。
关键词：鸡新城疫抗体效价监测试验为掌握病毒的红细胞凝集试验和凝集抑制试验的操作方法，对21日龄的1000只雏鸡注射了鸡新城疫灭活苗后9天，进行随机抽样检查。
作HI抗体滴度的测定，操作方法如：1.原理:NDV一个很重要的生物学特性就是能吸附于鸡，火鸡，鸭，鹅及某些哺乳动物（人，豚鼠）的红细胞表面，并引起红细胞凝集，而这种血凝现象能被NDV的抗体的抑制。
2.器材：2---5mL注射器、离心管、离心机、试管架、生理盐水、鸡新城疫疫苗弱毒Ⅳ系、1％鸡红细胞悬液。
3.操作步骤：①红细胞悬液的制作（0.7—1﹪）浓度低反应时间越长。
阿氏液：血液=1：1 肝素：血液=1：10取2mL阿氏液加2mL成年鸡血液于离心管中摇匀，放入离心机1500rPm,5min.吸取上清液及上层白细胞后加适量生理盐水混匀离心，重复三次，用生理盐水配成1﹪浓度。
②HA孔号(uL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12生理盐水50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘50鸡新城疫病毒50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50红细胞50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50振荡器上振荡1—2min. 18℃--22℃作用15min后观察结果。
结果# # # # # # # + ————结果表示病毒液的HA效价为27 ，HI时病毒Ag液50uL内须含4个凝集单位，测病毒Ag液作32倍稀释。
新城疫抗体监测-血凝与血凝抑制试验中影响因素及解决办法
·60·试 验 研 究农业开发与装备 2015年第12期摘要：对新城疫抗体监测-血凝与血凝抑制试验中的各种影响因素逐一进行分析，并提出解决办法和具体操作方法。
关键词：新城疫抗体监测；血凝与血凝抑制试验；影响因素；解决办法近年来，城区养鸡业的发展日益衰减，赛鸽和肉鸽的饲养占据了大半的养禽业的领域，公棚鸽饲养日益兴起，而在公棚中，新城疫极其变异是对公棚鸽最大的危害。
为了加强禽类疫情监测工作，及时掌握疫情动态和免疫效果，有效防止疫情发生和传播，减少经济损失。
新城疫抗体监测工作是实验室工作的重要部分，血凝和血凝抑制试验是目前实验室监测新城疫抗体中最常用的方法，此方法在实验中操作简单，判定方便，但是很容易因操作不规范，技术不娴熟而影响实验结果的准确性。
现对实验结果的准确性的影响因素进行了简单分析讨论，以供大家参考。
1 红细胞的配制1）由于鸡的个体差异，红细胞对病毒敏感性也不同，从而影响HI效价，一般需要采集至少三只公鸡或无新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液混合在一起，放入离心管中，加入3～4倍体积的PBS 混匀，以2 000r/min离心5～10min，去掉血浆和白细胞层，重复洗涤三次，这样可以减少自凝现象的干扰。
2）有抗体鸡提供的红细胞需要多洗涤几次，以便减少血液中的抗体对实验结果的影响。
洗好的红细胞，最后吸取压积红细胞用PBS配置成0.5%～1%浓度较为合适，浓度过大时，血点过大，浓度过小时，沉降的血点太小，不易判断，并且沉降速度慢。
2 PBS稀释液的配制1）稀释液的pH为7.0～7.2时红细胞沉淀最充分，也最易判断。
稀释液的pH过于小，一般小于6.0以下，红细胞容易出现自凝现象，pH为7.6以上凝集的红细胞容易洗脱加快。
所以最好配制的稀释液pH值为7.2。
配制好的稀释液需要在121℃，15min条件高压灭菌后4℃保存备用，时间不宜过长保存，否则会出现污染，对实验结果有影响，出现跳孔现象或试验不成立等等。
鸡新城疫血凝和血凝抑制实验
精选2021版课件
14
50
50
50
生理盐水
病毒液 50
50
50
50
50 50 50
50
0.6%红细 50 50 50 50
50 50 50
50
胞
微型振荡器1min，静置30min
50
50
50
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50
50
50
弃50
结果观察 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++
+
+
-
-
以100% 凝集的病毒最大稀释精度选为20该21病版课毒件血凝价，即为一个凝集单位 8
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
• 【 结果判定 】
• 置于振荡器上振荡1分钟，静置后30 min开始观察结果，待对照孔 红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底， 平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉 于孔底呈点状。
• 以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单 位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为 1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32， 即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。
血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)
精选2021版课件
3
鸡新城疫血凝和血凝抑制
鸡新城疫的发生与鸡的年龄、品 种、饲养管理条件、环境卫生状
况等因素有关。
02
鸡新城疫血凝试验
血凝试验的原理
血凝试验的原理是利用病毒表面的特殊结构与红细胞表面的糖蛋白发生特异性结合， 使红细胞发生凝集，从而检测病毒的存在。
病毒表面的糖蛋白与红细胞表面的糖蛋白结合后，会引起红细胞发生凝集，形成颗 粒状沉淀，这一过程称为血凝。
02
一旦发现疫情，立即采取隔离、扑杀、消毒等措施，防止疫情
扩散，同时对受威胁鸡群进行紧急免疫接种。
加强疫情报告和信息交流
03
及时向上级主管部门报告疫情，加强与相关单位的信息交流，
共同应对疫情挑战。
05
鸡新城疫研究展望
新疫苗的研究和开发
01
新型疫苗种类
研究开发多价、多型、基因工程 和活载体疫苗，以应对不同病毒 株的变异。
胞。
血凝试验的结果判定是定性的，可以确定病毒的存在与否，但不能确定 病毒的含量。如果需要定量测定病毒含量，需要采用其他方法。
03
鸡新城疫血凝抑制试验
血凝抑制试验的原理
血凝抑制试验是一种利用病毒的特性，通过检测病毒与特异 性抗体结合后对病毒血凝活性的抑制作用，来检测和鉴定病 毒抗体的血清学方法。
病毒表面的一种或多种糖蛋白是引起血凝的物质，而特异性 抗体与病毒结合后，能够阻断病毒表面的糖蛋白与红细胞表 面的受体结合，从而抑制血凝现象。
控制人员和物品流动
限制无关人员进入鸡场，对进出场区的人员和物品进行严格消毒， 防止病毒随人员和物品传入。
鸡群隔离饲养
将不同日龄、健康状况的鸡群分开饲养，避免交叉感染和疫情扩散。
疫情监测和控制
定期监测鸡群健康状况
01
病毒血凝和血凝抑制试验--(以新城疫为例)
生理盐水 病毒液 25「 25卩1\25^125^1 25 ”1 25g1 2 25gl 4 25g1、25g1 Q5 25^1 25 卩1弃去实践二病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）实践目的：1 •掌握血凝（HA 和血凝抑制（HI ）试验的原理2 •掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法实践原理：某些病毒（如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等）能够与人或动物的红细胞发生凝集， 此即为 红细胞凝集现象。
这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体 （免疫血清）所抑制, 即为红细胞凝集抑制试验。
实践内容：1.红细胞凝集试验（HA 试验）主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数（抗原单位）。
有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。
鸡新城疫病毒的HA 试验现采用微量法，在 V 形微量反应板上进行。
（1） 首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴 （25卩I ）。
（2）用微量移液器取病毒抗原液 25卩1加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25^1液体小心地移至第 2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25 ^1液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2〜1:2048，第12孔为红细胞对照。
（3） 再以微量移液器每孔加1.0 %红细胞悬浮液1滴（25卩I ）。
（4） 在振荡器上振荡混匀约 I 〜2分钟，再置37 C 作用15分钟后观察结果。
（5）每次测定样品都应同时做红细胞对照。
表1鸡新城疫血凝效价（HA ）的测定术式（微量法）孔号1 234567891011 12病毒稀释倍数 1:2 1:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048 对照1%红细胞悬液 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 感作 置振荡器上混匀1〜2分钟，放37 C 静置15分钟结果例示 # # # # # # # ++ - - - -表示%完全凝集 表示%凝集 表示不凝集结果判定：将反应板倾斜成45度角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀, 表明红细胞未被或不完全被病毒凝集； 如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
血凝抑制实验报告三篇
血凝抑制实验报告三篇血凝抑制实验报告一禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。
该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。
但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。
一、血凝试验操作程序1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。
2、吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。
3、从第1孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25 μL。
第三排孔至第四排孔同上操作。
4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。
5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30 min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。
6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。
以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）二、血凝抑制试验操作程序1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。
（即1HAU抗原除以4）2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。
3、在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL 加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25 μL。
4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。
5、在第1~12孔各加入25 μL 4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30 min。
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实践三病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）实践目的：
1．掌握血凝（HA）和血凝抑制(HI)试验的原理
2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法
实践原理：
某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为
病毒稀释倍数1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照生理盐水
病毒液
1％红细胞悬液25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl
# 表示100％完全凝集++ 表示50％凝集- 表示不凝集
表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
能使100％红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。
如上例：病毒液的HA效价为1:128，HI试验时，病毒抗原液25微升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成128/4＝32倍的稀释液。
生理盐水225µl
被检血清
4单位病毒液25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl 振荡器上振荡1～2分钟，放37℃作用20分钟
1%红细胞悬液25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl 振荡器上振荡1～2分钟，放137℃作用15分钟
结果例示-------++##-#注：- 表示不凝集、++ 表示部分凝集、# 表示完全凝集。
淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数(10g2)表示。
如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为1：128或HI效价为7(10g2)。
2．根据血凝价将新城疫病毒稀释成4个单位病毒液，每三位学生做一个血凝抑制试验，检测待检血清的血凝抑制效价，记录试验结果
3．回答问题：
（1）病毒的血凝和血凝抑制试验的原理是什么？
（2）病毒血凝反应是抗原抗体反应吗，为什么？
（3）病毒血凝抑制反应是抗原抗体反应吗，为什么？
实践三病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）
（一）实践目的：
1、掌握血凝及血凝抑制试验的基本方法及原理
2、掌握鸡新城疫的试验室诊断技术。
（二）实践内容与基本要求：
实践原理：某些病毒，如鸡新城疫、禽减蛋综合症等，有能凝集动物红细胞的特性，此即红细胞凝集现象。
这些病毒囊膜上有糖蛋白血凝素，能与动物的红细胞表面的糖蛋白受体结合，发生红细胞凝集现象。
可以利用这一特性判断被检材料中有无病毒的存在，并可以测定病毒的效价。
1、血凝试验：常多用感染鸡胚液进行，凝集价可达1:160---1:640也可采用急性病例的组
操
型、
）
倍
采血法：先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至6~8cm长。
将管一端烧融封口，待凝固析出血清后以1000r/min离心5分钟，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中，若需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去，滴融化石蜡封口，于0o C保存。
（四）实践方法
操作方法
4.1 微量血凝试验
4.1.1 于微量血凝板的每孔中滴加磷酸缓冲盐稀释液50ul，共滴四排。
4.1.2 吸取1:5稀释抗原滴加于第一列孔，每孔50ul，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11孔各吸取50ul弃之。
最后一列不加抗原作对照。
4.1.3 于每孔加入0.5%红细胞悬液50ul。
4.1.4 置微型振荡器上振荡1分钟，或手持血凝板绕圆圈混匀。
4.1.5 放室温下（18~20oC）30~40分钟，根据血凝图象判定结果。
以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。
每次四排重复，以几何平均值表示结果。
4.1.6 计算出含4个血凝单位的抗原浓度，按式（B1）进行计算。
抗原应稀释倍数=血凝滴度/4……………………..(B1)
上述材料全部按顺序加完后，振荡96孔板，使红细胞与病毒充分接触，然后置于20-22℃室温中静置，自第15分钟开始观察结果，每5分钟检查一次，至60分钟结束，观察结果时注意不要摇震96孔板。
如果被检材料中有病毒的存在，就会出现红细胞的凝集现象，红细胞出现凝集反应者,凝集成片或碎片,呈伞状铺于管底,不凝集的红细胞沉积于管底,呈一小圆点,将板倾斜,可以看到沉积于底板上的红细胞沿倾斜面呈线状流动.
（五）结果观察：
1．首先观察对照孔，红细胞应无凝集。
2．观察实验孔
++++全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，边缘不整齐，无红细胞沉积。
+++ 大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不凝，在管底中心形成小红点。
++ 约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。
+只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆盘状，凝集的红细胞在此小圆盘周围。
-不凝集，红细胞沉于管底，成一致密圆盘，边缘整齐。
病毒血凝呈现的不同程度凝集强度
凝集效价：能使红细胞呈++凝集的病毒最高稀释度为凝集效价，表示含有一个单位血凝抗原。
如上述第7孔为++，则该病毒悬液效价为1：128，即病毒稀释到1：128时，每50μl 中含一个血凝单位的病毒。
凝集孔数越高,病毒凝集效价越高.
4单位病毒：血凝试验（HA）测出病毒的HA价，配制成4单位病毒，装于疫苗瓶中冷冻备用。
病毒的血凝实验（HA）结果分析
（五）鸡新城疫微量血凝抑制试验
5.2.1 先取稀释液50ul，加入微量血凝板的第一孔，再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加入3~12孔，每孔50ul，第二孔加浓度为8个血凝单位的抗原50ul。
5.2.2吸被检血清50ul 于第1孔(血清对照)中,挤压混匀后吸50ul 于第2孔,依次倍比稀释至12孔,最后弃去50 ul.
5.2.3置室温(18—20℃)下作用20分钟.
5.2.4滴加50ul 0.5%红细胞悬液于各孔中,振荡混合后,室温下静置30—40分钟,判定结果5.2.5每次测定应设已知滴度的标准阳性血清对照.
结果判定
1在对照出现正确结果的情况下,以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度.
2若有10%以上的鸡出现11(log2)以上的高血凝抑制滴度,说明鸡群已受新城疫强毒感染.
3若监测鸡群的免疫水平,则血凝抑制滴度在4(log2 )的鸡群保护率为50%左右;在4(log2)以下的保护率达90%--100%;在4(log2)以下的非免疫鸡群保护率约为9%,免疫过的鸡群约为43%.鸡群的血凝抑制滴度以抽检样品的血凝抑制滴度的几何平均值表示,如平均水平在
4(log2 )以上,表示该鸡群为免疫鸡群.
（六）实践要点
1.配置1%红细胞悬液时不能用力摇震，以免把红细胞膜震破，造成溶血，影响实验效果。
2.在滴加材料时，注意每滴加一种材料更换一个滴头，以免病毒与红细胞混合影响实验效果。
3.稀释病毒时将材料充分混匀后再吸出滴入下一孔中。
4.适时观察结果，如果长时间放置，凝集的红细胞团会沉降下来，造成观察结果不准确。
（七）作业
1.报告血凝试验（HA）的血凝效价的判定结果。
2.病毒的血凝和血凝集抑制试验试验有何意义?。