血凝、血凝抑制试验

红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）

一、实验用设备：

1、离心机 1台*（3000转离心红细胞）

2、冰箱 1台*（存放抗原）

3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）

4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。

5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用

6、八道移液器 1把（5-50微升稀释血清）

7、吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用）

8、积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用

9、一次性采血管采血用

10、2毫升注射器采血用

11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。

12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用

13、重铬酸钾配制清洁液用

14、硫酸配制清洁液用

15、吸管 1毫升、10毫升

16、吸耳球和吸管配套使用

17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）

18、蒸馏水当地买。清洗96孔V型板、吸头用

19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）

20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原

二、实验前的准备：

1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。

2.抗凝剂的配制：用天平称量

3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。

3.1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。在离心机中以3000转/分离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中3000转/分离心5分钟，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4～5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。放入4℃冰箱中可保存2—3天。使用时用1ml 吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加入9.9ml的生理盐水，此即1%红细胞悬液。现用现配。

4.被检血清：每只鸡心脏或翼下采血0.5-1ml,静置或离心，待血清析出后备用。

5.吸管清洁液的配制：使用1%的稀硫酸溶液。水10公斤，硫酸100毫升，将硫酸慢慢倒入水中，不断搅拌，操作时必须戴手套，口罩。

6.96孔V型板和微量滴头清洁液的配制：重铬酸钾79克，水1000ml，硫酸100ml，将重铬酸钾磨碎，溶解于水中，然后慢慢加入硫酸100ml，不断搅拌，切不可将重铬酸钾水溶液倒入硫酸中，以防爆炸，操作时必须戴手套，口罩。

7.血清稀释液：为灭菌的生理盐水。

三、实验过程：

原理：某些病毒（如新城疫、减蛋、流感）能够与鸡红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现

象。这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验（HI）。

应用：1、检测血清中的抗体水平，确定免疫时机。2、免疫后及时监测，确认免疫效果。3、辅助诊断病毒性疾病。

包括血凝（HA）试验、抗原校正和血凝抑制（HI）试验三步：

（一）血凝（HA）试验：采用96孔V型反应板，测定抗原效价

1、首先用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25微升。

2、用微量移液器吸取待测抗原25微升于第一孔中并挤压6次混合，后吸出25微升至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25微升。

3、微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25微升。

4、置于微量振荡器上振荡1分钟。

5、室温静置30分钟后观察结果。

6、结果观察：将反应板倾斜成45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。如彩图1所示第8孔红细胞为完全凝集，说明该抗原效价为1：256。

彩图1：

图1 抗原效价为1：256

（二）4单位抗原校正：

1、根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液：即4单位抗原。

例：上图1：抗原效价为1：256，HI试验时，25微升抗原稀释液内须含4个凝集单位，则应将抗原作256/4=64倍稀释。即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升生理盐水。

2、首先用微量移液器向反应板的第二孔至第六孔加生理盐水25微升。第一孔不加。

3、用微量移液器吸取4单位抗原25微升分别加入第一孔、第二孔中，从第二孔开始挤压6次混合，后吸出25微升至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25微升。

4、用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-6孔，每孔25微升。

5、于微量振荡器上振荡1分钟。

6、室温静置30分钟后观察结果。

7、结果观察：第一、二、三孔为完全凝集，第四孔红细胞为50%沉淀，第五孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立。如彩图2所示。

彩图2：

图2 前三孔为红细胞完全凝集，第四孔为红细胞50％凝集，第五孔为红细胞完全沉淀，说

明该次抗原校正成立

（三）血凝抑制（HI）试验：每排孔检查1份血清。步骤如下：

1.用微量移液器先加25微升生理盐水于各孔中。

2.用微量移液器吸取待检血清25微升置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去25微升。最后一孔不稀释，为红细胞对照。

3.用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25微升。

4.置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀。

5.室温静置20分钟。

6.用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加25微升。

7.置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀。

8.室温静置40分钟后观察结果。

四、结果判定：

1）判定结果：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度，以2的指数表示。如彩图2所示：

彩图2：

图3 上图抗体结果从上至下依次为：8/7/8/9/8/7/7/6

2）判定标准：

1.新城疫抗体：育雏育成鸡在7以上，产蛋鸡在9以上。

2.H5抗体：抗体值在6以上。

3.H9抗体：抗体值在7以上。

注：低于以上标准，则需要进行免疫。

3)免疫后抗体规律