血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)

1、注意抗原相的差异
2、注意消除非特异性因素
禽类血清中，尤其是水禽血清，往往含有非 特异性血凝抑制因子，在做禽流感血凝抑制 试验时会出现2-3孔有凝集现象。 因此，在利用血凝抑制试验进行血清抗体测 定之前，有必要对血清中非特异性因子进行 排除。
常用消除方法（FAO推荐）
1、鸡的红细胞吸附法 1.1试剂 鸡的红细胞：要充分洗涤； PBS： pH7.5，4℃保存； 阳性对照血清； 阴性对照血清。 1.2方法 加入25µL鸡的红细胞到100µL血清中； 4℃，用微量振荡器振荡20-30min； 加入100µL灭菌PBS (用RDE处理的血清除外)； 4000转离心1min； 取出上清，进行HI试验； 用阳性对照血清和阴性对照血清验证处理的彻底性 用于消除除鸡以外的其它禽类的血清非特异性反应。
3、 热灭活法
3.1鸡血清 取100µL血清样品放入一灭菌离心管中； 各取100µL阳性血清和阴性血清加入到另2个灭菌离心管 中； 56℃水浴30min。 3.2 其它禽类血清 血清用鸡的红细胞处理后，分别取100µL样品、阳性血 清、阴性血清放入灭菌离心管中，56℃水浴30min。 热灭活是一种排除非特异性因子的有效方法，但对特异 性抗体破坏较大。
三、实验步骤
（以禽流感为例，参照禽流感防治技术规范）
1 阿氏（Alsevers）液配制 称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸 0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL， 散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压 灭菌，4℃保存备用。
2 1%鸡红细胞液的制备
2.2原理 特异性抗体与相应病毒结合，使病毒失去凝 集红细胞的能力，从而抑制血凝现象。
二、HA和HI实验在禽病诊断中的作用
1、用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定 根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理，给未知 病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳性血清或已知 的抗新城疫病毒阳性血清，相应病毒便丧失了其凝集 红细胞的能力。因此，可利用从发病的鸡、鸭、鹅体 内分离的病毒作HA和HI试验。病毒悬液能凝集红细胞， 并且能被已知的抗血清（阳性血清）所抑制，那么该 病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。如用新城疫阳 性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性，那么， 这个未知病毒培养物就是新城疫病毒；如果病毒悬液 虽然能凝集鸡红细胞，但不能被鸡新城疫血清所抑制， 说明不是鸡新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。
1.3 原理 血凝的原理因不同的病毒而有所不同,如: 痘病毒对鸡的红细胞发生凝集并非是病毒本身，而 是痘病毒的产物--类脂蛋白的作用。 流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细 胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。
2、血凝抑制试验(HI) 2.1定义 当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的 量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的 受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时 红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制 (hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血 凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HI) 。 该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的 试验方法。
四、注意事项
目前在禽流感血凝抑制试验方面存在很多问 题，会对血凝抑制试验的意义造成影响从而 导致不正确的结果。
实践中，经常会出现不同厂家生产的相同亚型的 禽流感抗原所测同一血清的血凝抑制价不同，这 是由于禽流感病毒变异较快，存在抗原相的差异。 禽流感病毒株按其血凝抑制试验中所表现的亲和 力不同而分为三种类型：对本株和异株免疫血清 均呈较高效价的为“R”相；对本株效价高对异株 低的为“P”相；对本株及异株均低的为“Q”相。 如果在试验中出现相的差异，所测结果会相差23个滴度，所以在血凝抑制试验操作时，挑选亲 和相毒株作为测定抗原较好，这样会提高诊断的 灵敏度 。
3.7结果判定 将板倾斜，观察血凝板，判读结果将板倾 斜（45度左右），观察血凝板，判读结果： ++++：红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细 胞凝集 ＋＋＋：红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈 ＋＋：红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块 ＋： 红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块 －：红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细 胞完全不凝集 能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最 高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位 （HAU）。 注意！ 对照孔应呈现完全不凝集（-），否则此次 检验无效
3、对禽群的免疫状态进行评价
禽群或个体血清中的HI抗体水平与疫苗的免疫和对相应强毒侵袭的抵 抗力都有密切关系。以新城疫为例，当HI抗体在7Log2以上进行活苗 免疫时，由于高抗体可中和绝大部分的疫苗病毒，产生的免疫力很弱； HI抗体在5Log2～6Log2时，活苗免疫效果也受到一定的干扰；当HI抗 体在4Log2以下时，活苗免疫效果良好，但对强毒感染抵抗力下降。 一般认为，成年鸡新城疫的HI抗体水平在5Log2以上时，保护率在90 ％以上，4Log2以下时只有50％的鸡对强毒有抵抗力，2Log2以下时80 ％以上的鸡易感染新城疫。 由于雏鸡母源抗体对疫苗首次免疫效果影响很大，了解母源抗体水平 对疫苗免疫有重要意义。研究表明，母鸡血清抗体、卵黄抗体和5日 龄雏鸡母源抗体三者之间有相关性，卵黄抗体与母鸡血清抗体基本一 致，而1日龄雏鸡血清抗体低于卵黄抗体一个滴度，可检测种鸡卵黄 抗体、估测1日龄雏鸡母源抗体水平。 雏鸡新城疫母源抗体半衰期约 为5天，免疫临界点为3Log2，这样可依据抗体水平，确定最佳免疫时 间。
2、RDE（受体裂解酶）消除法 2.1试剂： RDE：用20mL无菌PBS稀释，小量分装，-20℃保存一周，注意避 免反复冻融； PBS： pH7.5，4℃保存； 阳性对照血清； 阴性对照血清。 2.2方法： 2.2.1鸡血清 加3倍体积的RDE到1倍体积的血清中； 充分混合； 56℃水浴30-60min; 加入6倍体积于血清体积的PBS。 2.2.2其它禽类血清 依据用RDE处理鸡血清方法处理后，继续按下列方法进行：用255µL鸡的红细胞到500µL血清中；4℃，用微量振荡器振荡2030min；4000转离心1min。
2、HI试验可用于发病禽群的诊断
鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家 禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。 由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI 试验对鸡群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和 离散性有助于诊断。 例如：经新城疫活苗加灭活苗免疫过的鸡群，新城疫抗体水平平均为 7Log2～8Log2，最高为10Log2。而新城疫感染鸡群中HI抗体部分高达 11Log2～13Log2；就抗体分布而言，鸡新城疫免疫鸡群抗体水平呈正态 分布，HI抗体在10Log2以上者仅占10％以下，4Log2以下者在1％以下。 而感染了新城疫强毒并出现发病的鸡群，HI抗体中10Log2以上者占25％ 以上，而4oLg2以下者在10％～30％之间。因此，依据禽群的抗体水平 高低和分布，结合临床症状和病、死鸡的剖检变化，可诊断禽群是否患 有新城疫或禽流感等。
血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）
主要内容
一、基本概念 二、HA和HI实验在禽病诊断中的作用 三、基本操作 四、注意事项
一、基本概念
1、血凝试验(HA) 1.1 定义 某此病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某 几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现 象称为血凝(hemagglutination，HA)，也称直接血 凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HA) 。 常见于正粘病毒（如AIV）、副粘病毒（如NDV）和 某些黄病毒（如JEV）、痘病毒、以及经过处理过 后的IBV。
1.2 血凝类型： (1) 可逆转型 血凝素与病毒颗粒易分开，经超速离心后， 病毒颗粒沉淀于管底，血凝素则游离于上清 液内。这种血凝素凝集红细胞的现象是可逆 的，即被凝集的红细胞释放了吸附于表面的 血凝素后，可再与该血凝素发生凝集。 如天花、鼠疫等病毒。
(2) 不可逆转型 血凝素与病毒颗粒结合得比较紧密，不经过特殊处 理血凝素不能与病毒颗粒分开，这种病毒引起的红 细胞凝集，是不可逆转的。在一定的温度 (37℃) 下，病毒释放出一种能破坏红细胞表面受体糖苷键 的N-乙酰神经氨酸酶，当病毒颗粒从红细胞表面游 离出来后红细胞表面受体已被破坏而失去了再凝集 病毒的能力。 如流感病毒、鸡新城疫病毒等。
3 抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）
3.1 在微量反应板的1孔～12孔均加入25μLPBS，换滴头。 3.2吸取25μL病毒悬液加入第l孔，混匀。 3.3从第1孔吸取25μL病毒液加入第2孔，混匀后吸取25μL加入第3 孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取25μL弃之，换滴 头。 3.4每孔再加入25μL PBS。 3.5每孔均加入25μL体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液 充分摇匀后加入） 3.6振荡混匀，在室温（20～25℃）下静臵40min后观察结果（如 果环境温度太高，可臵4℃环境下反应1小时）。对照孔红细胞将 呈明显的钮扣状沉到孔底。
பைடு நூலகம்
(3) 凝集条件严格型
有些病毒及其血凝素凝集红细胞的条件很严格，不 仅对不同种动物的红细胞有严格的选择，即是对同 种动物，由于性别和年龄的不同，对红细胞的凝集 性能亦有差异（如JEV对公鹅的红细胞凝集性能比 对经产老龄母鹅的红细胞凝集性能好） 。除此之 处，还对缓冲液的pH值、温度及盐浓度等的要求均 很严格。
4、血凝抑制试验（HI试验 微量法）
4.1 根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍 数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如 果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。 4.2 在微量反应板的1孔～11孔加入25μL PBS，第12孔加入50μL PBS。 4.3 吸取25μL血清加入第1孔内，充分混匀后吸25μL于第2孔，依次对倍 稀释至第10孔，从第10孔吸取25μL弃去。 4.4 1孔～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液25μL，室温（约20℃）静 臵至少30min。 4.5 每孔加入25μL体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静臵约 40min（室温约20℃，若环境温度太高可臵4℃条件下进行），对照红细胞 将呈现钮扣状沉于孔底。 4.6 结果判定 以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。 只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴 度，试验结果才有效。HI价小于或等于21og2判定HI试验阴性；HI价等于 31og2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于41og2为阳性。