实验病毒血凝和血凝抑制试验
血凝及血凝抑制实验
实验原理基于病毒与抗体结合 后，改变了红细胞的抗原性，
从而影响血凝过程
实验结果可用于病毒的分离、 鉴定和抗体效价测定等
实验材料
血凝抑制抗体 病毒抗原 受检血清 红细胞
实验步骤
准备试剂和器材：包括血凝试剂、抗体、离心机、试管等。 采集样本：采集待检测动物的血液样本。 抗体处理：将抗体与待检测样本混合，孵育一定时间。 离心分离：将混合液离心，分离出凝集块。 结果观察：观察凝集块的数量和大小，判断实验结果。
实验结果
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实验原理：血凝抑制实验的原理是利用抗原抗体反应的特异性，通过加入抗体来抑制血凝反应的发生，从而 检测出血液中是否存在相应的抗体。
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实验步骤：血凝抑制实验通常包括加样、加抗体、观察结果等步骤。在实验过程中，需要严格控制实验条件， 以保证实验结果的准确性和可靠性。
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实验结果分析：根据实验结果，可以判断出被检测样本中是否存在相应的抗体。如果血凝反应被抑制，则说明被检测样本中 存在相应的抗体；如果没有出现血凝反应或者血凝反应没有被抑制，则说明被检测样本中不存在相应的抗体。
诊断试剂开发：利用 血凝及血凝抑制实验 检测血液中的病毒抗 体，辅助临床诊断
在食品科学领域的应用
食品安全：评估食品中细菌、 病毒等微生物的污染程度
食品加工：检测食品中病原 微生物的含量
食品质量控制：监测生产过程 中的卫生状况，确保产品质量
食品科学研究：为食品科学 领域的研究提供数据支持
在其他领域的应用
评估风险：对于需要进行手术或特殊治疗的患者，血凝及血凝抑制实验可以评估其出 血风险
科学研究：在医学研究中，血凝及血凝抑制实验可用于研究凝血机制、药物作用等方 面
血凝试验(HA)及血凝抑制试验(HI)
一、目的要求 掌握HA和HI试验的基本操作技术，了解其实用价值。 二、实验材料 1、禽流感毒 2、1%鸡红细胞 3、生理盐水 4、禽流感阳性血清 5、96孔“V”型微量反应板 三、实验内容 1、HA试验术式表： 2、HI试验术式表： 四、作业 1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原抗体反应？为什么？ 2、HI试验是不是特异的抗原抗体反应？为什么
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1： 2 1： 4 1： 8 ﹟ 以100%凝集病毒最大稀释孔为该病毒的凝集价
血凝抑制试验(HI)
一、概念： 1 、 HI 试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制， 称HI试验。 2、抗体效价：出现红细胞凝集抑制现象的血清的最大稀释倍数叫抗体 效价。
病毒的红细胞凝集试验（HA）
一、 概念 病毒的红细胞凝集现象：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞 表面受体结合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。 二、应用 1 、当以被检动物的某一器官为病料，进行HA试验，结果为阳性者，证明 该被检材料中有能凝集红细胞的某种病毒。 2 、凝集价的测定：将被检病毒材料，稀释成不同的稀释倍数，进行 HA试 验，出现血凝现象的各稀释孔中，以100%能出现病毒的红细胞凝集现象的 病毒的最大稀释倍数者即定为凝集价(血凝价)
二、动物体内抗体存在情况 1、当动物感染某病毒而发病时，可在机体的相应器官查出病毒。
2、病毒相当于免疫效应物质中的抗原，病毒进入动物机体，将发生特异
性免疫反应，即产生免疫物质——抗体（ 90%抗体都存在于动物的血清 中），抗原和抗体发生特异性结合反应 3、病畜体内，因受病毒抗原刺激，产生大量相应抗体，故体内抗体效价 较高 4、健康动物，免疫接种后，因受疫苗（抗原）刺激，而发生免疫应答反 应，体内抗体效价较高
血凝和血凝抑制实验
3、每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul
4、轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分 钟
5、结果判定
医学课件ppt
7
血凝效价测定
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8
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 ％凝集；
以出现＋＋（50％凝集）的抗原最高稀释 倍数为该抗原的血凝价（1:128）？？？ 。
25ul 1:256稀释的病毒抗原为该抗原的一 个血凝单位。
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血凝抑制试验
1、将病毒抗原稀释成4个血凝单位（1/128×4=1:32）
2、在血凝板上1－12孔内各加入25ul生理盐水；
3、在第1孔内加入被检血清25ul，然后倍比稀释至第 10孔，最后弃25ul；
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注意事项
• 1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢， 以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡 红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄 色，之后直至清亮为清洗干净）。
• • 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸
取干净。
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1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 ％凝集；
2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而 稍向孔底集中，即75％凝集；
3、 ＋＋：红细胞形成一个环状，四周有下凝集块， 即50％凝集；
4、 ＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四 周稍有凝集块，即25％凝集；
5、－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即 无凝集。
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01实验一 病毒血凝和血凝抑制试验
弃 去 25
25 25
振荡混 合后 37℃ 1030min 振荡混 合后 37℃ 45min
血清
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25
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1%红 细胞
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结果
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
抑制 价
32
16
8
4
2
1
1：21
1
孔号
1
原液
2
1：21
3
血抑制试验（HI） 4 5 6 7 8 9 10
1：23 1：24 1：25 1：26 1：27 1：28 1：29
11 12
1： 210
备注
稀释 度 生理 盐水
1：22
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病毒 液
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从上一稀释孔的混合液中吸取25 μ L致下一孔
三、实验材料 新城疫病毒液0.1mL 1%鸡红细胞50mL 生理盐水50mL 阳性血清0. 5mL 96孔“U”形或“V”形微量反应板 25μ L定量移液管 滴头
四、实验内容及操作程序 1．血球凝集试验（HA） 以新城疫病毒为例，操作 过程如下（表10-1） • （1）在96孔“V”形微量反应板上进行，自左至 右各孔加25μ L生理盐水。 • （2）于左侧第1孔加25μ L病毒原液或收获液，混 合均匀后，吸25μ L至第2孔，混合均匀后，吸 25μ L至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃 25μ L，稀释后病毒稀释度为第1孔1:2，第2孔1:4， 第3孔1:8……。最后1孔为对照。
实验四血凝和血凝抑制试验课件
02
实验材料
实验器材
01
02
试管
用于血样的采集、分离和反应 。
吸管
用于吸取试剂和血样。
03
离心机
用于血样的分离。
04
显微镜
用于观察血凝现象。
实验试剂
生理盐水
用于稀释血样和作为反应介质 。
抗血清
用于血凝抑制试验，针对特定 病毒或细菌。
凝血酶
促使血液凝固的酶。
抗凝剂
如肝素，防止血液凝固。
实验样本
出了抗体滴度与病毒滴度之间的关系。这一发现有助于评估抗体治疗效
果和制定抗病毒治疗方案。
05
注意事项与安全须知
实验安全须知
01
实验操作应在专业人员 的指导下进行，确保安 全。
02
实验过程中应穿戴实验 服和防护眼镜，避免意 外伤害。
03
实验器材应保持清洁， 避免交叉污染。
04
实验废弃物应按照规定 进行处理，避免对环境 和人体造成危害。
血凝抑制试验
利用抗体与相应抗原结合后，抑 制红细胞发生凝集的现象。
实验步骤
准备试剂和器材：包括抗 原、抗体、红细胞、生理 盐水等。
制备不同浓度的抗原溶液。
取适量红细胞，加入不同 浓度的抗原溶液中，观察 红细胞是否发生凝集。
记录实验结果，分析数据， 得出结论。
对于血凝抑制试验，先加 入抗体，再加入抗原溶液， 观察红细胞是否发生凝集。
实验结果
实验结果一
实验结果三
血凝试验中，不同稀释度的病毒液与 红细胞混合后，红细胞迅速凝结成块， 形成明显的血凝现象。
通过比较不同稀释度的病毒液与加入 特异性抗体后的血凝抑制情况，可以 得出抗体滴度与病毒滴度之间的关系。
血凝及血凝抑制实验
1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢，以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄色，之后直至清亮为清洗干净）。 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸取干净。
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备
一、实验目的
1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识
二、实验内容
1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫苗注射后的抗体检测）
三、实验原理
1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。
病毒颗粒
红细胞
2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；
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1---血凝和血凝抑制实验
做好个人防护
注意事项
7、环境温度一定要重视，一般要求在室温下20-25°进行， 如果低于15°反应结果就出现的慢；如果高于30°结果会出现的 快；如果低于4°会发生红细胞自凝现在。因此，观察时间可以 适当根据反应情况缩短，所以实验室要装有空调和温度计。
8、微量反应版如果是有机玻璃的一定要清洗干净，孔底 要透亮，无磨损毛糙无划痕和有残留物。不干净的反应板在试验 中会出现自凝现象。使用正规厂家生产的一次性微量板就可杜绝 这种情况。
检测质量控制措施
标准、 规范
注 意
优质的试剂
充分准备！！！
校准的仪器
正确的操作
注意事项
1、四个单位抗原，红细胞悬液使用过程中要轻轻摇匀；
2、移液器的吸头在反复洗吹时要插入液面以下但不可过深， 避免使用中速度过快产生过多气泡造成移液量减少，每孔混匀完毕 要将吸头内液体排尽。
注意事项
3、移液器使用时要用力均匀不可过力，吸头要安装牢固，防止 使用过程中漏气或者掉落。吸头尽量使用一次性的，若反复使用要清 洗干净，最好用超声波清洗机清洗，高压灭菌后使用，如果发现吸头 堵住不能吸到液体或者弯曲及时淘汰。 4、移液器在滴加液体，特别是在加抗原和红细胞悬液时一定不要 深入液面中造成交叉污染，影响浓度造成结果较大误差，可以尝试悬 空垂直加样。
1、HA原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地 使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的 现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应（红细胞 不流淌）。
病 毒 颗 粒
红 细 胞
2、HI原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这 种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细 胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。 这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑 制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
病毒血凝和血凝抑制试验以新城疫为例
实践三 病毒血凝和血凝抑制试验--以新城疫为例实践目的：1．掌握血凝HA 和血凝抑制HI 试验的原理2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法 实践原理：某些病毒如鸡新城疫病毒,禽流感病毒等能够与人或动物的红细胞发生凝集,此即为红细胞凝集现象;这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体免疫血清所抑制,即为红细胞凝集抑制试验; 实践内容：1．红细胞凝集试验HA 试验 主要是测定病毒的红细胞凝集价,以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数抗原单位;有试管法和微量法两种,现以常用的微量法进行说明;鸡新城疫病毒的HA 试验现采用微量法,在V 形微量反应板上进行; 1首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴25μl;2用微量移液器取病毒抗原液25μl 加入第1孔内,吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀,再吸取25μl 液体小心地移至第2孔,如此连续稀释至第11孔,第11孔吸取25μl 液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2～1:2048,第12孔为红细胞对照;3再以微量移液器每孔加％红细胞悬浮液1滴25μl;4在振荡器上振荡混匀约l ～2分钟,再置37℃作用15分钟后观察结果;5每次测定样品都应同时做红细胞对照;表1 鸡新城疫血凝效价HA 的测定术式微量法孔号 12345678910 11 12病毒稀释倍数 1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024 1:2048 对照生理盐水 25l 25l μ病毒液25ll l l l 25l l l l l l μl 弃去 1％红细胞悬液 25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl感作置振荡器上混匀1～2分钟,放37℃静置15分钟表示100％完全凝集++ 表示50％凝集- 表示不凝集结果判定：将反应板倾斜成45度角,沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀,表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底,凝成均匀薄层,倾斜后红细胞不流动,说明红细胞被病毒所凝集;能使100％红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数,称为该病毒液的红细胞凝集效价;如上例：病毒液的HA效价为1:128,HI试验时,病毒抗原液25微升内须含4个凝集单位,则应将原病毒液作成128/4＝32倍的稀释液;2.红细胞凝集抑制试验HI试验有试管法和微量法两种,现以常用的微量法进行说明;1用微量移液器每孔各加入1滴稀释液即25μl,从第1孔到第10孔;第1l孔加稀释液2滴50μl;2以微量移液器取被检血清25μl,放入第1孔,,吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使被检血清与稀释液混合均匀,再吸取25μl液体小心地移至第2孔,如此连续稀释至第10孔,最后第十孔吸取25μl液体弃掉；被检血清稀释倍数依为1:2～1:1024,第11孔为红细胞对照,第十二孔为抗原对照;3每孔再加入含有四个单位的病毒液1滴25μl至第10孔,第1l孔为红细胞对照孔,不加病毒液；第十二孔为抗原对照,加病毒液;4置振荡器上振荡l～2分钟后,放37℃静置20分钟;5每孔再加入％红细胞悬浮液1滴25μl放振荡器上振荡l～2分钟混匀,置37℃,15分钟后判定结果;表2 鸡新城疫红细胞凝集抑制H1试验微量法孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12被检血清稀释倍数1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:1281:2561:5121:1024红细胞对照抗原对照生理盐水25l μ25μl被检血清25l l l l l l l l l lμl弃掉4单位病毒液25μl 25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl振荡器上振荡1～2分钟,放37℃作用20分钟1%红细胞悬液25μl 25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl振荡器上振荡1～2分钟,放137℃作用15分钟结果例示-------++-注：- 表示不凝集、++ 表示部分凝集、表示完全凝集 ;结果判定：将反应板倾斜成45度角,沉于管底的细细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀,表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底,凝成均匀薄层,倾斜后红细胞不流动,说明红细胞被病毒所凝集;能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数,称为该血清的红细胞凝集抑制效价,用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数10g2表示;如上例,该血清的红细胞凝集抑制效价为1：128或HI效价为710g2;结果分析：1一般认为鸡的免疫临界水平为1:8成年或1:16雏鸡,随地区不同而稍有差异;2鸡血清HI抗体效价高于1:16时可适当推迟新城疫免疫的时间,HI抗体效价在1:16以下,须进行新城疫疫苗接疫种,在新城疫流行的地区或鸡场,鸡的免疫临界水平应稍提高;3鸡群的HI抗体水平是以抽检样品的HI抗体效价㏒2的平均值表示的;如果某鸡群的10份样品中,HI抗体效价㏒2为8的有3份样品,为7的有5份样品,为6的有2份样品,它们的平均值为：8×3＋7×5＋6×2/3＋5＋2＝平均水平在410g2以上,说明该鸡群为免疫鸡群;若在检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时,则不能用上法计算平均水平,应根据临界水平以下的样品数在全部样品中所占的百分比决定免疫与否;4大型养鸡场,每次进行抽测时,抽样率一般不低于％一％,小型鸡群,抽样率应有所增加,一般认为理想的抽样率应为％;5鸡群接种新城疫疫苗后,经2～3周测血清中的HI抗体效价,若提高2个滴度以上,表示鸡的免疫应答良好,疫苗接种成功；若HI抗体效价无明显提高,表示免疫失败;作业：1．每三位学生做一个血凝试验,测定出新城疫病毒的血凝效价,记录试验结果;2．根据血凝价将新城疫病毒稀释成4个单位病毒液,每三位学生做一个血凝抑制试验,检测待检血清的血凝抑制效价,记录试验结果3．回答问题：1病毒的血凝和血凝抑制试验的原理是什么2病毒血凝反应是抗原抗体反应吗,为什么3病毒血凝抑制反应是抗原抗体反应吗,为什么实践三病毒血凝和血凝抑制试验--以新城疫为例一实践目的：1、掌握血凝及血凝抑制试验的基本方法及原理2、掌握鸡新城疫的试验室诊断技术;二实践内容与基本要求：实践原理：某些病毒,如鸡新城疫、禽减蛋综合症等,有能凝集动物红细胞的特性,此即红细胞凝集现象;这些病毒囊膜上有糖蛋白血凝素,能与动物的红细胞表面的糖蛋白受体结合,发生红细胞凝集现象;可以利用这一特性判断被检材料中有无病毒的存在,并可以测定病毒的效价;1、血凝试验：常多用感染鸡胚液进行,凝集价可达1:160---1:640也可采用急性病例的组织浸出液,但凝集价较低;本病毒可凝集许多动物的红细胞,但凝集性能不够稳定,故通常作血凝试验时都采用鸡的红细胞采血部位为心脏或翅静脉,取血后加抗凝剂或脱纤维,置于离心机中摇转加生理盐水洗涤三次后,将浓缩的红细胞配成1%生理盐水悬液,即可应用; 操作方法见实习指导;凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数,称为该病毒的血凝滴度;2、血凝抑制试验：单纯地使用血凝试验还不能作出明确的诊断,因为还有其它病原也能引起红细胞凝集,如引起慢性呼吸道病的禽败血支原体;所以需用已知的抗血清作血凝抑制试验,以鉴别病毒;也可用已知病毒来测定病鸡血清中的抗体,而得明确的诊断;但不适于急性病例,通常要在感染后的5---10天,或出现呼吸症状后的2天,血清中的抗体到一定水平,就可用试管法;三主要器材与药品器材：离心机、试管架、试管、注射器、针头号、感染鸡胚,微量移液器1套,V 型、96孔板,滴头,微量振荡器,塑料采血管,药品：病毒：鸡新城疫弱毒疫苗；%生理盐水、1%红细胞浑悬液、血清、4单位病毒;标准阳性血清；浓缩抗原；%红细胞浑悬液；被检血清；—磷酸缓冲盐稀释液；—磷酸缓冲盐稀释液：氯化钠GB1266—77170g；磷酸二氢钾GB1274—7713.6g；氢氧化钠GB629—773.0g；蒸馏水1000ml；高压灭菌,4保存,使用是作20倍稀释; 鸡1%红细胞悬浮液：由健康来航公鸡羽根静脉采血迅速置于装有抗凝血剂3%柠檬酸钠溶液的离心管中,用生理盐水洗涤3次,每次以3000r/min离心10分钟,将血浆、白细胞等充分洗去,根据沉淀的红细胞压积,用PH=7的生理盐水稀释成1%悬浮液;被检血清：每群鸡随机采20—30份血样,分离血清;采血法：先用三棱针刺破翅下静脉,随即用塑料管引流血液至6~8cm长;将管一端烧融封口,待凝固析出血清后以1000r/min离心5分钟,剪断塑料管,将血清倒入一块塑料板小孔中,若需较长时间保存,可在离心后将凝血块一端剪去,滴融化石蜡封口,于0o C保存;四实践方法操作方法微量血凝试验4.1.1 于微量血凝板的每孔中滴加磷酸缓冲盐稀释液50ul,共滴四排;4.1.2 吸取1:5稀释抗原滴加于第一列孔,每孔50ul,然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔,再从第11孔各吸取50ul弃之;最后一列不加抗原作对照;4.1.3 于每孔加入%红细胞悬液50ul;4.1.4 置微型振荡器上振荡1分钟,或手持血凝板绕圆圈混匀;4.1.5 放室温下18~20oC30~40分钟,根据血凝图象判定结果;以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度;每次四排重复,以几何平均值表示结果;4.1.6 计算出含4个血凝单位的抗原浓度,按式B1进行计算;抗原应稀释倍数=血凝滴度/4……………………..B1上述材料全部按顺序加完后,振荡96孔板,使红细胞与病毒充分接触,然后置于20-22℃室温中静置,自第15分钟开始观察结果,每5分钟检查一次,至60分钟结束,观察结果时注意不要摇震96孔板;如果被检材料中有病毒的存在,就会出现红细胞的凝集现象,红细胞出现凝集反应者,凝集成片或碎片,呈伞状铺于管底,不凝集的红细胞沉积于管底,呈一小圆点,将板倾斜,可以看到沉积于底板上的红细胞沿倾斜面呈线状流动.五结果观察：1．首先观察对照孔,红细胞应无凝集;2．观察实验孔++++全部红细胞凝集,凝集的红细胞铺满管底,边缘不整齐,无红细胞沉积;+++ 大部分红细胞凝集,在管底铺成薄膜状,但尚有少数红细胞不凝,在管底中心形成小红点;++ 约有半数红细胞凝集,在管底铺成薄膜,面积较小,不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点;+只有少数红细胞凝集,不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆盘状,凝集的红细胞在此小圆盘周围;-不凝集,红细胞沉于管底,成一致密圆盘,边缘整齐;病毒血凝呈现的不同程度凝集强度凝集效价：能使红细胞呈++凝集的病毒最高稀释度为凝集效价,表示含有一个单位血凝抗原;如上述第7孔为++,则该病毒悬液效价为1：128,即病毒稀释到1：128时,每50μl中含一个血凝单位的病毒;凝集孔数越高,病毒凝集效价越高.4单位病毒：血凝试验HA测出病毒的HA价,配制成4单位病毒,装于疫苗瓶中冷冻备用;病毒的血凝实验HA结果分析五鸡新城疫微量血凝抑制试验5.2.1 先取稀释液50ul,加入微量血凝板的第一孔,再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加入3~12孔,每孔50ul,第二孔加浓度为8个血凝单位的抗原50ul;5.2.2吸被检血清50ul 于第1孔血清对照中,挤压混匀后吸50ul 于第2孔,依次倍比稀释至12孔,最后弃去50 ul.5.2.3置室温18—20℃下作用20分钟.5.2.4滴加50ul %红细胞悬液于各孔中,振荡混合后,室温下静置30—40分钟,判定结果5.2.5每次测定应设已知滴度的标准阳性血清对照.结果判定1在对照出现正确结果的情况下,以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度.2若有10%以上的鸡出现11log2以上的高血凝抑制滴度,说明鸡群已受新城疫强毒感染.3若监测鸡群的免疫水平,则血凝抑制滴度在4log2的鸡群保护率为50%左右;在4log2以下的保护率达90%--100%;在4log2以下的非免疫鸡群保护率约为9%,免疫过的鸡群约为43%.鸡群的血凝抑制滴度以抽检样品的血凝抑制滴度的几何平均值表示,如平均水平在4log2以上,表示该鸡群为免疫鸡群.六实践要点1.配置1%红细胞悬液时不能用力摇震,以免把红细胞膜震破,造成溶血,影响实验效果;2.在滴加材料时,注意每滴加一种材料更换一个滴头,以免病毒与红细胞混合影响实验效果;3.稀释病毒时将材料充分混匀后再吸出滴入下一孔中;4.适时观察结果,如果长时间放置,凝集的红细胞团会沉降下来,造成观察结果不准确;七作业1.报告血凝试验HA的血凝效价的判定结果;2.病毒的血凝和血凝集抑制试验试验有何意义。
血凝和血凝抑制实验
实验三血凝和血凝抑制实验一、实验目的与要求掌握血凝和血凝抑制实验操作及应用二、实验内容H5亚型猪流感抗体检测与分析三、实验步骤（一）血凝（HA）试验1、用微量移液枪在微量反应板的第一排1-12孔均加入50μLPBS，换枪头；2、吸取50μL抗原，加入第一孔，反复吹打5次混匀；3、从第一孔吸取50μL加入第二孔，吹打混匀吸取50μL加入第三孔，如此稀释至第11孔，从第11孔吸取50μL丢弃，第12孔作为红细胞对照；4、各孔均加入50μL0.5%鸡红细胞悬液（已充分摇匀）；5、轻轻混匀，室温25℃静置20min观察结果；（二）血凝抑制（HI）试验1、血清样品处理：先加150μL胰酶溶液于300μL血清中，56℃水浴灭活30min 后冷却至室温；加900μL高碘酸钾，混合，室温孵育15min；加900μL丙三醇盐溶液，混合，室温孵育15min；加750μL生理盐水混合，4℃保存；2、根据HA试验中测定的HI抗原效价配制4单位抗原；3、在微量反应板第5-8排的2-11孔加入25μLPBS，第12孔加入50μLPBS；4、吸取50μL血清（编号为2-4血清、阳性血清、编号为1-4血清、阴性血清）加入第1孔，混匀后吸取25μL于第二孔，混匀后吸25μL于第三孔，依次稀释至第11孔，第11孔混匀后弃去25μL；5、各排前11孔均加入4单位抗原25μL，第12孔作为红细胞对照，室温下25℃静置30min；6、各孔均加入50μL0.5%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻摇匀，室温下25℃静置30min。
四、实验结果及分析血凝（HA）试验，从第三个孔开始显示“滴泪”第一排为阳性对照第二排为阴性对照第三排，血清5-6第四排，血清6-6参考文献[1]GB/T 27535-2011，猪流感HI抗体检测方法[S].。
血凝和血凝抑制试验
3. 4.
பைடு நூலகம்
0.85%生理盐水。 生理盐水。 生理盐水 被检血清，采自被检鸡的健康血清。 被检血清，采自被检鸡的健康血清。
四、操作步骤
（一）血凝试验（HA） 血凝试验（ ）
1. 在血凝板第一排的 在血凝板第一排的1~12孔加入 孔加入50µl生理盐水。 生理盐水。 孔加入 生理盐水 2. 在第1孔中加入 病毒抗原， 在第 孔中加入50µl病毒抗原，反复吸取混匀 孔中加入 病毒抗原 后吸50µl到第 孔，如此倍比稀释直到第 孔， 到第2孔 如此倍比稀释直到第10孔 倍比稀释直到第 后吸 到第 混匀后弃50µl； 最后两孔 （ 11、 12） 为红细 ； 最后两孔（ 、 ） 混匀后弃 胞对照。 胞对照。
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25
弃 50µl /
50 / / 50
25 50
注： 11孔为病毒对照 应该完全凝集， 12孔为细胞对照 孔为病毒对照， 孔为细胞对照， 1) 第 11 孔为病毒对照 ， 应该完全凝集 ， 第 12 孔为细胞对照 ， 应该完全沉积到孔底，只有当对照成立时试验结果方有效。 应该完全沉积到孔底 ， 只有当对照成立时试验结果方有效。 以红细胞100 凝集的稀释度为判定终点。 100% 2) 以红细胞 100% 凝集的稀释度为判定终点 。 血凝抑制滴度大 于等于1 为阳性，小于1 为阴性，等于2 为可疑。 于等于1：24为阳性，小于1：22为阴性，等于23为可疑。
病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开， 2 ） 病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开 ， 血凝素呈游离状态，例如天花 牛痘、 天花、 血凝素呈游离状态，例如天花、牛痘、鼠痘等 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 3 ） 脑炎病毒 、 口蹄疫病毒等 ， 凝集红细胞的条 脑炎病毒、 口蹄疫病毒等， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 同时还要掌握反应的pH和温度等。 同时还要掌握反应的pH和温度等。 pH和温度等
血凝实验实验报告
一、实验目的1. 理解血凝现象的原理。
2. 掌握血凝实验的操作步骤。
3. 学习通过血凝实验判断血凝素和血凝抑制抗体的存在。
二、实验原理血凝现象是指某些病毒能够凝集动物红细胞的能力。
利用这一特性，可以通过血凝实验检测病毒的存在以及血清中抗体的水平。
血凝抑制试验（HI试验）是一种常用的血清学检测方法，通过检测血清中的血凝抑制抗体，可以判断感染状态、疫苗接种效果等。
三、实验材料1. 红细胞：鸡红细胞、兔红细胞等。
2. 病毒：流感病毒、副流感病毒等。
3. 血凝素（HA）：用于血凝实验。
4. 血凝抑制抗体（HI）：用于血凝抑制实验。
5. 实验器材：微量移液器、酶标板、振荡器、离心机等。
四、实验方法1. 血凝实验（1）将红细胞用生理盐水洗涤三次，制成1%的红细胞悬液。
（2）取96孔酶标板，每孔加入25μl PBS液。
（3）在第一孔中加入25μl病毒悬液，混匀后吸取25μl加到第二孔，依次倍比稀释至第二排最后一孔，弃去25μl。
（4）在每孔中加入25μl 1%红细胞悬液。
（5）将酶标板置于振荡器上振荡10秒，室温静置30min。
（6）观察结果，记录出现血凝现象的孔数。
2. 血凝抑制实验（1）取96孔酶标板，每孔加入25μl PBS液。
（2）在第一孔中加入25μl病毒悬液，混匀后吸取25μl加到第二孔，依次倍比稀释至第二排最后一孔，弃去25μl。
（3）在第三至第六排孔中加入不同浓度的血清。
（4）在每孔中加入25μl 1%红细胞悬液。
（5）将酶标板置于振荡器上振荡10秒，室温静置30min。
（6）观察结果，记录出现血凝抑制现象的孔数。
五、实验结果与分析1. 血凝实验通过观察实验结果，发现病毒悬液孔数越多，红细胞凝集现象越明显。
说明病毒具有血凝活性。
2. 血凝抑制实验通过观察实验结果，发现不同浓度的血清孔数出现血凝抑制现象的孔数不同。
说明血清中含有能够抑制血凝的抗体。
六、实验结论1. 血凝实验结果表明，病毒具有血凝活性。
血凝抑制实验报告三篇
血凝抑制实验报告三篇（经典版）编制人：__________________审核人：__________________审批人：__________________编制单位：__________________编制时间：____年____月____日序言下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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血疑试验与血疑抑制试验
应广大养殖朋友和一些兽医朋友的要求，今将养殖场中常做的血凝试验（HA）和测血液或卵黄中禽流感和新城疫等抗体的血凝抑制试验写出来，以供朋友参考，不当之处，尚请斧正。
血凝试验一、血凝原理：正粘病毒（流感）和副粘病毒（新城疫）EDS病毒等有血凝素，能够使家禽的血细胞凝集。
冠状病毒得经胰蛋白酶处理才能较好地凝集。
二、抗体监测原理：血凝抑制（ＨＩ）试验。
抗体监测。
利用抗体来中和病毒使血凝能力不断下降。
三、凝和不凝的判断。
病毒与家禽的（有核）红细胞结合后产生凝集，红细胞带上电荷相互排斥而在一定时间内（大于半小时）不沉淀。
一般的细胞则在重力的作用下沉淀下去，是为不凝集。
（最后都沉）四、血凝的判断：以完全不沉为凝集。
半沉半凝集不算。
（即沉的是不凝，不沉的是凝）五、血凝试验的作用：1、判断有无病毒。
（4㏒2为一标准）2、疫苗的凝集价。
六、对血细胞要求：SPF鸡血最好，健康未免疫鸡次之，免疫健康鸡最差（大量用），病鸡坚决不用。
大量使用的免疫健康鸡血应多洗几遍。
设备（离心机、振荡器、进口<芬兰>八道移液器等）七、采血方法：心脏采血1、垂直采血2、水平采血（鸡采不死）八、采血洗血步骤：1、取无菌10ml注射器加入几粒到十几粒枸橼酸钠（防凝血），抽取5、6ml 生理盐水2、垂直或水平采血，针头能碰到跳动的心脏后再向前进几毫米，出现回血，轻抽注射器即可3、将血放入离心管，放入离心机中，加另一全是水的起平衡作用的离心管，使离心机从0逐渐加到1500～2000转，10 ～15分钟，停机，取出离心管，用吸管吸取上清液及一层薄薄的白细胞再加生理盐水并利用吸管的水流将红细胞搅匀，再离心，多次离心，（将细胞可能因免疫所致的影响降低。
最后将红细胞配成0.5 ～1%备用。
九、血凝测定步骤：在96（8×12）孔微量板上以1~2排（8~2×8个）为单位，用8道（芬兰产1800~2400元每个）或单道微量移液器每孔加25微升生理盐水，在每组的第一孔加25微升待测液体，然后向后倍比稀释，弃去最后一滴于盛废液的容器中。
血凝和血凝抑制实验
一、重要性
01 有效预防动物疫情的发生 02 有效判断动物疫情发生的原因 03 有效推动动物免疫程序的制定
二、检测内容和方法
检测内容
猪
猪瘟 O型口蹄疫 A型口蹄疫 地方病：蓝耳、细 小、圆环、伪狂犬、 乙脑
羊
O型口蹄疫 小反刍兽疫
牛
O型口蹄疫 A型口蹄疫
鸡
禽流感 新城疫
用已知抗原来检测被检血清中有无相应的特异性抗体和滴 定该特异性抗体的水平。
血凝试验：某种病毒的血凝素， 能使鸡、鹅或人的红细胞发生凝 集，叫做血凝试验，也称直接血 凝反应，利用这种特性设计的试 验称血凝试验 (HA) 。
常见于正粘病毒、副粘病毒和某 些黄病毒、痘病毒等。
目的：测定病毒的血凝效价，采用 一定的病毒量，通常采用4个血凝 单位
2.采血完毕后将血加入至10ml离心管中，加3-4倍体积生理盐水以 2000~3000r/min，5~10min离心3-5次。
3.弃去上液和红细胞上层的白细胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液， 上下缓慢颠倒（切忌用力过大使红细胞破裂），使其充分混匀，再离心 弃去上清液，反复几次直至上清液清亮透明为止。
阿氏（Alsevers）液配制
称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸 0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散 热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌， 4℃保存备用。
1%红细胞的配制：
1.为避免有些鸡只的红细胞有自凝现象，因此配制1%红细胞悬液时应最好 选择采取3只SPF鸡或未进行过任何免疫过的成年公鸡血液。（抗凝剂与 血液比例为1:4）
血凝试验（HA)原理：
血凝抑制试验（HI）原理
实验病毒血凝和血凝抑制试验课件
• 与蛋白质分子类似，核酸 也是两性解离分子。 在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷 酸基团中只有一个磷酸解离，整个核酸分子带 正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为 8.0~8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离， 核酸分子带负电荷，向正极移动。
• 用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥 分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核 酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的 。
(五) 4单位病毒液的配制
以出现红细胞凝集现象的最高稀释度为 1个单位,将原病毒液稀释成4倍于最高稀释 度的病毒液,即为4单位病毒液.例如:出现红 细胞凝集现象的最高稀释度是2的9次方(病 毒的血凝效价为2的9次方),那么, 4单位病 毒液就为2的7次方.
(六)病毒的红细胞凝集抑制试验
1、加生理盐水50μl于96孔板的一排的1-12孔。
采集新鲜的抗凝血,以生ຫໍສະໝຸດ 盐水洗3次,每次离心 5分钟,转速为4000转,最后用生理盐水配制成1%浓 度.
(四)红细胞凝集试验
1、50μl的生理盐水加入96孔微量板A 、 B行的1-12孔 。
2、被检病毒液50μl分别加入A 、 B行（一行为标准病 毒，一行为自己收集的病毒）的第一孔，然后倍比 稀释至第11孔，弃去50μl，12孔为阴性对照。
• 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA） 。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧 光产率也相对较低。
• 有一些低毒产品替代：sybr green、sybr gold、gene finder
电泳准备
• 用透明胶封固玻璃板两头，在板一端放置电泳梳子。 • 用1×TAE–buffer配制琼脂糖凝胶(0.24g
DNA电泳
• 取9μl的DNA样品与1μl的10*样品缓冲液（甘油， 溴酚蓝，DNA稳定剂）混合后，用微量取样器 慢慢将混合物加至样品孔中。
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DNA电泳
取9μl的DNA样品与1μl的10*样品缓冲液（甘油， 溴酚蓝，DNA稳定剂）混合后，用微量取样器 慢慢将混合物加至样品孔中。 盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极移动。 当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离（根据DNA的 大小、1kb和3kb左右的指示剂来判断）后，切 断电源，取出玻璃板，在紫外灯下观察，并拍照 记录结果，估测质粒分子量的大小。
二 实验原理
1:红细胞凝集 某些病毒（如流感病毒，新成疫病毒，麻疹 病毒等）拥有血凝素糖蛋白，可与人或某些 动物的红细胞表面的相应受体结合，从而呈 现红细胞凝集现象。在此，病毒与红细胞是 配体与受体的关系，而不是颗粒性抗原与相 应抗体作用的凝集反应。 这种凝聚多种病毒都具有，不是完全特异的
2:红细胞凝集抑制
溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA ）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其 荧光产率也相对较低。
有一些低毒产品替代：sybr green、sybr gold、gene finder
电泳准备
用透明胶封固玻璃板两头，在板一端放置电泳梳子。 用1×TAE–buffer配制琼脂糖凝胶(0.24g Agaros/32ml 1×TAE–buffer)，在微波炉中加热至 琼脂糖溶解。待溶液冷却至60℃，加入适量 Goldview(或溴化乙锭)至微红，混匀。 将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在57mm之间。 在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板 移至装有1×TAE–buffer的电泳槽中，轻轻地拔去梳 子，且使缓冲液没过胶面。
质粒DNA
3条带不是超螺旋、线性和开环这三条带。
碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA， 其实这三条带以电泳速度的快慢而排序， 分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没 有复制完全的两个质粒连在了一起）。
病毒的血凝和血凝抑制
一 实验目的
1:学会通过鸡胚接种增殖的病毒的收集 2: 掌握病毒血凝和血凝抑制试验的基本原理和基本 操作 3 ： 4单位病毒液的配制
以出现红细胞凝集现象的最高稀释度为 1个单位,将原病毒液稀释成4倍于最高稀释 度的病毒液,即为4单位病毒液.例如:出现红 细胞凝集现象的最高稀释度是2的9次方(病 毒的血凝效价为2的9次方),那么, 4单位病 毒液就为2的7次方.
(六)病毒的红细胞凝集抑制试验
1、加生理盐水50μl于96孔板的一排的1-12孔。
实验九 质粒电泳 病毒的血凝和血凝抑制
原理
与蛋白质分子类似，核酸 也是两性解离分子。 在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷 酸基团中只有一个磷酸解离，整个核酸分子带 正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为 8.0~8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离， 核酸分子带负电荷，向正极移动。
用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥 分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核 酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的 。
实验目的 实验原理 实验步骤 结果与分析 思考题 某一病毒能够引致血凝，是否可以判定它是何种 病毒？如果不行，应该再要进行什么实验？为什么？
下次实验
血清学试验（凝聚试验和ELISA)p163,171
4 红细胞的解脱现象
某些具红细胞凝集特性的病毒还拥有神经氨 酸酶活性，其可使病毒从红细胞上解脱下 来，因此，血凝试验的时间太长，可能会 在高浓度孔见到类似阴性的反应结果，实 验过程中必须控制好时间。
三 实验操作
(一)病毒的鸡胚接种与培养 (二)病毒尿囊液的收集
37度培养72小时的鸡胚--放置于4度冰箱,致 死鸡胚--消毒气室--用镊子打开气室-打开壳膜--用 移液器或吸管收集尿囊液于1.5毫升离心管--5000 转,离心5分钟,以去除细胞沉淀--上清液供血凝 和 血凝抑制试验作用. (三)制备1%浓度的鸡红细胞
采集新鲜的抗凝血,以生理盐水洗3次,每次离 心5分钟,转速为4000转,最后用生理盐水配制成 1%浓度.
(四)红细胞凝集试验
1、50μl的生理盐水加入96孔微量板A 、 B行的1-12 孔。
2、被检病毒液50μl分别加入A 、 B行（一行为标准 病毒，一行为自己收集的病毒）的第一孔，然后倍 比稀释至第11孔，弃去50μl，12孔为阴性对照。
载样缓冲液
其中含有的甘油可以使待电泳样品沉在 点样孔底部，避免样品漂浮 其中含有的溴酚蓝（某些还含有二甲苯 青）可以作为电泳速度度的指示分子， 溴酚蓝的迁移位置大约相当于200 bp左 右的线性DNA分子的迁移位置。
溴化乙锭
溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个 三环平面基团。它与DNA的结合无特异性。当染料分 子插入后，导致与DNA结合的染料呈现荧光，DNA吸 收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染 料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下 ，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处发射出 来。
当病毒被相应抗体中和后，则丧失了凝集红 细胞的功能，即病毒的红细胞凝集特性被抑 制。
3:利用已知抗体，可通过红细胞凝集抑制试验 鉴定某些具红细胞凝集特性的病毒，同样也 可利用已知病毒抗原，通过红细胞凝集抑制 试验来测定抗体水平，从而评价疫苗的免疫 效果，或动物是否受到病毒感染
血凝抑制试验是抗原抗体的特异性血清实验
3、加50μl的1%鸡红细胞于每一孔，按病毒的低浓度 至高浓度加入。
4、混匀、室温静止30min 。 5、确定红细胞100%凝聚的病毒的最高稀释度，为
HA滴度。
6、血凝效价（HA）的确定
将板直立，首先观察红细胞阴性对照， 应呈逗点状。红细胞凝集孔呈颗粒状附 于孔底。能凝集红细胞的最高稀释度即 为血凝效价。
2、加标准血清50μl于一排第一孔，倍比稀释到第11孔， 弃50μl。
3、将50μl病毒的4个血凝单位抗原加至1到第11孔。
4、然后加50μl的1%鸡红细胞至各孔，混匀，室温静置 30min 。
5、观察结果，确定血清的HI效价。血凝被抑制的抗体最 高稀释度即为血清抗体的血凝抑制效价（HI效价）。
实验报告