Hela细胞传代培养

Hela细胞传代培养

实验目的：掌握动物细胞培养的基本原理和方法。

实验用具：每组用具（移液枪一把，一盒枪头，长吸管一包（4-6根），培养瓶1个【4－8人为一组，看细胞数量来定，传代比例1；2最多1：3】。

实验药品：0.25％胰酶，D－Hanks，1640培养基

实验原理：

HeLa 是Henrietta Lacks的简称，Henrietta Lacks 是一位患有子宫颈癌的美国妇女的名字，在她死后，该细胞走被广泛散发到各研究机构，并无限次地繁殖分裂下去。

RPMI-1640培养粉 1袋

碳酸氢钠 2.0 g

青、链霉素各100单位／毫升加三蒸水至 1000ml, 过滤除菌。调节pH值至7.2

临用前加血清（终浓度 10％）

消化液的配置：

胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用灭菌的D－hanks配置。配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌

D－hanks配方:

氯化钠 8.0g

氯化钾 0.4g

磷酸氢二钠（Na2 HPO ·7H2 O） 0.06g

磷酸二氢钾0.06g

NaHCO3 0.35 g

EDTA二钠 0.2 g

酚红 0.02 g

三蒸水定容到1000毫升。PH调整到8.0。

血清的准备与添加

●优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。

●血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃水浴，30 分钟

培养用具的准备：

所用器具高压灭菌，D-hanks缓冲液。

酶液，培养液。

实验步骤：

1.打开超净台，把实验中所需用具放到超净台上。

2.从冰箱中取出0.25％胰酶、培养基。可以把胰酶和培养基的瓶盖拧松备用。

3.取待传代的细胞，倒掉旧的培养基，移液枪加入胰酶2ml（加入的量以覆盖整个细胞培养面为宜）。轻轻摇动

4. 1-2分钟后迅速将消化液倒掉。

注意：此步消化时间需要根据每次培养的细胞不同状态灵活掌握，没有固定时间。消化时间长短是实验成败的关键，宁可短消化，不能过消化。否则细胞会变死。在倒置显微镜下观察，当细胞质回缩，胞间间隙加大为消化适宜。

5．取培养基5 ml加入培养瓶终止消化，轻轻摇动，如果瓶壁依然有细胞未脱落，用长吸管反复轻轻吹打培养瓶壁，制备细胞细胞悬液。吹打的部位均匀，从上到小，从左到右，顺序进行吹打，保证各个部位的培养细胞均能吹打到，成片的细胞已经分散成小的细胞团或者单细胞便停止吹打。吹打时用力不要过猛，尽量不要出现气泡，以免损伤细胞。

6．至所有细胞从培养瓶壁脱落下来，轻轻摇匀，然后按照1：2或者1；3均分，每个培瓶（50ml）补齐到5 ml培养基，放入CO2培养箱中培养，放入之前瓶盖适当拧松，酒精喷雾消毒瓶盖和瓶身。

7．待培养基（本身为红色），当pH值降低，培养基呈偏淡红色时，一般2天以后，将旧的培养基吸掉，更换新鲜培养基继续培养。

注意：动物细胞特别容易污染，所有环节定要小心消毒。

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