分子排阻色谱法标准操作规程

分子排阻色谱法标准操作规程

1 简述

分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。常用于蛋白质与多肽的分子量测定、生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定和药品柱高分子杂质的测定。

生物大分子聚合物指分子大小不均一的多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等。

高分子杂质系指分子量大于药物主成分的高分子成分，通常是药物在生产或贮存过程中产生的高分子聚合物和生产过程中未除尽的药物蛋白结合物。

分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶（Sephadex）和聚丙烯酰胺凝胶（Sepharose）等为填充剂，这些填充剂表面分布着不同尺寸的孔径，药物分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔径内，大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在色谱柱中滞留时间较长，表面为保留时间较长；其余分子按分子大小依法被洗脱。为进行有效分离，应选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂。

2 对仪器的一般要求

2.1 参见高效液相色谱法项下高效液相色谱仪的使用要求。

2.2 具体仪器在使用前应详细参阅各自的操作说明书。

2.3 流动相流速不宜过高，一般为0.5～1.0ml/min。

2.4 除多糖的分子量与分子量分布的测定采用示差折光检测器，一般测定均采用紫外检测器。

3 测定前准备

3.1 流动相的制备参见高效液相色谱法项下流动相的制备要求，本法使用的流动相通常为水溶液或缓冲液，溶液的PH值不宜超出填充剂的耐受力，一般pH 值在2～8范围。流动相中可加入适量的有机溶剂，但不宜过浓，一般不应超过30%。

3.2 供试溶液的配制参见高效液相色谱法项下供试溶液配制的要求。

3.3 检查上次使用记录和仪器状态参见高效液相色谱法项下的要求。

4 测定法

4.1 分子量测定法本法一般适用于蛋白质和多肽的分子量测定，具体操作按各品种项下的规定进行。

4.1.1 系统适用性试验按各品种项下规定的色谱条件进行分离。色谱柱的理论板数（n）、分离度、重复性、拖尾因子的测定方法，在一般情况下，同高效液相色谱法项下方法，选用与供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品，除另有规定外，对照品与供试品均需使用二硫苏糖醇（DTT）和十二烷基硫酸钠（SDS）处理，以打开分子内和分子间的二硫键，并使分子的构型与构象趋于一致，经处理的蛋白质和多肽分子通常以线性形式分离，以对照品分子量（Mw）的对数值对相应的保留时间（tR）制得标准曲线的线性回归方程lgMw=a+bt

R 回归系数r应大于0.99.

4.1.2 样品测定供试品以保留时间由标准曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。

4.2 分子量与分子量分布的测定法本法一般适用于多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等具有分子大小不均一的生物大分子聚合物，具体操作按各品种项下的规定进行。

4.2.1 系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，规定分析

状态下色谱柱的最小理论板数（n）和供试品在该分析状态下的分配系数（K

d

）应达到规定的要求。

K

d =t

R

-t0/t

T

-to

式中 t

R

为供试品峰的保留时间；

to为完全被填料颗粒网孔排阻的大分子的保留时间；

t

T

为能自由进出填料颗粒网孔的小分子的保留时间。

4.2.2 系统校正根据供试品分子量大小，选用已知分子量与供试品分子结构与性质相同或相似的对照品，按各排阻项下规定的色谱条件进行分离，以对照品

分子量（Mw）的对数对相应的保留时间（t

R

）制得标准曲线的线性回归方程lgM

ω=a+bt

R

，回归系数r应大于0.99。

4.2.3 样品测定各品种项下规定的色谱条件进行分离，采用适宜的GPC软件处理结果，并按下列公式计算出供试品的分子量与分子量分布。

ΣR

Ii

Mn＝────────

Σ（R

Ii /M

i

）

Σ（R

Ii M

i

）

Mω＝──────────

ΣR

Ii

Mω

D＝───────────

Mn

式中 Mn为数均分子量；

Mω为重均分子量；

D为分布系数；

R

Ii

为供试品在保留时间i时的峰高；

Mi为供试品在保留时间i时的分子

量。

4.3 高分子杂质测定法按各品种项下规定的方法进行，本法一般适用于高分子量蛋白质和药物聚合物的测定。

4.3.1 系统适用性试验按各品种项下规定的色谱条件下进行分离。色谱柱的理论板数（n）、分离度、重复性、拖尾因子的测定方法，在一般情况下，同高效液相色谱法项下方法，但在某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时，常以二聚体峰高与单体和二聚体之间的峰谷之比作为分离度，除另有规定外，分离度应大于2.0。

4.3.2 样品测定按各品种项下规定的色谱条件下进行分离。

4.3.3 测定结果处理

4.3.3.1 主成分自身对照法同高效液相色谱法项下规定。一般用于高分子杂质含量较低的品种。

4.3.3.2 面积归一化法同高效液相色谱法项下规定。

4.3.3.3 限量法除另有规定外，规定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组分，一般用于混合物高分子物质的控制。