southern印记杂交
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转膜
• 即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支
持物上。而此过程最重要的是保持各DNA 片段的相对位置不变。DNA是沿与凝胶平 面垂直的方向移出并转移到膜上,因此, 凝胶中的DNA片段虽然在碱变性过程已经 变性成单链并已断裂,转移后各个DNA片 段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位 置仍然一样,故而称为印迹(blotting)。
Southern blot印迹杂交原理示意图
详细操作步骤
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一、 待测核酸样品的制备 二、 琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品 三、 电泳凝胶预处理 四、 转膜 五、 探针标记 六、 预杂交 七、 与标记分子杂交 八、 洗膜 九、 放射性自显影检测
电泳凝胶预处理
• DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构。为了
• Southern blot方法十分灵敏
注意事项:
• 1. 膜的大小及预杂交、杂交过程中所用试
剂的量可根据需要进行适当调整。 • 2.将凝胶中和至中性时,要测pH,防止 凝胶的碱性破坏硝酸纤维素膜。 • 3. 要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜 之间的气泡。
Southern 印迹杂交技术的应用
• 将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到
一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上, 即印迹(blotting)
• 固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的
温度和离子强度下退火,即分子杂交过程。
• 电泳
基本操作步骤:
• 将基因组DNA进行限制性内切酶消化 • 琼脂糖凝胶电泳分离 • DNA的转移与固定 • 核酸杂交 • 用适当的方式显色与鉴定
Southern blot 分子杂交
讲解人: 苏维岚 周知航
Southern印记杂交介绍
• 印迹法(blotting)即转移电泳,
Southern印记杂交法亦称作DNA印迹法。
• Southern建立了检测特异DNA片段的
DNA-RNA杂交法,称作Southern印迹 法。
Southern杂交技术原理
• 遗传病诊断 • DNA图谱分析 • PCR产物分析
遗传病诊断
• 临床水平层次 • 细胞水平 • 蛋白质水平 • 基因水平
无创DNA产前检测
21三体
ห้องสมุดไป่ตู้
13三体
That’s all, thank you !!
进行有效地实现Southern印迹转移,对电泳凝胶做预处 理十分必要。分子量超过10kb的较大的DNA片段与较 短的小分子量DNA相比,需要更长的转移时间。所以为 了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来,必须 将最长的DNA片段控制在大约2kb以下。DNA的大片段 必须被打成缺口以缩短其长度。因此,通常是将电泳凝 胶浸泡在0.25mol/L 的HCl溶液短暂的脱嘌呤处理之后, 移至于碱性溶液中浸泡,使DNA变性并断裂形成较短的 单链DNA片段,再用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓 冲液。这样,DNA片段经过碱变性作用,亦会使之保持 单链状态而易于同探针分子发生杂交作用。
预杂交
• 将固定亍膜上的DNA片段与探针进行杂交之前,
必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA 片段的膜同样能够结合探针DNA,在进行杂交前, 必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭, 这就是预杂交的目的。 预杂交的DNA是与哺乳类动物的同源性极低,不 会与DNA探针DNA杂交
•
Southern blot技术优点: