菌株分离鉴定、药敏实验及PCR扩增实验过程

目录

2.1菌株的分离纯化 (1)

2.1.1菌株的分离 (1)

2.1.2菌株的纯化 (1)

2.2菌株的鉴定 (2)

2.2.1革兰氏染色镜检 (2)

2.2.2菌株的生化鉴定 (2)

2.3药敏试验 (3)

2.3.1药物的配制 (3)

2.3.2质控 (4)

2.3.3MIC（最小抑菌浓度）实验 (4)

2.4 CTX- M型基因的PCR扩增模板的提取 (7)

2.5 CTX- M型基因的PCR扩增 (7)

2.5.1 PCR 扩增引物及条件 (7)

2.5.2电泳检测PCR扩增产物 (8)

2.1菌株的分离纯化

2.1.1菌株的分离

2.1.1.1实验的准备

1.分离管的准备：本实验需要100个50ml离心管

（1）用过的离心管，将盖子拧开，加入清洁剂，沸水浴10min，毛刷清洁；

（2）没入加入清洁剂的水中，灌满水，不要留有大气泡；

（3）放入超声清洁机中超声清洁45min，25℃,100Hz；

（4）倒出管中水，灌满去离子水，再超声20min，25℃，100 Hz；

（5）倒出管中水，重复（4）一次；

（6）倒出管中水，放入60℃烘箱中烘干；

（7）待烘干后装入保鲜袋中，扎孔通气，再用报纸或牛皮纸包好，放入高压锅中高压灭菌，121℃，20min；

（8）高压后取出放入烘箱中，烘干后待用。

2.BPW（蛋白胨水）的配制：按所选试剂的规格进行配制，再送入高压锅中高压灭菌，高压后放入烘箱中烘干待用。注意瓶装液体高压前一定要盖子拧松。

3.试管的准备：本实验需要100根试管

（1）塞子拔出，与试管一起放入清洁剂水中，沸水浴煮沸10min，毛刷清洁；

（2）10个一捆，于烘箱中烘干后，塞上塞子，报纸或牛皮纸包好，高压；

（3）取出后烘干待用。

4.LB肉汤培养液的准备：本实验需要100根LB管

根据所选购商品说明配制，将配制好的LB培养液，分装到100根干净试管，每根3ml，包好后于121℃高压15min，烘干待用。

5.麦康凯琼脂培养基的准备：

按所选商品说明配制，121℃高压15min，温度稍凉后于超净台中倒板，待吹干后收板待用。

2.1.1.2实验过程

（1）每个分离管装入20mlBPW；

（2）三点取样剪取100份待检肉样分装到100个分离管中，按肉样的标号在分离管上标号，放入37±1℃温箱摇床上培养6h，200r；

（3）取分离管中的菌液50μL加入LB管中，标号，37±1℃温箱摇床上培养10-12h，200r；

（4）用接种环取一环菌液画到麦康凯琼脂培养基上，标号，37±1℃温箱过夜培养。

2.1.2菌株的纯化

2.1.2.1实验的准备

1.伊红美兰（EMB）琼脂培养基的准备：

按所选商品的规格配制，121℃高压15min，温度稍凉后于超净台中倒板，待吹干后收板待用。

2. LB肉汤培养液的准备：同2.5.1.1.1中LB肉汤培养液的准备。

2.1.2.2实验过程

（1）接菌：用2.5μL或10μL移液枪的枪头挑取麦康凯琼脂培养基上的单菌落，将枪头打到LB管中，标号，37±1℃温箱摇床上培养10-12h，200r；

（2）划板：用接种环取一环菌液画到麦康凯琼脂培养基上，标号，37±1℃温箱过夜培养；

（3）用接种环挑取麦康凯琼脂培养基上的单菌落划到EMB板上，标号，37±1℃温箱培养18-20h；

2.2菌株的鉴定

2.2.1革兰氏染色镜检

在麦康凯琼脂上长出红色的菌落，在伊红美兰琼脂上长出黑色、带金属光泽的菌落。挑取典型菌接种于MH肉汤培养基，37± 1 ℃培养12-24 h，取出1接种环菌液进行固定、革兰氏染色和镜检，根据细菌形态和染色特点，将革兰氏染色为阴性、两端钝圆、无芽胞、中等大小的杆菌初步判定为大肠杆菌。

2.2.2菌株的生化鉴定

1.实验准备

生理盐水、液体石蜡高压进行灭菌，待用。

提前复活菌株，吸取30-50μL甘油保存菌液于LB肉汤，摇床培养3-5h（时间因菌株活性不同做适当调整，此步主要是保证菌株全部复活）。

纯化菌株：将LB肉汤复活的菌株接种到麦康凯板，37℃过夜培养，18-24h。要求所有受试菌株必须是单一的菌落形态而且有单个菌落存在。

2.实验过程

（1）接种前准备

安瓿瓶：从包装盒中取出安瓿瓶，朝易折点(瓶颈上蓝点)反方向用力折开安瓿瓶，或用砂轮划一圈安瓿瓶瓶颈处，然后用力掰开安瓿瓶，插入安瓿瓶架或双面板中。

试管：从包装盒中取出试管，插入试管架中。

注：如果染菌或变色，则不能使用，重新拿一支。折开安瓿瓶时最好包裹纱布，以免划伤手指。

（2）接种方法

直接接种：用接种针从平板上挑取已纯化分离的菌落接种于需要试验的安瓿瓶（试管）中。

菌悬液法：取一内盛有2ml无菌水试管，用接种针从平板上挑取已纯化单个菌落至无菌水中仔细研磨制成0.5麦氏浊度的均一细菌悬液，滴入需要试验的试管（安瓿瓶）中，每管3滴。

注：如内容物为半固体或半固体生化管，采取直接穿刺接种。

（3）接种完后用封口膜封口放于37±1℃培养箱中培养或根据检测标准中所规定的培养温度进行培养。

注意，肠杆菌科葡萄糖鉴定管接菌后封口，倒放置进行培养；氨基酸类的要先用石蜡封口。

(4)读生化鉴定的结果，根据肠杆菌科细菌生化鉴定编码册查找到菌株的菌名以及阳性机率。生化反应判断标准见表1，其中蛋白胨水需加靛基质溶液，苯丙氨酸需加三氯化铁溶液，之后观察颜色变化。葡萄糖产酸为阳性变成黄色标记A，不产酸则为阴性颜色不变，产气则标记G，即产酸产气标记为AG，产酸不产气标记为A，产气不产酸标记为G。

果萄

糖氨

酸

氨

酸

化

氢

白

胨

水

糖茅

醇

丙

氨

酸

素橼

酸

盐

阴性紫色黄色黄色无色无色紫色紫色无色黄色绿色

阳性黄色紫红紫红灰褐红色黄色黄色绿色

环

红色蓝色经生化反应鉴定为大肠杆菌者，用大接种环在接有分离纯化菌株的LB琼脂平板上轻轻刮取菌落，接到含1 mL 30%甘油肉汤的EP管中；放于-20 ℃冰箱中保存，便于后续实验用。如要长久保存，可用磁珠式菌种保藏管于-80 ℃冰箱中保存菌株。

2.3药敏试验

2.3.1药物的配制

2.3.1.1实验准备

1.储药管的准备：用50ml离心管做为储药管，其准备过程同

2.5.1.1.1中分离管的准备。

2.虑管的准备：虑管用保鲜膜包好后放于烧杯中，报纸或牛皮纸封口，于121℃高压20min，烘干待用。

2.3.1.2实验过程

本实验所用药品需要配制成浓度为5120μg /mL，体积40 mL。

（1）称药：根据所购药品的包装上的浓度计算所要称量的药品量。如果包装上没有注明药品浓度可根据瓶装药品按5120×40/90% = 0.2276 g 称取；

袋装药品按5120×40/95% = 0.2156 g 称取。

（2）溶解药品：根据每种药品的溶解方法来溶解以及定容称量好的药品；如氨苄西林（AMP）用超纯水溶解即可，然后定容到40ml；氯霉素（CHL）用95%的乙醇溶解后，定容到40ml；环丙沙星（CIP）用10%的醋酸溶解后，定容到40ml。

表2 抗菌药物的质控范围及稀释浓度梯度

抗菌药物溶剂质控范围稀释浓度梯度

氨苄西林AMP超纯水2-8 0.5-512

头孢噻呋CTF PBS+PBC0.25-1 0.125-512

头孢噻肟CTX超纯水0.03-0.12 0.008-512

头孢他啶CTZ超纯水0.06-0.5 0.03-512

头孢曲松CTR超纯水0.03-0.12 0.008-512

头孢西丁CXT超纯水2-8 0.25-512

庆大霉素GEN超纯水0.25-1 0.25-512

卡那霉素KAN超纯水1-4 0.5-512

四环素TET超纯水0.5-2 0.25-512