生物药物分析与检验电泳分析法
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
将滤纸条水平地架设在两个装 有缓冲溶液的容器之间，样品点 于滤纸中央。当滤纸条被缓冲液 润湿后，再盖上绝缘密封罩，即 可由电泳电源输入直流电压 （100V～1000V）进行电泳。
平卧式电泳槽装置示意图
(二) 醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持介质。醋酸纤维素是纤维 素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。它溶于丙酮等有机 溶剂，可涂布成均一细密的微孔薄膜，即醋酸纤维素膜 （cellulose acetate membrane，简称CAM）。
优缺点
优点： 精确性高。 快速省时。一般电泳45-60min即可。 灵敏度高，样品用量少。 应用面广。如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋
酸纤维薄膜电泳能较好地分离。 有利于扫描定量及长期保存。
缺点： 分离效果不太好。
醋酸纤维素薄膜电泳示意图
实验操作步骤
（1）预处理 膜的准备：根据分离样品的多少将醋酸纤维薄膜裁切成合适的大
以生物大分子为例阐明电荷来源
COOH
╱ R
+ OH-
╲
+ H+
NH3+
COO╱
R ╲ NH3+
+ OH+ H+
pH<pI
pH=pI
COO╱ R ╲
NH2
pH>pI
n 2000年版药典包括5种电泳技术:纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS－聚丙 烯酰胺凝胶电泳
（二）按分离原理分类
1、自由界面电泳 2、区带电泳 3、高效毛细管电泳
❖ 自由界面电泳 ：在没有惰性支持物的液体接界 面上进行的电泳。
缺点：对流较严重，组分不能完全分离，检测困难
❖ 区带电泳： 是在溶液中加入一些惰性物质或凝胶 物质作为支持物，泳动物质在支持物间隙中移动 的电泳方法。 避免对流的干扰。
（2）加样
Ø 用铅笔在薄膜无光泽面一端2cm处画一细线，加样时平稳地前后 或左右来回移动加样器，于细线处加样。
v/E表示迁移率，也称淌度，以U表示
U=v/E=Q/6πrη
带电粒子的电泳淌度在一定条件下取决于粒子本身的性质，即与 其所带电量成正比；与其半径及介质粘度成反比。
电泳淌度
❖ 电泳淌度 (Electrophoretic Mobility)是单位场强下
离子的平均电泳速度。因为电泳速度与外加电场 强度有关，所以，在电泳中常用淌度而不用速度 来描述荷电离子的电泳行为和特性。
F QE
而离子/粒子在运动时会受到一定的溶液阻力（F’），对于球形离子/ 粒子，此阻力服从Stoke’定律，即
F'=6πrηv
在上式中，r为离子/粒子的半径，η为溶液或介质的黏度，v为粒子 运动速度。
❖ 当电泳达到稳态时，电动力等于介质的阻力，即F=F’。因此， 我们得到
QE=6πrηv
v/E=Q/6πrη
一、定义及原理
1、电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动 的现象。
2、原理 电泳技术就是利用在电场作用下，根据待分离样品中各种分子带电
性质以及分子本身大小、性状等性质的差异，使带电分子产生不同的 迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。
3、应用：电泳技术除了用于小分子物质 (无机盐、氨基酸、核苷酸、 脂类)的分离分析外，最主要用于生物大分子 (蛋白质、核酸、酶) 的研究。
小，在膜片无光泽的一面上用铅笔轻轻划一条加样线。加样线可 选在距膜片一端2～3cm处，有时也可选在膜片的中央线附近。 膜片浸透：在一浅碟或培养皿中倒入所选择的缓冲液，将膜片小 心地浮铺在缓冲液面上，将膜片的的无光泽面朝下。膜片的底面 吸收电极缓冲液后逐渐下沉，直至电极缓冲液将膜片完全浸透。 膜片在电极缓冲液完全浸透后，用钝头镊子取出，稍稍用滤纸吸 去多余的缓冲液，然后将膜片夹在两层滤纸之间吸干多余的缓冲 液，但不能吸得过干而出现不透明的白色部分。
1937年，蒂塞利乌斯（ Tiselius，瑞典)将蛋白质 混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行 自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合 液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；发现样品的迁 移速度和方向由其电荷和淌度决定。
第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；
1948年，获诺贝尔化学奖。
1959年，Raymond和Weintraub利用人工合成的 凝胶作为支持电解质，创造了聚丙烯酰胺凝胶电泳， 极大地提高了区带电泳的分辨率。
生物药物分析与检验电泳分析法
电泳分析法
电泳的发展
1807-1809年，俄国物理学家F.F.Reuss首次发 现黏土颗粒的电迁移现象，并开始研究带电粒子在 电场中的电迁移行为，测定它们的迁移速度。
1907年，Field 和Teague研究出填充有琼脂糖 凝胶的桥管，成功地分离了白喉毒素和它的抗体。
U=v/E=Q/6πrη
影响电泳迁移率的因素(必考)：
1、影响电泳迁移率的外界因素： J 电场强度
J 溶液的pH值 J 溶液的离子强度
J 电渗现象 J 溶液的温度和黏度
J 分子筛效应 2.影响电泳迁移率的内在因素：
J 质点所带净电荷的量 J 质点的大小和形状
wk.baidu.com
（一）纸电泳
指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。
n 2005年版药典增加毛细管电泳法
二、电泳分类
（一）按有无固体支持物分类
按有无固体支持物可以分为两类：自由界面电泳和支持物电泳。
1、自由界面电泳即溶质在自由溶液中泳动，包括：等电聚焦电泳、 等速电泳等。 2、支持物电泳根据所用的支持物不同又可分为纸电泳、醋酸纤维 薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。 3、根据支持载体的位置或形状可分成：水平电泳、垂直板式电泳、 垂直柱式电泳、U型管电泳、毛细管电泳等。
纸电泳 醋酸纤维素电泳 琼脂糖电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳
DNA序列分析电泳槽
中型双垂直电泳槽
实验室常见的电泳装置
（ 核水 酸平 电电 泳泳
） （
蛋 白 质
电 泳
垂 直 电 泳
）
1、区带电泳基本理论
在众多电泳技术中，最常用的为区带电泳，同时也是最简洁的电 泳模式。推动离子/粒子作区带电泳的驱动力为电场力（F），离 子/粒子所受电场力的大小与离子/粒子的净电荷（Q）和电场强 度（E）呈正比关系，即：
平卧式电泳槽装置示意图
(二) 醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持介质。醋酸纤维素是纤维 素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。它溶于丙酮等有机 溶剂，可涂布成均一细密的微孔薄膜，即醋酸纤维素膜 （cellulose acetate membrane，简称CAM）。
优缺点
优点： 精确性高。 快速省时。一般电泳45-60min即可。 灵敏度高，样品用量少。 应用面广。如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋
酸纤维薄膜电泳能较好地分离。 有利于扫描定量及长期保存。
缺点： 分离效果不太好。
醋酸纤维素薄膜电泳示意图
实验操作步骤
（1）预处理 膜的准备：根据分离样品的多少将醋酸纤维薄膜裁切成合适的大
以生物大分子为例阐明电荷来源
COOH
╱ R
+ OH-
╲
+ H+
NH3+
COO╱
R ╲ NH3+
+ OH+ H+
pH<pI
pH=pI
COO╱ R ╲
NH2
pH>pI
n 2000年版药典包括5种电泳技术:纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS－聚丙 烯酰胺凝胶电泳
（二）按分离原理分类
1、自由界面电泳 2、区带电泳 3、高效毛细管电泳
❖ 自由界面电泳 ：在没有惰性支持物的液体接界 面上进行的电泳。
缺点：对流较严重，组分不能完全分离，检测困难
❖ 区带电泳： 是在溶液中加入一些惰性物质或凝胶 物质作为支持物，泳动物质在支持物间隙中移动 的电泳方法。 避免对流的干扰。
（2）加样
Ø 用铅笔在薄膜无光泽面一端2cm处画一细线，加样时平稳地前后 或左右来回移动加样器，于细线处加样。
v/E表示迁移率，也称淌度，以U表示
U=v/E=Q/6πrη
带电粒子的电泳淌度在一定条件下取决于粒子本身的性质，即与 其所带电量成正比；与其半径及介质粘度成反比。
电泳淌度
❖ 电泳淌度 (Electrophoretic Mobility)是单位场强下
离子的平均电泳速度。因为电泳速度与外加电场 强度有关，所以，在电泳中常用淌度而不用速度 来描述荷电离子的电泳行为和特性。
F QE
而离子/粒子在运动时会受到一定的溶液阻力（F’），对于球形离子/ 粒子，此阻力服从Stoke’定律，即
F'=6πrηv
在上式中，r为离子/粒子的半径，η为溶液或介质的黏度，v为粒子 运动速度。
❖ 当电泳达到稳态时，电动力等于介质的阻力，即F=F’。因此， 我们得到
QE=6πrηv
v/E=Q/6πrη
一、定义及原理
1、电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动 的现象。
2、原理 电泳技术就是利用在电场作用下，根据待分离样品中各种分子带电
性质以及分子本身大小、性状等性质的差异，使带电分子产生不同的 迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。
3、应用：电泳技术除了用于小分子物质 (无机盐、氨基酸、核苷酸、 脂类)的分离分析外，最主要用于生物大分子 (蛋白质、核酸、酶) 的研究。
小，在膜片无光泽的一面上用铅笔轻轻划一条加样线。加样线可 选在距膜片一端2～3cm处，有时也可选在膜片的中央线附近。 膜片浸透：在一浅碟或培养皿中倒入所选择的缓冲液，将膜片小 心地浮铺在缓冲液面上，将膜片的的无光泽面朝下。膜片的底面 吸收电极缓冲液后逐渐下沉，直至电极缓冲液将膜片完全浸透。 膜片在电极缓冲液完全浸透后，用钝头镊子取出，稍稍用滤纸吸 去多余的缓冲液，然后将膜片夹在两层滤纸之间吸干多余的缓冲 液，但不能吸得过干而出现不透明的白色部分。
1937年，蒂塞利乌斯（ Tiselius，瑞典)将蛋白质 混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行 自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合 液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；发现样品的迁 移速度和方向由其电荷和淌度决定。
第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；
1948年，获诺贝尔化学奖。
1959年，Raymond和Weintraub利用人工合成的 凝胶作为支持电解质，创造了聚丙烯酰胺凝胶电泳， 极大地提高了区带电泳的分辨率。
生物药物分析与检验电泳分析法
电泳分析法
电泳的发展
1807-1809年，俄国物理学家F.F.Reuss首次发 现黏土颗粒的电迁移现象，并开始研究带电粒子在 电场中的电迁移行为，测定它们的迁移速度。
1907年，Field 和Teague研究出填充有琼脂糖 凝胶的桥管，成功地分离了白喉毒素和它的抗体。
U=v/E=Q/6πrη
影响电泳迁移率的因素(必考)：
1、影响电泳迁移率的外界因素： J 电场强度
J 溶液的pH值 J 溶液的离子强度
J 电渗现象 J 溶液的温度和黏度
J 分子筛效应 2.影响电泳迁移率的内在因素：
J 质点所带净电荷的量 J 质点的大小和形状
wk.baidu.com
（一）纸电泳
指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。
n 2005年版药典增加毛细管电泳法
二、电泳分类
（一）按有无固体支持物分类
按有无固体支持物可以分为两类：自由界面电泳和支持物电泳。
1、自由界面电泳即溶质在自由溶液中泳动，包括：等电聚焦电泳、 等速电泳等。 2、支持物电泳根据所用的支持物不同又可分为纸电泳、醋酸纤维 薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。 3、根据支持载体的位置或形状可分成：水平电泳、垂直板式电泳、 垂直柱式电泳、U型管电泳、毛细管电泳等。
纸电泳 醋酸纤维素电泳 琼脂糖电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳
DNA序列分析电泳槽
中型双垂直电泳槽
实验室常见的电泳装置
（ 核水 酸平 电电 泳泳
） （
蛋 白 质
电 泳
垂 直 电 泳
）
1、区带电泳基本理论
在众多电泳技术中，最常用的为区带电泳，同时也是最简洁的电 泳模式。推动离子/粒子作区带电泳的驱动力为电场力（F），离 子/粒子所受电场力的大小与离子/粒子的净电荷（Q）和电场强 度（E）呈正比关系，即：