克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用

设计了一套完整的引物和方法用于IG和TCR基因重排的 克隆性分析，共有14管97对引物 管 对引物 IGH（A,B,C,D,E 5管） IGK（A，B 2管） IGL（1管） TCRB A B C 3 TCRB（A，B，C 3管） TCRG（A，B 2管） TCRD(1 管)
Van Dongen JJM et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the Biomed-2 concerted action BMH4-C98-3936 Leukemia 2003;17:2257-2317
所有引物采用相同的扩增条件和检测方法，并具有 很高的敏感性和特异性， 已被推荐为可疑淋巴组织增生性疾病克隆性分析的 标准方法，试剂已商品化
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PCR产物分析方法 产物分析方法
1. 聚丙稀酰胺凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)-异源双链分析 异源双链分析
(4) 淋巴瘤谱系的判断
T or (富于 B? T or NK/T? , T or γδ-T ? 富于T) 富于
34M, 右面部肿胀5月，CD56-, TIA+, PE+, EBER+, TCRr (-), TCRb (-)
CD56
内γ 1
γ2 β1β2
TCRγ(-) TCRβ(-)
EBER
(5） 比较两个淋巴瘤克隆性的相关性， 或区别复发和第二原发肿瘤。 组织细胞/树突细胞肉瘤- ALL, T淋母
CP2171： FR1 (+), FR2(+), FR3(-) 诊断：（左腮腺）符合MALT边缘区B细胞淋巴瘤
（2） 形态和免疫组化均可考虑为淋巴瘤 但部位少见或发病年龄不典型 基因重排克隆性分析可增加诊断的依据
54M, 舌跟部肿块， PTCL 1M, 左颈鸡蛋大肿块, PTCL? 17 F, 右颈部淋巴结 FL 38M, 左颈部淋巴结 AILT
If not clonal
No evidence 0f presence of clonal B/T population in the samele
结果的解释和注意事项
克隆性不等于恶性： 1. 克隆性不等于恶性： 有些良性病变有时也有克隆性重排
• • • • • • •
•
CD8+（有时CD4+) T 细胞增生症 良性单克隆性r球蛋白病 r EBV阳性的淋巴细胞增生 （AILT) 自身免疫性疾病(Sjogren 综合症,风湿性关节炎) 免疫缺陷状态(先天性,移植后,HIV感染) 免疫调节异常疾病（Castleman 病） 皮肤异常病变（淋巴瘤样丘疹病，急性苔藓样糠疹）
单克隆性细胞产生一个或两个尖的峰，多克隆为多个小峰，呈Gaussian分布。 （本课题组曾用两种方法分析180管皮肤淋巴瘤的TCR基因重排，两者的符合 率为96.7%, 在TCRB用genescan方法稍敏感，在TCRD用PAGE更特异。）
对照的设立
FR2 FR3A TCRG1 TCRG2 TCRB1 TCRB2
TCRB Preferably with TCRG
Clonal No evidence of clonality
TCRG and TCRD
Results should be considered in the context of all available clinical, histological and immunophenotypic data
IGHB+IGKA+B
TCRGA+B
TCRαβ TCRγδ
If not clonal
IGHA+C+D IGHB+IGKA+B
Lineage unknown
TCRBA+B
TCRBA+B+C
TCRBc +TCRD
If not clonal
IGL+IGHE
TCRBC+TCRD B
Preferably with
TCRγδ+ Proliferations or immature T-cell
IGH (VH-JH) Preferably with IGK No clonality but still suspected IGH (DH-JH) Preferably with IGL
Clonal (generally multiiple Clonal results)
30例LyP病例TCR基因重排总体阳性率80% 20例CALCL病例TCR基因重排总体阳性率100%， 两组病例TCR基因重排阳性率无统计学差别（P>0.05) 表明TCR基因重排在LyP和CALCL的鉴别中无应用价值。
必须结合临床病史
基因重排不一定是谱系的标志： ２．Ig和TCR基因重排不一定是谱系的标志： 和 基因重排不一定是谱系的标志 某些T、 淋巴瘤有基因重排的交叉 某些 、B淋巴瘤有基因重排的交叉
( 6） 外周血和骨髓累及情况
胃DLBCL
胃DLBCL，要求观 察外周血累及情况
外周血
MRD理想的检测方法： 理想的检测方法： 理想的检测方法 活检组织的PCR产物克隆， 对连接区进行测序， 再设计病人特异的引物做real-PCR进行MRD的评价
应用策略
• 采用所有引物组，工作量大，不实用，没 有必要， 有交叉和重叠
克隆性基因重排在淋巴瘤诊断中的应用
NCCN NHL Lymphoma Guidelines
Evaluation of the Suspicious Lymph Node
Clinically Suspicious LN Carcinoma v. Lymphoma Suspect Lymphoma
FNA With Flow Cytometry
BMH4－CT983936的欧洲 － 的欧洲BIOMED－2 协作研究 的欧洲 －
该协作研究由47个研究所组成7个网络和一个病理panel。它由 分子生物学、免疫学、血液学、病理学等领域的专家。
1998.6-2002.7， 12次国际性会议。
主要目的： （1）开发和标准化PCR实验操作和PCR引物 （2） 评价和应用该标准化方法
淋巴细胞发育过程中基因重排顺序
• IG: H重排→κ: IgH/κ κ缺失 →λ： IgH/λ TCR: δ→γ：TCRδγ β→α：TCR α β
淋巴瘤中基因重排形式 ——克隆性重排 克隆性重排
不同的淋巴细胞 相同的重排形式 淋巴细胞单克隆性增生 淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子指标
克隆性重排的检测方法
T,B之间：不成熟的T或B相对频繁 TCRab, TCRrd之间
细胞性白血病/细胞淋巴瘤 前T细胞性白血病 细胞淋巴瘤 细胞性白血病 前B细胞性白血病/淋巴瘤，非特殊类型
几乎所有都存在TCR克隆性重排，但大 克隆性重排， 几乎所有都存在 克隆性重排 同时伴有IGH基因重排 约20%同时伴有 同时伴有 基因重排 均有IGH DJ 区克隆性重排 ＞70% 存在TCR， 重排对谱系鉴定无帮 助 共同表达多克隆性IG亚型，认为存在多 点亚型转换阻滞 TCRγ，TCRβ克隆性重排，存在TCRγδ， TCRαβ交叉 没有IG和TCR克隆性重排 没有IG和TCR克隆性重排 大多IG及TCR无重排，少数因存在反应 性细胞毒性T细胞导致TCR克隆性重排 TCRγ克隆性重排 Γδ来源的存在等位的TCRγ克隆性重排 αβ来源的一部分存在TCRβ克隆性重排， 一部分未产生TCRβ克隆性重排
Liu et al. British J Haematol 2007;138：31-43 ：
Suspected Lymphoid Proliferations of unknown origin (B or T)
Suspected B-cell Proliferations
Suspected T-cell Proliferations
Biopsy Morphology with IHC If necessary, Molecular Dx Cytogenetics/ FISH （5-10%） ）
Carcinoma CLL
Suspect Lymphoma, Negative or Non-diagnostic
Workup for Primary
- + - + -+ - + - +- +
• 阳性对照 • 阴性对照
•内对照: 3个病例的内对照b-actin均为阳性
对照的设立
－＋－＋－＋－＋－＋－＋
2007-01-04 control and 1
克隆性基因重排的应用
诊断与鉴别诊断 谱系确定 分期 克隆相关性判断
（1）形态和IHC不能得出肯定结论的淋巴组织增生性病变
FISH
Diagnosis
Treatment
Staging and Treatment
分子和细胞遗传学异常
• 抗原受体基因的克隆性重排 • 与类型相关的染色体异常
简要原理 检测方法 应用和策略 注意事项
淋巴细胞表面受体
IG： IGH （14q32) ： IGL κ (2q12) λ (22q11) TCR: TCRα TCRβ TCRγ TCRδ
14q11 7q32 7p15 14q11.2
IG和TCR基因结构及重排过程 和 基因结构及重排过程
胚 胚系 系
D-J重排 V-D-J重排 转录与拼接
可变区
恒定区
各区片段数多 重排的多样性 抗体多样性
IGH V D J 66 27 6
IGK 43 76 5
IGL 38 56 5
TCRA TCRB TCRG TCRD 46 54 61 47 67 13 6 9 5 8 8 4
克隆性重排判断基本原则：
1. 条带在期望的碱基大小范围内；一条或两条 条带在期望的碱基大小范围内； 2. 带宽不超过 带宽不超过1mm, 3. 边缘整齐； 边缘整齐；
+
多克隆性： 无特异性条带， 多克隆性： 无特异性条带，弥散带或梯状带
2. 毛细管电泳基因扫描（genescan） 毛细管电泳基因扫描（ ）
17F, 右颈淋巴结肿大
CD20Leabharlann Baidu-+-+-+-+
内 FR1 FR2 FR3
Bcl-2
3. 组织小或无法取得组织病变的诊断
• 深部肿块的穿刺或活检标本如胃镜标本 • 无明显肿块，仅表现为胸腹水 但要特别注意细胞的量 52M ， 左眼内吸取物 细胞涂片检查：见恶性肿瘤细胞，小圆细 胞肿瘤，倾向淋巴瘤 基因重排：FR1(+), FR2(+), FR3(-)
• 合理的应用策略——以最少的引物组最大 可能地检测克隆性
Van Krieken, et al. Leukemia 2007;21:201-206
Suspected B-cell Proliferations Suspected Lymphoid Proliferations of unknown origin (B or T) Suspected T-cell Proliferations
胃肠道、肺、涎腺、甲状腺、眼眶等部位的MALT淋巴瘤 滤泡性淋巴瘤、皮肤淋巴瘤和T细胞淋巴瘤 形态不典型，缺乏特异性标记
CP2170, 66M, 胃黏膜活检 CP2171, 43F, 左腮腺肿块
明显的浆样分化细胞
- + - + - +
CP2170 ： FR1 (+), FR2(+), FR3(+) 诊断： （胃）小B细胞淋巴瘤，倾向MALT边缘区B细胞淋巴瘤
新鲜、冻存、石蜡、显微切割或细胞学标本， 不受DNA片段的影响，仅需要少量的DNA， 时间短，敏感性高，
是目前最常用的克隆性重排的检测方法。
引物的选择原则
引物位置：PCR产物长度<300bp (最好在100－300bp） 离连接区的距离>10-15bp 引物本身的长度<25bp 精确地将所有VDJ基因片段捡出 家族性引物或通用引物 不同的组合具有互补性，提高阳性率 引物数目和同源性之间平衡
• Southern 杂交 • PCR法
Southern 杂交
特异性探针： 胚系的特征性片段外 另一不同大小的片段 • 优点： 敏感性较高 可靠性高 • 缺点： DNA量多（10ug) 新鲜组织 操作复杂 时间长、成本高 放射性同位素 逐渐被PCR方法替代．
PCR法
原理: 原理 VDJ重排 后相互靠拢，用适当的引物可扩增 出重排片段