荧光定量PCR核酸检测技术

本试剂盒的灵敏度约为103copies/ml，相当于ROCHE 试剂盒的104copies/ml。
荧光定量PCR试剂盒检测 试剂盒检测HBV-DNA结果 荧光定量 试剂盒检测 结果 与临床的关系
标本类别
H bsA g/H B eA g/ 抗 H B c 阳 性 H bsA g/ 抗 H B e/ 抗 H B c 阳 性 其他乙肝血清标志物阳性 非乙型肝炎 助血员 合计 标本数 110 110 147 49 105 521 阳性数 108 52 53 0 0 213 阳性率 98.2 47.3 36.1 0 0 41.6
微孔板杂交技术原理示意图
• 主要优点： 1. 杂交部分操作类似于ELISA，实验人员 较熟悉； 2.可向全自动过度； 3.可定量操作。 • 主要缺点： 1.分型困难； 2.试剂成本较高； 3.操作较复杂。
荧光PCR技术原理
• 荧光PCR试剂比常规PCR试剂多一个寡聚核苷 酸探针，这个探针带有一个荧光发光分子和一 个荧光淬灭分子，完整的探针在激发光激发下， 发光分子所产生的荧光被淬灭分子全部吸收， 样品无荧光。而PCR过程中。Taq酶分子在链 延长过程中可以通过自身的5’ 3’核酸外切酶降 解与模板结合的特异性荧光探针，使得荧光发 光分子从探针上切下来而与荧光淬灭分子分开， 从而在激发光激发下产生特定波长的荧光，这 种荧光随着PCR扩增过程而动态增强。
N=32
14
微孔板 低 酶标仪
微孔板 较低 PCR 扩增仪 酶标仪
微孔板 高 Chiron 公司 仪器
设备投入 临床应用 价值 是否易临 床推广 原因
低 低
低 高
高 低
否 设备昂贵， 设备昂贵， 仪器利用率 低
是 较少的设备 投入， 投入，同样 可应用荧光 定量技术
否 临床应用意 义不大
是 设备成本低， 设备成本低， 常规操作
经统计，X2=1.15，P<0.05，表明在HBsAg/HBeAg/抗HBc阳性和HBsAg/抗 HBe/抗HBc阳性组中病毒载量的差异显著，HBV DNA 和HBeAg密切相关。 该定量结果能够反映在这两种血清学模式中病毒DNA的复制情况，对于临 床辅助诊断有重要作用。
慢性肝炎患者干扰能治疗过程中病毒核酸 的动态变化
• 结论： – HBV-DNA值的变化充分反映了干扰能抑制病毒复 制的作用明显，且HBV-DNA的变化较eAg阴转和 ALT下降更敏感、更确切的反映了干扰能的疗效。 – 对于每一病例应具体分析，力争以HBV-DNA值作 为观察疗效的指标，决定适当的剂量，反复或更长 的疗程，也许是未来抗病毒治疗的方向。
表. 在HBsAg/HBeAg/抗HBc阳性和HBsAg/抗 HBe/抗HBc阳性组中病毒载量频数分布
频数 >10 8 10 7 — 10 8 10 6 — 10 7 10 5 — 10 6 10 4 — 10 5 <10 4 中位数 HBsAg/HBeAg/抗 HBc 阳 性 合计 4 37 35 16 10 6 5.0× 10 6 copies/ml HBsAg/抗 HBe/抗 HBc 阳 性 合计 0 4 5 19 13 11 1.3× 10 5 copies/ml
•前PCR区2（标本制备实验室） 前PCR区 用途：该实验室用于分离和抽提病原微生物中的核酸， 用途 防止因标本处理而引起的实验室感染和检测的交叉污 染。 基本设备： 基本设备：1.实验室应有紫外灯；2. 超净台或PCR防 污染罩；3.冰箱（4℃，-20℃）；4. 高压灭菌器(处理 传染性标本和物品)；5.高速和低速离心机、旋涡振荡器、 各种规格移液器（0-10ul、40-200ul、50-1000ul）等； 6. 高压灭菌的各种Eppendorf管和移液器吸嘴；7. 专用 文具用品；8.救护药箱，包括外伤用药，眼睛冲洗液等； 9. 实验桌椅（实验台台面防酸、防碱和耐热）；10.电 话机（备有关临床医生的电话号码，以便因突发事件及 时联系）；11.自来水设备。
定量技术比较
荧光定量法 是否有 PCR 扩增 检测 灵敏 度 试剂盒 形 式 试剂成本 主要设备 形式 分子杂交法 竞争性 PCRELISA 定量法 是 4-40 copy/ml bDNA 法
是 5copy/ml
否 10pg/ml 10pg/ml
否 2.0*105 copy/ml
荧光定量试剂盒 国产试剂盒，成本较低 国产试剂盒， 扩增仪， 自动化荧光 PCR 扩增仪， PCR 扩增仪 国产荧光检 测仪 高 较低 高 高
对HBV抗病毒治疗的定量检测建议
• 针对拉米夫定治疗乙型肝炎的定量检测 建议 • 针对干扰素治疗乙型肝炎的定量检测建 议 • 可以研究联合用药，并用定量检测来评 估疗效
针对拉米夫定治疗乙型肝炎的定量检测建议
根据《拉米夫定临床应用指导意见》（由“拉米夫定临床 应用专家指导小组”制定），我们提出了以下对乙型肝炎 病人的定量检测建议： • 病人的选择：HBV DNA 定量检测； • 观察项目及随访：
通过监测HCV病毒滴度反映疗效 病毒滴度反映疗效 通过监测
10000000 Median HCV RNA (copies/ml) Median HCV RNA (copies/ml)
1000000
100000 2 10000
1000
100
Weeks
IFN-α单次给药后HCV-1病毒滴度变 α单次给药后 病毒滴度变 化的定量监测
复星 复星、华美、复华、
浩源、锦宏 • 荧光PCR技术
复星、达安、匹基
Hale Waihona Puke Baidu
反相膜杂交技术原理
• 首先将特异性探针交联在固相载体膜上，这 时载体膜以及膜上的探针相当于固定相，当 膜条的一端与带有杂交反应物的液面接触时， 带有生物素标记的基因片段、标记酶、酶底 物依次通过这个固定点时，其表现的效应行 为类似于过滤或者是亲和层析，这时探针有 机会与流动相中的靶序列充分作用特异性结 合（杂交），再经过酶显色最终显示出蓝紫 色斑点。
荧光定量PCR核酸检测技术
国内PCR市场存在的问题
• 主要表现为PCR产物分析手段落后：
琼脂糖凝胶电泳法只能判断产物片段大小，并不能鉴别 产物特异性。造成传统PCR检测缺点非特异性难以判断、假 阳性多和重复性差等。
• 实验室管理制度落后； • 人员培训水平落后；
国内发展的核酸检测新技术
• 反相膜杂交技术 • 微孔板杂交技术
荧光PCR技术原理示意图
• 主要优点： 1.能对靶基因进 行定量检测； 2.在封闭状态下 进行产物检测， 减少了污染机 会。 • 主要缺点： 1.仪器设备昂贵， 不利于推广； 2.分型困难。
核酸检测实验室的设置
• 为了防止由标本（微生物或非微生物）和靶核酸模板 以及经PCR扩增的靶核酸片段所引起的交叉污染，核 酸检测实验室中应设置三个专用的实验室。 • 前PCR区1（试剂配制实验室） PCR区 用途：该实验室是无临床标本和无核酸污染区，用于 用途 配制各类试剂及设置PCR扩增反应管无（靶核酸模板）。 基本设备：1.实验应有紫外灯； 2. PCR防污染罩； 基本设备 3. 冰箱（4℃，-20℃）；4. 台式小型高速离心机、 旋涡振荡器、各种规格移液器（0-10ul、40-200ul、 50-1000ul）等；5. 高压灭菌的各种Eppendorf管和移 液器吸嘴；6. 专用文具用品；7. 实验桌椅（实验台 台面防酸、防碱和耐热）；8. 自来水设备
丙型肝炎病毒的核酸检测
• 丙肝：输血后肝炎主要原因 急性期2－26周（平均7.4周） 潜伏期1－2个月 • 酶免检出率： 1月 17.4％ 2－6月 60－80％ 1年 80％ • 病毒特点：滴度低；免疫反应弱；变异快
HCV 病毒载量 监测实验在常 规病人护理中 扮演的角色
• • • •
开始治疗 改变治疗方案 选择治疗方案 确证疗效
部分讨论：
• 15例病人中eAg均为阳性，但HBV-DNA值的差异甚大，从 1.768Meq/ml 到4800 Meq/ml，该值更确切的反映了机体的感染状态， 其高低可能与感染的严重程度及病毒复制的活跃情况呈正相关；与 机体免疫清除的时间和强度呈负相关。高值示感染严重或清除无力； 反之表示感染较轻或清除强力。 • 实验表明HBV-DNA低值者疗效较佳； HBV-DNA • 无论HBV-DNA值是高是低，治疗后HBV-DNA均见一定程度下降， 其下降的幅度与病例的选择； • eAg的阴转率6个月时为8/15，和国内外诸多报告大致相似，此变化 和HBV-DNA值的低下基本吻合，但HBV-DNA值在6个月时已有9例 小于0.7 Meq/ml，且见HBV-DNA的变化大多早于eAg的阴转，一般 提早2个月，个别提前4个月，可见HBV-DNA值的检测远较观察eAg 更敏感、更确切的反映了干扰能抗病毒的作用。
• ALT的变化通常也是评估干扰能治疗的重要指标，本组病例6个月 时ALT下降至正常者为11/15（73.3%），无明显变化或升高者为 4/15，此变化和HBeAg的阴转大致吻合，但和HBV-DNA 低下并 非完全一致。2号病例持续用药至8个月时ALT明显升高，继续减 量用药后，HBV-DNA低下，有力的说明了ALT升高是机体清除 病毒的正常表现，故以ALT复常为评估指标应有辨证的观点。
否 目前主要应用 于科研
试剂盒的检测灵敏度
以 ROCHE 试剂定过量的血清标本一份，做 10 倍系列稀释，用本试剂盒重复检测两 次。结果见下表。 表.灵敏度检测结果
稀释度 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 ROCHE 结果（copies/ml） 3.38×107 第一次 7.9×106 7.1×105 1.4×105 1.5×103 第二次 1.2×107 8.8×105 1.1×105 2.5×103 均值 9.95×106 7.95×105 1.25×105 2.0×103
后PCR区（扩增和分析实验室） PCR区 用途:该实验室用进行PCR扩增和PCR扩增产物的各类分 用途 析操作。 基本设备：1.实验室应设有紫外灯；2.各类PCR扩增仪； 基本设备 3.电泳仪、电泳槽、紫外分析仪；4.照相设备或凝胶分析 系统；5. 台式小型高速离心机、孵育箱（水浴或恒温）； 6. 冰箱（4℃、-20℃）；7. 微波炉；8. 配套移液 器（若干）；9. 高压灭菌的各种Eppendorf管和移液器吸 嘴。 10. 电脑和专用文具用品、救护药箱；11. 实验桌椅 （实验台台面防酸、防碱和耐热）；12. 自来水设备; 13.其他仪器：根据检测方法不同而定。
上海第二医科大学附属瑞金医院传染科（200025） 罗振辉 厉惠莉 高健 张东华
• 摘要：本文采用探针杂交定量检测HBV-DNA，动态检 测了15例慢性乙肝患者干扰能治疗前、后和治疗过程 中的HBV-DNA的变化，除见干扰能抑制病毒复制的作 用外，且HBV-DNA的变化较eAg阴转和ALT下降更敏 感、更确切的反映了干扰能的疗效。 • 干扰能疗效的个体差异甚大，似和机体感染的严重程 度及自身的清除能力有关，HBV-DNA的动态检测，结 合eAg和ALT的变化，可有助于决定适当的剂量和合理 的疗程。
反相膜杂交原理示意图
• 主要优点：1.操作简便；2.无特殊设备要求； 3.适合于分型；4.结果可原始保存。 • 主要缺点：只能进行半定量操作
微孔板杂交技术原理
• 具体来讲，用生物素（Biotin）标记的PCR 扩增产物，与固定在酶标板上的链霉亲合素 （Streptavidin，SA）结合，再与抗原标记 的特异性HBV探针进行正向法杂交。产物 通过探针连接的抗体酶识别基团和标记碱性 磷酸酶的抗体特异结合后，酶催化底物，在 酶标板中显出颜色，通过酶标仪读取光吸收 值。
– 血清病毒学标志：HBeAg，抗HBe，HBV DNA，
• 治疗目标和疗效判断：
– 病毒学标志改善：HBV-DNA阴转（斑点杂交或定量法降低 病毒学标志改善： 阴转（ >2log10）;
• 停药标准：
– 达显效病人，继续用药3-6个月，仍为显效者，可停药； – 停药后，继续随访观察6-12个月，每3-6个月复查HBV DNA。