流式细胞术课件
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流式细胞术.ppt
信号检测与分析
当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射 时，产生代表细胞内不同物质、不同波长 的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向 空间360度立体角发射，产生散射光和荧光 信号。 以激发图
散射光信号
散射光信号不依赖任何样品的制备技术 （如染色），因此称为细胞的物理参数。
①T淋巴细胞及亚群： 外周血中成熟淋巴细胞主要属于
TCRαβ＋T细胞，可分为Th、Ts、Treg， TCRγδT细胞和NK1.1＋T细胞等，他们 都有一个共同的标志CD3。
a、辅助/诱导性T淋巴细胞（Th）占27-51%， 是主要的功能亚群，主要表达CD3＋CD4＋CD8 －。
b、抑制/细胞毒性T淋巴细胞（Ts）占15-44%， 是 主 要 的 效 应 性 T 细 胞 亚 群 ， 主 要 表 达 CD3＋ CD4 －CD8＋。
因此通过流式细胞仪计数和多参数分析淋巴细胞亚群对了解 淋巴细胞发育、分化、活化和功能成熟，鉴别新的淋巴细胞 亚群具有重要价值；更重要的是通过研究和分析疾病与特异 性淋巴细胞亚群或某些疾病，如免疫性疾病、感染性疾病、 肿瘤等的诊断、治疗、免疫功能重建和器官移植检测有着重 要临床意义。
（1）淋巴细胞及其亚群分析
（三）质料采集和分析过程中 的质量控制
1、标本采集处理
a、组织标本采集： b、标本固定：70%的乙醇固定效果好。 C、单细胞悬液的制备：细胞浓度调整为1×106/ml。 d、石蜡包埋组织的单细胞制备：一般不用。
2、资料采集：一般每个标本应获取1×104。 2×104个有核细胞的荧光和散光系数，白血病 微小残余病变检测应收集5×104个细胞。 3、资料分析；略
缺点；细胞散射光特征丢失较肝素标本快。
（一） FCM单细胞标本的制备
《流式细胞术的原理》PPT课件
光学系统
电子系统
流式细胞仪的工作原理
散射光信号
前向角散射光〔FSC，Forward Scatter〕： 细胞相对大小及其外表积 侧向角散射光〔SSC，Side Scatter〕： 细胞颗粒度及细胞核相对复杂性
散射光信号
荧光信号
特异荧光信号
背景信号
荧光素
•什么是荧光及荧光素？ •某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射 光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧光的物质称 为荧光素。 •什么是荧光发生机理？ •室温下的荧光素分子大局部处于稳定的“基态〞。当荧光素在 激发光的照射下吸收足够的光能后，跃迁到新的状态，即“激发 态〞。处于激发态的荧光分子极不稳定，它可以通过极短时间
•液流驱动系统
Fluorescence signals
Focused laser beam
鞘液三大作用： 防止堵塞喷孔 约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度 保持细胞活性
液流系统
对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而 提高采样分析速度。
光学系统
主要由激发光源、光束成形及收集系统组成
荧光染料的选择
1，首先，了解目标抗原 1〕细胞外表抗原 2〕细胞内或是核内抗原〔固定、透膜步骤〕 3〕以上两者兼备。先标记外表抗原，固定后，破膜标记 胞内抗原。 4〕细胞内细胞因子的测定。使用细胞内蛋白分泌抑制剂， 如monensin、BFA，使得细胞因子不能分泌到细胞外。 〔活化、固定、透膜〕
《流式细胞术的原理》 PPT课件
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流式细胞术课件
b.荧光抗体标记：使用同厂家、同批次抗体，足量、足程标记， 抗体过少或过量均会出现问题.
11
FCM使用注意事项
c.减少非特异染色：充分洗掉未结合抗体，使用间 标抗体注意非特异背景干扰（如Fc受体）.
d.每批、每步实验条件要一致：如PBS、PH值、温度 等 .
e.未固定样本在2h内，固定样本24小时内测定完毕： 避免荧光强度衰减
完成仪器设置、数据获取、统（实习1）
1.开机
2.运行FACSComp：监测仪器工作状态并记录数据
3.建立获取模板
4.调出FACSComp生成的仪器条件 5.条件优化：用阴性和单阳性样本确定电压、补偿和域值，确 定获取的目的细胞数＞10000 6.确定存储数据的地址
7.记录数据
8.分析数据：建立分析模板-调出已存储的原始数据-调整 Gate(门)或 Region(区域)-设置Marker(标尺)-显示象限统计框 （Quadrant Stats） -打印分析数据
对计数 绝对值
2）ProCOUNT：造血干/祖细胞自动化分析，报告CD34+细胞 3）HLA-B27分析软件：血液T淋巴细胞HLA-B27定量分析 4）ReticCOUNT：网织红细胞自动化分析
6
BD仪器软件
5）ModFit软件：DNA周期、倍体和凋亡的自动或手动分析 6）QuantiCALC：荧光定量分析，报告每个细胞抗体结合量 （ABC），要检测白细胞表面分化抗原和细胞活化指标 7）PAINT-A-GATE：多维参数资料分析，同时分辨显示多个 细胞群体 8）ATTRACTOR软件：多参数资料的自动快速批量分析
22
23
•DNA分析时，FSC、SSC和FL2都应使用线性模式采集信号。
•调节FL2的电压，使FL2-A的G1期细胞的峰位于200道数 的位置上。
流式细胞术简介课件
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12
流式细胞仪可检测到的细胞参数 • 荧光信号
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13
R1
File: 4
Acquisiti on Date: 06-Mar-03
Quad UL UR LL LR
Events % Gated
254
2.40
1067 10.08
5291 49.98
3975 37.55
X Mean 37.47
密度图
二维等高图ຫໍສະໝຸດ 直方图图 报告中常见的几种流式细胞图
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24
仪器设置调节
1. 用未染色细胞 2. 调整仪器PMT电压
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开机需准备试剂
• 建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列 样品
（1）Negative Control（不加任何抗体）。 （2）CD3-FITC（FL1 单染） （3）CD19-PE（FL2 单染） （4）CD3-FITC /CD19-PE（FL1/FL2 双染）。
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数据分析
• 设门 • 设定阴性与阳性群体的界限 • 确定阳性与阴性细胞群体 • 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平
均荧光值，绝对数或抗体结合数
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2. 用单染色的细胞调节仪器补偿
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流式细胞术和应用PPT培训课件
异荧光 细胞生长好、避免反复吹打
彻底消化
增加抗体量、延长反应时间
五、数据分析处理
WinMDI软件等。 单参数直方图 双参数二维点图 等高图 三维图
设门：
散点图
限定要分析的目的细胞群，FSC vs SSC点图是传统上用 于设门的图；
补偿模型图
补偿调节前后对比
二、荧光染料的选择
1.细胞表型分析 双色分析：FITC与PE 三色分析：双色分析+PE-CY5或 PerCP-CY5.5。 四色分析：三色分析+APC或PE-CY5。
2.胞内蛋白与周期的关系分析 蛋白标记：FITC或GFP，DNA标记：PI
3.凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC，坏死用PI。
流式细 胞术和 应用
内容
一、流式细胞术工作原理 二、荧光染料选择 三、抗体选择 四、样品制备及对照设置 五、数据分析处理 六、流式细胞术的应用
一、流式细胞术工作原理
（一）流式细胞术的概念
流式细胞术（FCM，Flow Cytomytry）指利用流式 细胞仪(Flow Cytomyter)对处于快速流动的荧光染色的 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选 （纯度可达99%以上）的技术。凡是能被荧光素标记的 且这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发的 细胞或颗粒，都可用流式细胞仪检测。
PE-Cy5与APC干扰。
二、荧光染料的选择
488nm激光激发的染料： FITC：异硫氰酸荧光素，绿色，513nm PE：藻红素，橙黄色 575nm，信号最强 PerCP ：多甲藻黄素-叶绿素蛋白，深红色，675nm PE-Cy5 (PC5) ：670nm PE-Cy5.5 (PC5.5)：667nm PE-Cy7 (PC7) ：767nm PI (碘化丙啶）：617nm
彻底消化
增加抗体量、延长反应时间
五、数据分析处理
WinMDI软件等。 单参数直方图 双参数二维点图 等高图 三维图
设门：
散点图
限定要分析的目的细胞群，FSC vs SSC点图是传统上用 于设门的图；
补偿模型图
补偿调节前后对比
二、荧光染料的选择
1.细胞表型分析 双色分析：FITC与PE 三色分析：双色分析+PE-CY5或 PerCP-CY5.5。 四色分析：三色分析+APC或PE-CY5。
2.胞内蛋白与周期的关系分析 蛋白标记：FITC或GFP，DNA标记：PI
3.凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC，坏死用PI。
流式细 胞术和 应用
内容
一、流式细胞术工作原理 二、荧光染料选择 三、抗体选择 四、样品制备及对照设置 五、数据分析处理 六、流式细胞术的应用
一、流式细胞术工作原理
（一）流式细胞术的概念
流式细胞术（FCM，Flow Cytomytry）指利用流式 细胞仪(Flow Cytomyter)对处于快速流动的荧光染色的 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选 （纯度可达99%以上）的技术。凡是能被荧光素标记的 且这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发的 细胞或颗粒，都可用流式细胞仪检测。
PE-Cy5与APC干扰。
二、荧光染料的选择
488nm激光激发的染料： FITC：异硫氰酸荧光素，绿色，513nm PE：藻红素，橙黄色 575nm，信号最强 PerCP ：多甲藻黄素-叶绿素蛋白，深红色，675nm PE-Cy5 (PC5) ：670nm PE-Cy5.5 (PC5.5)：667nm PE-Cy7 (PC7) ：767nm PI (碘化丙啶）：617nm
流式细胞术(免疫学检验课件)
Region设置 Gate设置
第四节 FCM的临床应用
一、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群， 是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞， 主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。
不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性， 在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的CD抗原进 行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫 相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。
最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法 和表面活性剂处理法等。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围， 有利于进行临床回顾性研究和利用。
常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和 甲氧-双氧水处理法。
石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底， 获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过 长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可 获得单细胞悬液。
三、三参数直方图
三维坐标均为参数 （散射光或荧光）而 非细胞数
对复杂的细胞亚群观 察更为直观、准确， 但对其数据的统计分 析较难
四、多参数组合分析
FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术 能够无法显示四维空间结构。
随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧 光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以 获得所需的信息。
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
前向散射光示意图 细胞大小
结构复杂程度
侧向散射光示意图
血
液
白
细
胞
粒细胞
散
点
单核细胞
图
淋巴细胞
荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料 受激光激发后产生。
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
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四路分选原理
电荷式分选装置
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分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
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B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞术精品PPT课件
4
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
流式细胞术原理及应用 ppt课件
• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
19
常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
21
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
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常用荧光素
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常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
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• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
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粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
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细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
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三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
流式细胞术的基本原理及其应用ppt课件
4
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
13
流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
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流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞术课件
抗体使用原则
Ø 根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光 抗体
Ø 低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素， 如PE、APC
Ø 使用双标以上抗体必做荧光补偿
几种常见的荧光染料
细 胞 悬 液
激光
FITC 异硫氰酸荧光素
Texas red 得州红
PE.PC.APC 藻胆蛋白类 PEcy5 能量传递复合染料
原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。 （n----2n）
以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。 首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞 （G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的 细胞又有 G1 期，S 期,G2 期和 M 期。
Flow cytometry of cell cycle
线粒体功能的变化
TMP会在凋亡中产生，可以通过一些标记用流 式细胞仪检测。使用有膜穿透性的亲脂性阳离 子荧光染料，如Rh123, DiOC6, JC-1,CMXRos 等，可作为流式检测的探针。
当细胞发生凋亡时，一个线粒体膜表面蛋白— —7A6抗原会出现
Bcl-2/bax family of proteins.
酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如 DCH, BCECF, BCECF-AM, SNAFLs, SNARFs等进行检测
Flow cytometry of apoptotic cell death
Phospholipid redistribution
第七节 细胞周期的检测
Flow cytometry of cell cycle
光 强
Ø便于数据统计
度
Ø不同的细胞群可
以用不同的色标
记
Ø主要表达方式
绿色荧光强度
流式细胞术ppt课件
可区分高FL细胞与低FL细胞。 一般的流式细胞仪装有一个激光光源（488nm），可
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
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90LS Sensor
散射光
散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上 的差异 - 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数 据
散点图——Dot Plot
lysed whole blood
测得的FS与SS信号通 过计算机处理，可得到 FS-SS图，由此可仅用 散射光信号对未染色的 活细胞进行分析或分选。
光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
（1）激光光源
➢ 单波长、高强度、高稳定性
➢ 多采用氩离子激光器或氦氖激光器
➢ 一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和 355nm、407nmUV激光
➢ 最多检测13个荧光参数
Optical Filters
- 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
细胞功能
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 细胞活性 胞内细胞因子 激素结合位点 酶活性
基础研究
淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干 细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相 关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究 （MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、 DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产 物测定、血管内皮细胞研究
假三维等高图
三参数直方图
（四）流式细胞仪的多参数分析
多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激 发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可 根据需要进行组合分析。
数据分析
设门 设定阴性与阳性群体的界限 确定阳性与阴性细胞群体 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光
值，绝对数或抗体结合数
三、设门分析技术
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
LP 500
SP 500
BP500/50
光收集系统：光电倍增管 （PMT）
流式细胞仪的光信号
散射光信号 荧光信号
(2) 散射光信号
前向角散射光（FSC,Forward Scatter） 入射激光的同向散射光信号细胞相对大小及其表面积。
流式细胞术
徐琦 副教授
新疆医科大学 基础医学院免疫学教研室
第一节 流式细胞术概述
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种 可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒 （通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特 定群体加以分选
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
第四节 流式细胞样品制备
标本来源：
外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他 实验的不同，选用不同的抗凝剂。
可选的抗凝剂有： EDTA： 2mg/ml 枸椽酸钠：0.38% 肝素：15IU/ml
标本处理的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。 注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。
partec流式细胞仪提供软件调节补偿技术，无论何时都 可重新调节
多色荧光补偿调节方法同双色法
3. 电子系统 主要由计算机及其软件组成
4. 细胞分选系统
Fluorescence Activated Cell Sorting
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
Gate设置：指在某一张选定参数的直方 图上，根据该图的细胞群分布选定其中 想要分析的特定细胞群，并要求该样本 所有其他参数组合的直方图只体现这群 细胞的分布情况。
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆 形门、多边形门、任意形状门和十字门。
A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞
A、B、C均 为任意门
侧向角散射（SSC, Side Scatter） 入射激光90角的散射光信号细胞粒度及细胞内相对 复杂性。
前向角散射光 ——FSC
Forward Angle Light Scatter
Laser
FALS Sensor
侧向角散射光——SSC
Side Scatter
Laser
FALS Sensor
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
流式细胞仪
流式细胞仪 是测量染色细胞标记物荧光强度的 细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上 发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、 内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进 行快速测量并可分类收集的高技术。
BD LSR
通过流式细胞仪我们可以得到以下信息
线性门
Region设置:
区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相 关的概念，区阈可与门对应，但是也可以 包含于门。
如十字门分析时，起 就可以由四个区域构 成，即 G=D1+D2+D3+D4。
D1 CD4+/CD3D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3D4 CD4- /CD3+
方法二：密度离心法提取单个核细胞
Histopaque 1077为Ficoll与Sodium diatrizoate(泛影酸钠) 混合物，其密度为1.119～1.077。通过离心可将全血中的粒 细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于1.119～1.077的血浆 层，而单个核细胞则在1.077以下的血浆层中。
（二）双参数直方图
双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的 两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在 图上的表达位置。
双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图， 在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度 反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。
双参数直方图点图
红
色
荧
光 强
➢便于数据统计
细胞分选系统
1. 液流系统
由样本和鞘液组成
待测细胞 单个细胞的悬液 抗对其染色 受清洁气体压力 动室形成样本流
荧光染料标记的单 从样品管进入流
鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包 裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置， 防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
液流系统
液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处
基本工作原理
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
流式细胞仪与显微镜的区别
区别 光源 对象 承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果
样本处理标准试剂：
一、10%Bovine Serum Albumin BSA
1. 溶解10g BSA至100ml蒸馏水中 2. 4ºC，20000 g离心30分钟 3. 分装后-20ºC保存
二、0.1% BSA-PBS缓冲液
1. 准备500ml，PH7.3 PBS 2. 加入5ml 10% BSA 3. 使用0.45um滤网过滤
临床研究
淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分 析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、 PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因 子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flowFISH法测定端粒长度
第二节 流式细胞仪工作原理
一、工作原理
➢采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 效率； ➢利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检 测的灵敏度和特异性； ➢用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数 信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确 性。
三、氯化铵溶血剂
1. 在一升蒸馏水中溶解8.29g NH4CL,1g KHCO3和37mg Na2EDTA 2. 调节PH值至7.2 3. 在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤
收集白细胞
方法一：溶血法
1. 取100 ul抗凝全血； 2. 快速加入 2ml NH4CL溶血剂,混匀； 3. 室温孵育5分钟； 4. 4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS； 5. 4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS； 6. 4ºC，400g离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。
选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个 不同特征。
线性放大器和对数放大器
荧光信号
荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为
振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子
荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强
双色荧光散点图
荧光检测器
FALS Sensor
（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强 度的颗粒数量的多少。
单参数直方图
X轴：代表荧光信
号或散射光信号的
强度，用“通道数”
量细 胞
表示，可以与光强
相
度之间线性关系或
对 数
对数关系
Y轴：代表该通道
内所出现具有相同
光信号特征性细胞
的频率
信道 (channel )
荧光补偿方法
➢所有补偿调为 “0”