微生物检验实验

三、实验原理
按食品安全国家标准的规定，食品中菌落总数 （aerobic plate count）是指食品检样经过处理，在一 定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后， 所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。
国家标准菌落总数的测定采用标准平板培养计数法， 根据检样的污染程度，做不同倍数稀释，选择其中的2—3 个适宜的稀释度，与培养基混合，在一定培养条件下，每 个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见 的菌落。由此根据平板上生长的菌落数计算出计数稀释度 （稀释倍数）和样品中的细菌含量。
二、试验材料与设备
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料 如下：
恒温培养箱、 冰箱、 恒温水浴箱、天平、均质器、振 荡器、无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶：容量500 mL、无菌培养皿、 pH计或pH比色管或精密pH试纸、菌落 计数器、培养基和试剂 ：月桂基硫酸盐胰蛋白胨、 煌绿 乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤、 结 晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA、）磷 酸盐缓冲液、无菌生理盐水、 无菌1 mol/L NaOH、无菌1 mol/L HCl
二、实验材料和设备
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设 备和材料如下： 恒温培养箱、冰箱、 恒温水浴箱、 天平、均质器、 振荡器、无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头、无菌 锥形瓶：容量100 mL、500 mL、无菌培养皿、注 射器：0.5 mL、 pH计或pH比色管或精密pH试纸、 培养基和试剂：氯化钠胰酪胨大豆肉汤、氯化钠 肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker琼脂平板、脑心 浸出液肉汤(BHI) 、兔血浆、磷酸盐缓冲液、 营 养琼脂小斜面、革兰氏染色液、无菌生理盐水
食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵和证实试验相差较大。因此，在实际
检测工作中，证实试验时必需的。而复发酵时培养基中的煌绿和胆盐能抑制产芽 孢细菌。从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似 的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相 应降低或增加10倍。该法适用于目前食品卫生标准中大肠菌群限量用 MPN/100g(mL)表示的情况。
（5）若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计 算。
（6）若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU之间，其中一部分小于30 CFU或大于 300 CFU时，则以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
菌落总数的计算方法
（4）若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
（5）称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。
实验二、食品中金黄色葡萄球菌检验
Food microbiological examination:Staphylococcus aureus
一、实验目的 1、了解食品中金黄色葡萄球菌检验的安全 学意义 2、掌握食品中金黄色葡萄球菌定性和定量 检验的原理和方法。 3、学会测定面包中的金黄色葡萄球菌
三、实验原理
国家保准金黄色葡萄球菌检验的原理如下：金黄色葡萄 球菌耐盐性强，在100—150g/L的氯化钠培养基中能生长， 适宜生长的盐含量为5%—7.5%，可以利用这特性对金黄色 葡萄球菌增菌，抑制杂菌。金黄色葡萄球菌可以生产溶血素， 在血平板上生长，菌落周围有透明的溶血环，可产生卵磷脂 酶，分解卵磷脂，产生甘油脂和可溶性磷酸胆碱，所以在 B—P平板上生长，菌落为黑色，周围有一混浊带，在其外 层有一透明圈，利用此特性可分离金黄色葡萄球菌。金黄色 葡萄球菌还可以产生凝固酶，凝固酶可使血浆中的血浆蛋白 酶原变成血浆蛋白酶，使血浆凝固，这是鉴定致病性金黄色 葡萄球菌的重要的指标，是不是致病的金黄色葡萄球菌主要 看它是否产生凝固酶。
三、实验原理
国家标准中食品大肠菌群的检测有两种方法： MPN 计数法和平板计数法。
MPN 计数法是基于泊松分布的一种间接计数方法。样品经过处理与稀释后用 月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（LST）进行初发酵，是为了证实样品或其稀释液中是 否存在符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”，而在培养基中加 入的月桂基硫酸盐能抑制革兰氏阳性菌（但有些芽孢菌、肠球菌能生长），有利 于大肠菌群的生长和挑选。初发酵后观察LST肉汤管是否产气。初发酵产气管， 不能肯定就是大肠菌群，经过复发酵试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，
计数原则
（1） 选取菌落数在30 CFU～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采 用两个平板的平均数。 （2） 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为 该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可 计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 （3） 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 （3）若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平 板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 （4） 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍 数计算。
温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
2、初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液
（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管
月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种
1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤）， 36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气 泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未 产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵
3、鉴定
（1） 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列
呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5 μm～1 μm。
（2）血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可 疑菌落1个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面， 36 ±1 ℃培养18 h～24 h。 取新鲜配置兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2 mL～0.3 mL，振荡摇匀，置36 ±1 ℃温箱或水 浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将 试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的 一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和 阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。结果如可疑， 挑取营养琼脂小斜面的菌落到5 mL BHI，36 ±1 ℃培养18 h～48 h，重复试验。
菌落总数的报告
（1）菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约， 以整数报告。
（2）菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四 舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位 数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原 则修约后，采用两位有效数字。
（3）若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落 蔓延。
四、实验步骤
（一）金黄色葡萄球菌定性检验程序
（二）操作步骤
1、样品的处理
称取25 g样品至放入盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大 豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。
2、增菌和分离培养
（1） 将上述样品匀液于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。金黄色葡萄球菌在 7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉 汤内呈混浊生长。 （2） 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板 36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。Baird-Parker平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h或45 h～48 h。 （3）金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2 mm～3 mm，颜 色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。 用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的 类似菌落；但无混浊带及透明圈。在血平板上，形成菌落较大，圆形、 光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血 圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。
四、操作步骤
（一）检验程序
（二）操作步骤
1、样品的稀释
（1） 固体和半固体样品：称取25 g样品,放入盛有225 mL磷酸 盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min～10000
r/min均质1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。并用梯度离
心法稀释成10-2—10-5。吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每 个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL空白稀释液加入 两个无菌平皿内作空白对照。15 mL～20 mL冷却至46 ℃的 平板计数琼脂培养基（可放置于46 ±1 ℃恒温水浴箱中保
（1）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计 算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数， 作为每g（mL）样品中菌落总数结果。 （2）若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时， 按下列公式计算：
பைடு நூலகம்
式中： N——样品中菌落数； ∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度）。
2、培养
待琼脂凝固后，将平板翻转，36±1℃培养 48 h±2 h。水产品30±1℃培养72 h±3 h。
3、菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数 器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落 计数以菌落形成单位（colony-forming units， CFU）表示。
五、 结果与报告
注意事项：
3、学会对不同样品稀释度确定的原则
二、实验设备和材料
恒温培养箱、冰箱、恒温水浴箱、天平、 均质器、 振荡器、无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头、无菌锥 形瓶：容量250 mL、500 mL、无菌培养皿、pH计或 pH比色管或精密pH试纸、放大镜或/和菌落计数器、 培养基和试剂：平板计数琼脂培养基、 磷酸盐缓冲 液、 无菌生理盐水
五、实验步骤
（一） 检验程序
（二）操作步骤
1、样品的稀释
称取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无
菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min制
成1:10的样品匀液。并用梯度离心法稀释成10-2—10-5。吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分 别吸取1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。15 mL～20 mL冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合 均匀。
南通大学生命科学学院
主讲: 常 燕
实验一 食品微生物学检验 菌落总数测定
Food microbiological examination：Aerobic plate count
一、实验目的
1、掌握食品中菌落总数（Aerobic plate count）的测 定的基本程序和要点。 2、掌握菌落的计数原则
五、结果与报告
1、结果判定：可疑微生物可判定为或不为 金黄色葡萄球菌。 2、结果报告：在25 g（mL）样品中检出或 未检出金黄色葡萄球菌。
实验三、食品中大肠菌群计数
Food microbiological examination: Enumeration of coliforms
一、试验目的 1、了解大肠菌群在食品安全检验中的意义 2、学习并掌握食品中大肠菌群的测定方法