样本前期处理及HE染色-赵恒
发育生物学复习资料：实验二石蜡切片的he染色.docx
实验二石蜡切片的HE染色2014年2月8日【实验目的】掌握石蜡切片HE染色的基本技术。
【实验原理】HEfHematoxylin and Eosin］染色也称苏木精-伊红染色，是组织学技术的常规染色方法。
苏木精是一种天然香料，它本身并不能染色，在经氧化后变成苏木红才是真正的染料，苏木对细胞核的亲和力并不强，而在媒染剂的帮助下才能较好显示细胞核，此吋细胞核呈红色, 只有在碱性环境中，苏木才变成蓝色。
氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。
伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。
伊红的细胞浆的良好染料。
【预习要求】1.熟悉HE染色的基本过程和原理。
2.HE染色屮的注意事项和常见问题。
3.通过书籍和网络等解答思考题。
【器材与试剂】1.实验器材：银子、染色缸、盖玻片、显微镜、上次切好的睾丸切片。
2.实验试剂：各种浓度的酒精、二甲苯、苏木精染液、伊红溶液、1 %盐酸溶液、氨水、屮性树胶。
常用染液的配制：（1）.埃利希（EhrliCh）氏苏木素染液配制:苏木素2g,无水酒精100ml,甘油100ml, 冰醋酸10ml,钾明矶2〜3 g,蒸馆水100ml,任自然氧化成熟后使用。
（2）. 0.5%水溶性伊红染液的配制：水溶性伊红0. 5g,蒸徭水100mlo（3）. 1%盐酸分化剂配制：盐酸1ml,水99ml。
用于将苏木素过染的部分去掉，使核着色清晰。
（4）.弱碱性水溶液（促兰剂）配制：0.1〜0.25%的氨水或碳酸锂饱和溶液。
【实验步骤】H・E染色的步骤和方法1.染色步骤：（1）切片脱蜡：二甲苯去蜡5〜10分钟，石蜡切片在温箱中烤干即可进入二甲苯脱蜡,遇室温过低吋则应加温脱蜡，石蜡方能溶去，脱蜡不尽不能染色。
一种HE染色切片的制作方法[发明专利]
![一种HE染色切片的制作方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/3bd9ec95f424ccbff121dd36a32d7375a417c6a4.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910471080.1(22)申请日 2019.05.31(71)申请人 中南大学地址 410083 湖南省长沙市麓山南路932号(72)发明人 王宽松 粟诗童 傅春燕 谢斌 周建华 周训检 禹灿平 马苛文 戚嘉琳 胡祯敏 (74)专利代理机构 长沙朕扬知识产权代理事务所(普通合伙) 43213代理人 钱朝辉(51)Int.Cl.G01N 1/30(2006.01)G01N 1/36(2006.01)(54)发明名称一种HE染色切片的制作方法(57)摘要本发明公开了一种HE染色切片的制作方法，包括以下步骤：将白片烤片、脱蜡、水化、HE染色和封片，所述水化与HE染色之间还包括以下步骤：将水化处理后的白片经过金属离子络合剂溶液处理。
本发明在制作HE染色切片时，水化与HE染色步骤之间增加金属离子络合剂溶液处理，金属离子络合剂能有效减少或消除组织裂缝，使其组织形态更加清晰，并可有效减少细胞固缩、重叠，大大增加了对组织、细胞判读的准确性、可靠性。
权利要求书1页 说明书5页 附图5页CN 110320084 A 2019.10.11C N 110320084A1.一种HE染色切片的制作方法，包括以下步骤：将白片烤片、脱蜡、水化、HE染色和封片，其特征在于，所述水化与HE染色之间还包括以下步骤：将水化处理后的白片经过金属离子络合剂溶液处理。
2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述金属离子络合剂溶液中金属离子络合剂包括EDTA、EDTA盐、柠檬酸或柠檬酸盐中的至少一种，所述金属离子络合剂的浓度为0.0001-0.1mol/L，所述金属离子络合剂溶液的pH值为8.0-9.0。
3.根据权利要求2所述的制作方法，其特征在于，所述金属离子络合剂溶液中金属离子络合剂包括EDTA或EDTA盐。
4.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述金属离子络合剂溶液为经过蒸馏水稀释的EDTA抗原修复液，所述金属离子络合剂溶液的pH值为8.0-9.0。
吉林大学HE染色
包埋
修块
注意事项
实质性器官：最大切面向下。 空腔性器官：管壁切面向下 相同性质的小块组织可以包埋在一个蜡块 中。 难切的组织单独包埋。 操作要迅速，组织不能在空气中停留太久。
石蜡切片
准备工作 切片 通常4~6微米 展片 550C 附贴 蛋白甘油 标记 连续切片标记顺序 烤片 600C 石蜡全部融化
二甲苯I和II：各10分钟左右。 透明时间不宜太长，否则组织收缩硬化。
透明 透明在两种情况下进行。
第一，透明是在组织脱水后浸蜡前进行，其目的不在于 为了显微镜观察，而是作为从脱水剂进入包埋剂的桥 梁。因此，透明剂必须既能与酒精混合，又能与石蜡 融合无间，二甲苯即具此性质，故被选为常用的透明 剂。
脱水时间应视组织块的大小及厚度而定，大致处理如下： 组 织 块 为 3-5毫 米 厚 者 ， 各 级 酒 精 为 3^-6小 时 ， 无 水 酒 精 对 组 织 有脆化作用，浸泡时间还应缩短。实质性器官，如 肾、脾 和淋 巴 结 等 ， 在 酒 情 中 浸 泡 时 间 太 久 易 于 硬 脆 ， 脂 肪 组 织 与 疏 松 结缔 组 织 在 酒 精 中 浸 饱 的 时 间 要 长 ， 特 别 是 在 95 ％ 酒 精 中 ， 以 尽 量溶 去 脂 肪 ， 并 脱 净 残 存 的 水 份 ， 有 利 于 包 埋剂渗入组织内。
第二，透明是在片子脱水与封藏之间进行。其目的除
了作为从脱水剂进入封藏剂的桥梁外，尚有使标本透 明而便于观察的作用。
浸 蜡
透蜡 是指将材料中的透明剂逐步清除， 以至完全由石蜡充分渗透。
浸 蜡
石蜡熔点选择54~580C，浸蜡温度较熔点高 2~30C。 较硬的致密组织，例如骨、软骨、肌腱、皮 肤、子宫肌选用熔点较高的石蜡。 疏松及脆嫩组织，例如脑、脊髓、小动物肝 脾选用熔点较低的石蜡。 石蜡I：10~20分钟。 石蜡II：20~30分钟。 石蜡III：30~40分钟。
[重点]HE染色protocol
![[重点]HE染色protocol](https://img.taocdn.com/s3/m/a6e43b3b2e60ddccda38376baf1ffc4ffe47e29c.png)
常规HE染色石蜡包埋的组织切片必须经过脱蜡水洗处理才能染色，让水溶性染料渗入组织中，含蜡的组织切片无法进行任何染色。
所以，在染色前必须用二甲苯或替换剂进行彻底脱蜡，经过乙醇洗后，再用水洗。
即石蜡组织切片→二甲苯→乙醇（无水乙醇，95%，80%）→水。
人们通常把这个过程叫做切片脱蜡至水。
脱蜡至水是染色前的必须完成的基本步骤。
一般脱蜡至水的时间和步骤如下：HE染色脱蜡至水步骤步骤顺序试剂时间1 二甲苯Ⅰ脱蜡 5 min2 二甲苯Ⅱ脱蜡 5 min3 二甲苯Ⅲ脱蜡 5 min4 无水乙醇浸洗 1 min5 95%乙醇Ⅰ浸洗 1 min6 95%乙醇Ⅱ浸洗 1 min7 80%乙醇浸洗 1 min8 自来水冲洗3-5 min冰冻切片和细胞涂片样品的染色不需要经过脱蜡至水步骤，水洗后直接用苏木精和伊红染色。
染色是利用染料的不同作用，使组织与染料以不同方式进行结合。
常规染色是苏木精和伊红染色（H.E）。
特殊染色（special stains）和组织化学（免役组织化学）染色是根据诊断的需要对组织中的某些成分进行非常规的染色。
HE染色用的苏木精是一种树木苏木的一种氧化产品，因为这种树非常罕见，多数氧化苏木精是合成品。
苏木精必须氧化成熟后才能使用。
苏木精染液需要预先配制，放置几个月自然氧化成熟。
或购买成熟过的商品苏木精，也可在苏木精液中加一些成熟剂。
苏木精本身对组织没有染色作用，需要“媒染剂”与组织连接，媒染剂是铁，铝，钨等由这类正离子金属提供。
矾也是苏木精常用的媒染剂，如Harris苏木精的配制以硫酸铝钾（钾明矾）或铵明矾作为媒染剂。
不同媒染剂配制的苏木精染色强度不同。
苏木精作为一种基础染料对细胞核的核酸具有一定的亲和力。
苏木精不是“退行性”就是“进行性”染色，退行性染色是把切片在染液内留一段时间，然后从染液里出来用盐酸乙醇分化，去除过染的一部分。
这种方法最适合大批量的染色。
进行性染色切片在染液中染到自己想要得染色强度。
He染色切片制作（各动物、全过程、操作要点、注意事项）
He染色切片制作（各动物、全过程、操作要点、注意事项）石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2、将器皿在自来水下冲洗干净3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。
（二）配制：硫酸洗液的配制清洁液（洗液）的配制：成分强酸液次强酸液弱酸液浓硫酸（ml） 1000 200 100重铬酸钾（mg） 63 120 100蒸馏水（ml） 200 200 1000重铬酸钾1200g蒸馏水 2000ml将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌（三）载玻片与盖玻片的处理1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍3. 95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。
二、常用液体的配制（一）缓冲溶液：1．磷酸盐缓冲液A液：0.1mol/L磷酸二氢钠B液：0.1mol/L磷酸氢二钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）2．枸椽酸缓冲溶液A液：0.1mol/L枸椽酸B液：0.1mol/L枸椽酸钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）（二）固定剂：1．甲醛：10%甲醛福尔马林 100ml蒸馏水 900ml注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。
2．10％中性福尔马林钙固定液甲醛液 10ml蒸馏水 90ml加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。
3．4%多聚甲醛：8%多聚甲醛多聚甲醛8g蒸馏水 100ml加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。
样本前期处理及HE染色-赵恒教材
固定
固定液的性质和条件 1、能迅速渗入组织，使组织细胞形态在短期内不至于有 较大变化 2、固定液有相当的渗透力，对组织各部分的渗透力相等 ，可使组织内外完全固定
3、使组织细胞不至于因固定而引起人为的改变
4、尽可能避免固定剂使组织膨胀或收缩
5、使组织达到一定硬度，获得较佳的折光率和对染料具 有较强的亲合力。
2、甲苯的一般性质与二甲苯相似。用法亦同，唯沸点较低， 透明较慢，但不会使组织变脆 3、苯的用法同于二甲苯，对组织的收缩作用小，但须警惕其 爆炸和吸入而引起中毒。 4、氯仿适于大块组织的透明
注意事项
1、透明时间应由组织大小而定，—般各级停留时间在5min 至15min，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过 1h为宜
2、材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱 水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状 说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好 3、使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分 并保持其无水状态
浸蜡包埋
1、组织经过脱水透明处理后浸蜡4h，然后进行包埋 2、浸蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石 蜡熔点3度
固定剂种类
单纯固定剂 ：10%甲醛、 4%多聚甲醛 、饱和的苦味酸溶
液 、冰醋酸 、锇酸 混合固定剂 ：Bouin氏固定液 、Zenker液（PH2.3）、 Carnoy液 、改良Bouin氏固定液
固定的目的 1、防止组织溶解及腐败，以保持组织和细胞与正常生活 时的形态相似
2、使细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变为不 溶性物质，以保持它原有的结构与生活时的相仿
封片：
原因：切片经梯度乙醇处理后没
有完全脱水， 导致二甲苯透明中 性树胶封固后残留大量水分。也可 能是封片的时候出现的气泡。
阿尔新蓝染液(固核红)(pH2.5)使用说明书
5) 脱水、透明后，用树脂封片剂封片。
结果
粘蛋白类染为亮蓝；核染为红色。
注意事项
1. 需自备 4%多聚甲醛、梯度乙醇、二甲苯，中性树胶或其它封片剂。
2. 进一步鉴定酸性粘蛋白，需要使用其他 pH 值的染液。
3．第一次使用本试剂盒时建议先取 1~2 个样品做预实验。
温馨提示
为了您的自身安全，使用试剂前，请做好防护，如穿实验服，戴手套等。
3)对于培养细胞
用 4%多聚甲醛固定 10 min 以上；PBS 洗涤 2×2 min。
2. 阿尔新蓝染液
对于上述处理好的样品
1) 将切片置于阿尔新蓝染液(pH2.5)中 30min；
2) 流动的自来水冲洗 2min，蒸馏水漂洗；
3) 用核固红染液复染 5min；
4) 流动的自来水冲洗 1min，蒸馏水漂洗；
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阿尔新蓝染液（固核红）(pH2.5)
阿尔新蓝染液（Alcian Blue staining solution）
阿尔新蓝染液可对酸性粘液和乙酸粘蛋白进行染色。在正常血管壁上产生一定数量的非
硫酸化酸性粘液，但在间皮瘤中出现过量的非硫酸化酸性粘液，在动脉粥样硬化损伤早期会
增加。强酸性粘液物质将被染成蓝色，核染成粉红色到红色。阿尔新蓝染液的 pH 值为 2.5，
可对结肠切片进行染色。
使用说明
1.样品处理
1)对于石蜡切片
二甲苯中脱蜡 2×3~5min。无水乙醇 5 min、90%乙醇 2 min、70%乙醇 2 min、PBS 漂洗 2 min。
2)对于冰冻切片
PBHale Waihona Puke 漂洗 2 min。储存温度
免疫组化 HE染色 FISH ISH
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 免疫组化HE染色FISH ISH现阶段开展的病理实验主要内容：免疫组化 HE染色几种特殊的染色原位杂交荧光原位杂交1/ 32免疫组化1、免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
2、我们现阶段主要要做的组织免疫组化有石蜡切片、冰冻切片免疫组化以及荧光免疫组化。
细胞免疫组化有细胞爬片、细胞印片和细胞涂片免疫组化和荧光免疫组化。
3、免疫组化过程中抗原修复有高压修复法、酶修复、微波修复，其中微波修复抗原对提高免疫组化阳性检出率非常有效。
4、高压修复和微波修复法中常用的缓冲液有0.01M柠檬酸缓冲液、1mM 的EDTA（pH8.0）。
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 6、酶标抗体系统中的酶与显色剂、复染液的合理选用：（1）辣根过氧化物酶系统（HRP）显色剂一般用DAB、AEC,DAB显色液一般染色部位为棕黄色，AEC显色液一般染色部位为红色；而HRP系统常用的复染液为苏木素，将细胞核染成蓝色。
（2）碱性磷酸酶系统（AP）显色剂一般用BCIP/NBT、固红、固蓝。
最常用的是BCIP/NBT显色液，染色部位为深蓝色或者蓝紫色；该系统常用的复染液为核固红，将细胞核染成红色。
3/ 32免疫组化切片组织前期处理1、组织块大小应限于2cm×1.5cm×0.2cm 。
he染色步骤HE实验步骤
he染色步骤 HE实验步骤动物病理切片小结[样本处理]动物麻醉后，开胸，暴露心脏，头皮针插入左心室尖，打开37?生理盐水输液装置，从右心耳下沿剪开右心房，灌洗至流出的生理盐水无血(20min)，换4%多聚甲醛固定液灌注(约5min)[固定]4%多聚甲醛固定。
[石蜡切片]取样从固定中取出待切组织，用手术刀切成2mm厚度的小样，装入脱水小盒中，铅笔标号纸条同放入小盒后流水洗30min，蒸馏水浸洗处理Mice:脱水50%乙醇 2-3h170%乙醇 1-2h80%乙醇 1h95%乙醇 2h(1h+1h)100%乙醇 2h(1h+1h)透明二甲苯 35min+35min浸蜡 1h+1h+1h (62?蜡)[HE染色]脱蜡二甲苯? 15min二甲苯? 15min二甲苯:无水乙醇(1:1) 2min无水乙醇? 2min无水乙醇? 2min95%乙醇 2min85%乙醇 2min70%乙醇 2min50%乙醇 2min蒸馏水 5min(如果是DAB染色要抗原修复)HE染色苏木素 6-8min (时间可以延长，现在10-30min)冲洗 1min(反向将载玻片反向冲洗，注意不要脱片)2含1%盐酸的乙醇进行分色(用75%乙醇配)2-3s动作要快氨水反蓝 >10min伊红 10s冲洗固定脱水95%乙醇 2min100%乙醇? 2min100%乙醇? 2min二甲苯? 2min二甲苯? 2min 树胶封片组织浸蜡-常规石蜡切片制作组织经过透明剂的完全透明后，被移放于65?左右熔化的石蜡中，于65?的电热恒温箱中浸渍的过程称为浸蜡。
组织在脱水时，组织中的脂类和类脂等物质在脱水剂的作用下被溶解掉，留下了许多腔隙，许多管腔组织和血管，也有许多腔隙，这些都严重地影响了切片。
组织浸蜡时，由于诱导剂(二甲苯)的作用，石蜡进入到组织的各个角落，并在各个角落中保存下来。
当石蜡包埋后冷却时，这浸入到里3面的石蜡便可起到支撑的作用，而且使组织不致于变形，塌陷等现象，使切片能完整的切出，便于镜下观察。
冰冻切片免疫荧光染色及HE染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)（1）冰冻切片室温晾干15分钟；（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；（4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5）PBS洗3次，每次10分钟；（6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时；（7）PBS洗3次，每次15分钟；（8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照；（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。
`注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。
附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：（1）pH7.4 0.01MPBS：配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g0.1MPBS配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH7.2-7.4（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存（3）封闭液：10％NGS－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存一、操作方法及步骤：①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。
②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。
一种改进的胡萝卜染色体制片方法
一种改进的胡萝卜染色体制片方法陈磊;管长志;尹立荣;霍文娟;赵恒【摘要】以胡萝卜根尖作为试验材料,对常规胡萝卜染色体制片方法进行了改良,结果表明:经改良后的制片方法在质量和获得所需细胞数量上都有明显的提高.【期刊名称】《天津农业科学》【年(卷),期】2009(015)002【总页数】2页(P12-13)【关键词】胡萝卜;染色体制片;改良【作者】陈磊;管长志;尹立荣;霍文娟;赵恒【作者单位】天津市农业生物技术研究中心,天津,300384;天津市农业生物技术研究中心,天津,300384;天津市农业生物技术研究中心,天津,300384;天津市农业科学院,天津,300192;天津市农业科学院,天津,300192【正文语种】中文【中图分类】S631.2细胞分类学是应用细胞学的特征和性状，如染色体的形态、数目寻求他们与分类等级之间的关系，探索种群的发育和演化，从而为植物类群的变异和起源获得更广泛、更有根据的资料。
核型分析作为植物学分类及遗传研究的一个重要手段，可以使学者们在研究有争议的植物时有更多的参考资料，以达到意见上的统一。
染色体制片是显示染色体形态和结构的技术。
目前，常用的胡萝卜染色体观察方法为醋酸地衣红染色法和去壁低渗火焰干燥法。
笔者通过实践得知，前者虽然操作简便，但不易获得良好的压片，而后者试验条件苛刻，过程繁琐。
改良后的制片方法克服了以上两种方法的缺点，不仅方法简便，还可获得良好的压片。
1.1 取材1.1.1 材料把籽粒饱满的胡萝卜种子放在垫有滤纸的培养皿中，置于25℃恒温箱内，待根长至1～2 cm时可作为供试材料。
1.1.2 取材方法一般取材时间为下午2点，预处理方式为活体。
1.1.3 材料处理将根尖在解剖镜下用解剖针对其表面做轻微划伤处理，处理后在蒸馏水中浸泡活化5min。
1.2 染色体制片1.2.1 预处理将活化后的材料放入饱和的对二氯苯饱和溶液中，静置2～2.5 h，反复冲洗3次后，置于卡诺氏固定液中进行固定，时间为20～24 h，然后反复冲洗3次。
实验技术—HE染色
实验技术—HE染⾊⼩⿏胚胎切⽚原位杂交（⼀）主要试剂及配制⽅法：a)原位杂交⽤10×PBS储存液（0.5 L体积配⽅）：向1L烧杯中依次加⼊29.22 g NaCl ，13.86 g Na2HPO4·12H2O 和1.763 g NaH2PO4·2H2O，然后加⼊400mL ddH2O充分搅拌溶解，⽤固体NaOH将pH调节⾄7.4，然后加⼊ddH2O定容⾄0.5 L，最后各组分终浓度为NaCl=1.3mol/L，Na2HPO4=70mmol/L，NaH2PO4=30mmol/L，⾼压灭菌后室温保存备⽤；b)1×PBS⼯作液：将10×PBS储存液⽤灭菌⽔稀释10倍即可；c)10×⽢氨酸溶液：称取⽢氨酸10g溶于ddH2O或DEPC⽔中，最后补⾜ddH2O定容⾄1000ml，⾼压灭菌备⽤。
该液为储备液，-20℃储存。
使⽤时⽤PBS将10×⽢氨酸储备液稀释为⼯作液（1.0mg/mL)；d)5M NaCl：在800ml⽔中溶解292.2g NaCl，加⽔定容⾄1L，⾼压灭菌后室温保存备⽤；e)1M Tris-HCl ( pH7.5 ，pH9.5)：在800ml⽔中溶解121.91g Tris碱,加⼊浓HCl调节pH值⾄所需值（应使溶液冷⾄室温后⽅可最后调定pH值），然后加⽔定容⾄1L，最后⾼压灭菌，室温保存备⽤；f)1M MgCl2：在800ml⽔中溶解203.4g MgCl2·6H2O，⽤⽔定容⾄1L，⾼压灭菌，室温保存备⽤；g)20%（W/V)SDS：20 g SDS溶解于80 mL ddH2O中，加热到68 ?C溶解，加热的同时⽤玻璃棒搅拌助溶，⽤浓盐酸调节pH 值到7.2，加⽔⾄100 mL，⾼温⾼压灭菌，室温保存备⽤；h)3%过氧化氢溶液：⽤于组织脱除⾎⾊，也可起到⼀定RNase抑制剂效果，使⽤时将H2O2原液（30%）⽤ddH2O稀释10倍即可使⽤；i) 2 µg/mL Proteinase K/PBS：使⽤时配制，将Proteinase K (20mg/mL，-20 ?C冷冻保存）⽤PBS稀释10000倍使⽤；j)⼄酰化试剂：如配制40 mL溶液，需加⼊530 µL三⼄醇胺，100 µL冰⼄酸，70 µL 浓HCl，ddH2O定容⾄40 mL；k)NT Buffer：各种成分终浓度为0.1 M Tris-HCl ( pH7.5 )，0.15 M NaCl。
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脱水透明
标本经二甲苯透明后，折射率改变，透明度提高，使得染 上色的部位更清晰地显示出来。
步骤 流水冲洗4h→ 70％乙醇2h → 80 ％乙醇过夜→ 90 ％乙醇 2h→无水乙醇Ⅰ1h →无水乙醇Ⅱ1h →二甲苯Ⅰ15min →二
甲苯Ⅱ15min
较常用的透明剂是二甲苯、甲苯、苯、氯仿等
1、二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久， 容易收缩变脆变硬
染色步骤 1、64℃烤片30min 2、脱蜡至水（二甲苯ⅠⅡ各15min，无水乙醇ⅠⅡ各5min ，90％、80％、70％乙醇各1min） 3、蒸馏水浸洗3min 4、苏木素染3min 5、盐酸酒精分化 6、自来水返蓝15min 7、伊红染色30min 8、脱水（70％、80％、90％乙醇各30s，无水乙醇ⅠⅡ各 2min，二甲苯ⅠⅡ各15min） 9、封片镜检
包埋模具
染色缸
切片盒
切片机
HE
苏木精 — 伊红染色法简称HE染色法 ，石蜡切片技术里 常用的染色法之一 。S苏木精染液为碱性 ，主要使细胞核内 的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色 ；伊红为酸性染料 ， 主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色 。HE染色法是 组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛 的技术方法。
切片细胞核棕色， 表明苏木精 没有充分蓝化， 或苏木精过度氧化 失去染色能力
原因：苏木精染色液中的
金属膜，黏附在玻片上。 对策：每天染色前仔细过 滤苏木精染色液，或建议 使用半氧化苏木精染色液。
染色后有杂质
伊红着色
原因：伊红染液的pH 值可能大于
5 ；也可能是蓝化液残留过多；切 片太薄；或切片经伊红染色后在乙 醇脱水时间过长。
原因：伊红染色液浓度太高；切
片在伊红染色时间过长；切片在 伊红染色后经乙醇脱水步骤时过 的太快， 而使乙醇分化伊红的作 用不能产生。
对策：适当稀释伊红染色液，减
少伊红染色时间，或者使切片在 乙醇脱水等步骤时，停留时间相 对均匀。同样， 也要检查切片的 厚度是否合适。
伊红深染导致细胞核与细 胞质没有层次，缺乏对比
封片：
原因：切片经梯度乙醇处理后没
有完全脱水， 导致二甲苯透明中 性树胶封固后残留大量水分。也可 能是封片的时候出现的气泡。
对策：移去盖玻片， 用二甲苯溶
解封固剂如中性树胶。将切片置入 新鲜的无水乙醇换几道。待切片重 新脱水完全后，用新二甲苯透明， 中性树胶封固。所有用于脱水和透 明的液体，在使用一定时间以后， 应即时更换。将切片浸如二甲苯中， 重新封片。
切片可能产生的问题及解决方法
切片厚薄不匀
原 因： 1、切片机有毛病 2、夹刀不当，刀的倾角太大 3、未旋紧标本台螺旋 4、石蜡块过硬 解决办 法 1．矫正切片机装置 2．对症治疗 3．旋紧螺旋 4．将石蜡块在水中浸泡
材料发生裂隙破碎或脱落 原 因： 1、脱水不干净 2、有透明剂残留 3、石蜡透入时，温度过高或时间过长 4、由于脱水剂和透明剂的影响，使组织变硬发脆 5、材料太硬或太粗 补救办法： 1、无法弥补 2、增加浸蜡时间，重新包埋 3、无法补救 4、用正丁醇、叔丁醇和二氧六环等进行脱水和透明 5、在蜡块表面涂一薄层火棉胶溶液
沈阳佰创生物技术有限公司
样本的前期处理及HE染色
制作人：赵恒 日 期：2014-12-30
1
取材
注意事项 1、植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分 动物材料取用时常对动物施以麻醉，常用的麻醉剂有氯 仿和乙醚，或将动物杀死后迅速取出所需要的组织 2、取材必须新鲜，这一点对于从事细胞生物学研究尤为重 要，应该尽可能割取生活着的组织块，并投入固定液 3、切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤 4、切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一 般厚度不超过2mm，大小不超过5×5mm2
2
固定
固定液的性质和条件 1、能迅速渗入组织，使组织细胞形态在短期内不至于有 较大变化 2、固定液有相当的渗透力，对组织各部分的渗透力相等 ，可使组织内外完全固定
3、使组织细胞不至于因固定而引起人为的改变
4、尽可能避免固定剂使组织膨胀或收缩
5、使组织达到一定硬度，获得较佳的折光率和对染料具 有较强的亲合力。
固定剂种类
单纯固定剂 ：10%甲醛、 4%多聚甲醛 、饱和的苦味酸溶
液 、冰醋酸 、锇酸 混合固定剂 ：Bouin氏固定液 、Zenker液（PH2.3）、 Carnoy液 、改良Bouin氏固定液
固定的目的 1、防止组织溶解及腐败，以保持组织和细胞与正常生活 时的形态相似
2、使细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变为不 溶性物质，以保持它原有的结构与生活时的相仿
原因：染色时间短；苏木 素过度氧化，失去染色能 力；分化时间过长。
对策：切片重新染色。
苏木素染色太浅，细胞核 与细胞质颜色对比度差。
原因：与图2相反，染色液
时间过长、切片太厚、分化 步骤时间太短。
对策：如果切片不是因为太
厚，脱色、漂白、重新染色， 对于染色和分化时间做些适当 的调整。若太厚则需要重新切 片。
细胞核过染， 核膜、核仁等不清晰， 细胞质( 尤其是皮肤上皮细胞) 含有大量的 细胞核染色液苏木精， 导致细胞核与细胞 质比例失调。
原因：苏木精染色液过度氧化
和切片在苏木精染液染色后返 蓝不足。
对策：染色前检查苏木精染色液
的染色能力，过渡氧化，应及时 更换。其次，在苏木精染色后， 给切片以足够的蓝化时间。
原因：盖玻片弯曲或不平整；
封固剂含二甲苯过多， 稀释 过度。
对策：移去盖玻片， 重新
找一张盖玻片，用干净的封 固剂封片。如用手工封片法， 每天保证盛装封固剂的容器， 在封固结束的时候盖紧盖子。 尽量使用小的容器盛装封固 剂，一旦封固剂太粘稠，就 可以废弃不再使用。
展片和捞片
1、直接展片法：在载玻片上滴加几滴蒸馏水，然后把切片 铺在小滴上面，用酒精灯在载玻片下面加热，待完全展 平，倾斜载玻片，倒弃多余水分，同时摆正切片。 2、温水漂浮法：用恒温水浴箱，先使水温保持在42℃，使 切好的石蜡切片漂浮在温水中受热后及在表面张力的作 用会自然平整地展开，必要时可用眼科镊轻轻拔开，然 后捞片，并及时编号。 展好的切片放在64℃恒温烤箱中4h，烤干备用。
2、材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱 水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状 说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好 3、使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分 并保持其无水状态
浸蜡包埋
1、组织经过脱水透明处理后浸蜡4h，然后进行包埋 2、浸蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石 蜡熔点3度
几种常见的染色问题
脱蜡：
原因：①烤( 烘) 片温度
太低，脱蜡前没有充分烤 ( 烘) 干。 ②二甲苯脱蜡时 间不足， 或二甲苯使用过 久，造成脱蜡不尽。
对策：切片需退回到脱
蜡步骤，延长脱蜡时间， 或跟换二甲苯，重新染色。
切片中白色的区域脱蜡不彻底，染色液由 于石蜡斑点的残留而不能渗透着色。
染色： 苏木素着色
3、组织细胞内的不同物质经固定后可以产生不同的折光 率，对染料也产生不同的亲和力，造成光学上的差异 ，使得在生活情况下原来看不清楚的结构变得清晰起 来，并使得细胞各部分容易着色，有利于区别不同的 组织成分 4、固定剂的硬化作用，增加组织硬度，便于制片
固定时应注意的事项 1、固定液及被固定的组织必须新鲜；固定液的用量一般为 组织体积的10~20倍 2、固定时间视组织块的种类、性质、大小，固定液的种类 性质、渗透力的强弱，固定时的温度的高低，实验目的 等来决定 3、防止被固定的组织因固定剂的作用而发生变形 4、固定所用的固定液，以新配的为好，放置过久会失效 5、在固定期间摇动组织或摇动容器有利于固定液的渗入， 对长期固定的标本，可经常更换固定液 6、固定时间太短，就会影响组织固定的效果时间太长，福 尔马林会产生一种酸，影响核的染色
2、甲苯的一般性质与二甲苯相似。用法亦同，唯沸点较低， 透明较慢，但不会使组织变脆 3、苯的用法同于二甲苯，对组织的收缩作用小，但须警惕其 爆炸和吸入而引起中毒。 4、氯仿适于大块组织的透明
注意事项
1、透明时间应由组织大小而定，—般各级停留时间在5min 至15min，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过 1h为宜
在显微镜下呈现大量水珠或 云雾状改变
原因：盖玻片上可能有封固切
片的封固剂。
对策：移去盖玻片， 重新用干
净的盖玻片封片。
Hale Waihona Puke 盖玻片上有封固剂所致切片组织模糊不清
原因：切片封片前放置在
空气中时间太长， 以至于 二甲苯挥发切片干燥所致。
对策：移去组织切片上的
盖玻片和封固剂， 重新处 理。将切片水洗数分钟，然 后重新脱水、透明、封固。 封片过程中要保持组织切片 的轻度湿润，尽量不要让其 干燥。 封片后镜下则会出现类似色素的 点状结晶或类似“裸核”样的改变
对策：检查伊红染液的pH值，用
乙酸将其调节在4.6-5.0 之间，使伊 红染色色彩艳丽。确保每次蓝化后， 用自来水冲干净。检查切片的厚度。 脱水时不要让切片在低浓度乙醇停 留时间过长， 因为含水多的低浓度 乙醇会将伊红的颜色分化掉。
切片中央区域伊红染色不均 匀， 可能为弱碱性溶液残留导致 伊红拒染所致