食品中维生素D之检验方法
超高效合相色谱法测定鱼肝油中维生素D3含量
超高效合相色谱法测定鱼肝油中维生素D3含量陈虹;杨桂秋;吴文杰;吴寒秋;程燕【摘要】采用超高效合相色谱法快速测定鱼肝油中维生素D3.样品经正己烷提取后离心,采用0.22μm滤膜过滤上机检测.选用Waters Acquity UPC2 Torus 1-AA 色谱柱(100 mm×3.0 mm,1.7μm)流动相为80％(体积分数)CO2和20％(体积分数)甲醇等度洗脱,流速1 mL/min,检测波长265 nm.实验结果表明:维生素D3在5～200 mg/L范围内与峰面积呈良好线性关系,相关系数(r2)为0.9994;以不低于3倍信噪比计算方法的检出限(LOD,S/N=3)为1.2 mg/kg;方法定量限(LOQ,S/N=10)为5 mg/kg;维生素D3在3个不同加标水平的平均加标回收率为89.1％,相对标准偏差为(RSD)0.3％～3.2％.该方法操作简便、快速、准确,可以满足鱼肝油中维生素D3的检测要求.【期刊名称】《沈阳化工大学学报》【年(卷),期】2018(032)004【总页数】6页(P340-344,350)【关键词】超高效合相色谱;鱼肝油;维生素D3【作者】陈虹;杨桂秋;吴文杰;吴寒秋;程燕【作者单位】沈阳化工大学制药与生物工程学院,辽宁沈阳110142;沈阳化工大学制药与生物工程学院,辽宁沈阳110142;中国检验检疫科学院食品安全研究所,北京100176;中国检验检疫科学院食品安全研究所,北京100176;中国检验检疫科学院食品安全研究所,北京100176【正文语种】中文【中图分类】O657.7鱼肝油是一种从鲛类动物Squahdae等无毒海鱼肝脏中提出的一种脂肪油[1]，其中维生素D3是鱼肝油中主要的营养物质之一.维生素D3有助于促进小肠粘膜对钙的吸收，能够预防佝偻病和骨样组织钙化障碍等疾病[2-3]，然而，维生素摄入过量也导致健康风险[4].因此，测定鱼肝油维生素对评价鱼肝油品质优劣、合理使用鱼肝油具有现实意义.脂溶性维生素的检测有很多种方法：液相色谱法[5-6]、液相色谱串联质谱法[7-9]、分光光度法[10]、毛细管电动色谱法[11]等.最常见的检测鱼肝油中维生素D3含量的方法主要是液相色谱法.液相色谱法与分光光度法比较优势在于可以对复杂基质样品进行在线分离并定量定性，能排除样品基质中部分干扰.液相色谱法相比于液相色谱串联质谱法而言仪器设备经济实惠，操作和仪器维护相对简单，可以满足本实验对目标物的检出限和精密度检测要求.食品中维生素的检测主要依据《GB 5413.9—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中VA、VD、VE的测定》[12].然而国标中试样经皂化后用石油醚提取，用正相色谱净化，反相色谱分离，外标法定量.该方法操作复杂，耗时长，而且干扰物质较多，容易造成维生素被破坏，导致回收率下降.文献报道正相色谱检测鱼肝油中的维生素D3前处理简单[13]，能够简化操作步骤.waters超高效合相色谱(UPC2)是2012年面世的新型正相色谱，它具有传统高效液相色谱和超临界流体色谱的优点[14]，以二氧化碳为流动相主体，依靠CO2的溶剂化能力对目标物进行分离、分析[15]，具有有机溶剂使用量少、分析速度快、重现性好等优点[16-17].合相色谱作为一种新技术能够完全替代正相液相色谱，合相色谱分离成本仅为液相色谱的十分之一；其灵敏度比正相液相色谱高，分离效果更好，分析速度快，能够分离液相色谱难以分开的同分异构体组分，还能分析传统液相色谱难保留或难洗脱的成分(比如多糖).合相色谱与气相色谱相比，当分析挥发油、油脂类样品时，合相色谱能简化前处理步骤，避免了衍生化，大大提高了检测效率.目前国内没有应用超高效合相色谱检测鱼肝油基质中维生素D3含量的文献报道.本文采用超高效合相色谱法测定鱼肝油中维生素D3含量，样品经正己烷提取后上样，能够大大简化样品预处理步骤，缩短分析时间，具有预处理简单、耗时短、灵敏度高、回收率高等优点，为复合鱼肝油制剂的质量控制提供一种新方法.1 材料与方法1.1 仪器与试剂、材料Waters超高效合相色谱，美国 waters公司，检测波长设置为265 nm；Allegra X-22R 冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司；VORTEX-5 涡旋混合器，海门市Kylin-Bell公司; 维生素D3，质量分数为98 %，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司; 甲醇、乙腈、异丙醇、正己烷，色谱纯，美国Thermo Fisher 公司；6种鱼肝油样品，购于当地药店(中国，北京).1.2 标准溶液的配制标准储备液:准确称取维生素D3 10.0 mg，加入到10 mL容量瓶中，用正己烷定容到10 mL，待其完全溶解，配制成 1 g/L 的标准储备液，避光储存在-25 ℃冰箱中待用.标准工作液：准确吸取5 mL、2 mL、1 mL、500 μL、200 μL、100 μL、50 μL、20 μL、10 μL标准储备液于10 mL 容量瓶中，用正己烷定容成质量浓度分别为500 mg/L、200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、20 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2 mg/L和1 mg/L 的标准工作液，置于棕色样品瓶，避光储存在-4 ℃冰箱中，平均每4 h重新配制一次.1.3 超高效合相色谱条件色谱柱:Waters Acquity UPC2 Torus 1-AA(100 mm×3.0 mm，1.7 μm),流动相:A 为 CO2，B 为甲醇; 体积分数为80 %的CO2 等度洗脱.采集时间3 min;流速1 mL/min; 进样量1 μL; 柱温50 ℃ ; 检测波长 265 nm; 动态背压(ABPR):15.169 MPa.1.4 样品处理前处理参考相关文献[13]，采用正己烷直接提取稀释上样.准确称取 1.0 g鱼肝油样品于 50 mL 聚乙烯管中，加入 10 mL正己烷，用涡旋混匀后，高速冷冻离心机于4 ℃ 下以7 500 r/min 离心 5 min，取 1 mL 上清液，经0.22 μm 滤膜过滤后，经超高效合相色谱分析.2 结果与讨论2.1 色谱条件的优化比较3种Waters Acquity UPC2常用色谱柱： Waters Acquity UPC2 BEH(150 mm×2.1 mm，1.7 μm),Waters Acquity UPC2 Torus 1-AA柱(100 mm×3.0 mm,1.7 μm) 和Waters Acquity UPC2 Torus 2-PIC柱(150 mm×2.1 mm,1.7 μm).3种色谱柱都能在5 min内出峰完全.由表1可知：使用 BEH柱和2-PIC柱时，维生素D3的对称因子是1.57和1.71，峰面积分别为31 428和33 728；而使用1-AA柱时，维生素D3的对称因子是1.48，峰面积是30 240.对称因子越接近1 说明峰型越对称，峰型越好.由图1可知：当使用BEH和2-PIC柱时，维生素D3在1 min左右出峰，杂质峰通常在1 min之前出现.出峰过早容易与杂质一起出峰，在实际检测中影响检测结果，所以，使用BEH和2-PIC柱不合适.使用1-AA柱时，维生素D3在1.8 min左右出峰，目标物的峰与杂质峰、溶剂峰等能够很好地分开.综上所述，使用1-AA柱时维生素D3的响应更高，峰型更好，出峰时间更合适.因此，色谱柱选择Waters Acquit UPC2 Torus 1-AA柱.表1 不同色谱柱下维生素D3的峰面积和对称因子Table 1 Peak area and symmetry factors of vitamin D3 with different chromatographic columns色谱柱峰面积/(mV·s)对称因子BEH31 4281.571-AA30 2401.482-PIC33 7281.71 图1 不同色谱柱上维生素D3色谱图Fig.1 Chromatogram of vitamin D3 with different chromatographic columns2.2 流动相中助溶剂的优化CO2超临界流体作为超高效合相色谱的流动相，因为其极性过低，通常加入甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈等有机溶剂作为助溶剂.助溶剂能够调整流动相极性，改变流动相对目标物的溶解能力，影响目标化合物的保留时间并改善目标化合物的峰型[18].比较4种常用助溶剂：甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈，考察助溶剂对维生素D3峰型及保留时间的影响，选择最优助溶剂.结果如图2所示.图2 不同助溶剂下维生素D3色谱图Fig.2 Chromatogram of vitamin D3 with different solvents不同助溶剂对维生素D3的峰型影响不大，但是对维生素D3的保留时间影响明显.当使用甲醇为助溶剂时，维生素D3在1.5～2 min 之间出峰；当使用助溶剂为乙醇、异丙醇和乙腈时，维生素D3的保留时间均大于2 min.因此，可以看出选择甲醇为助溶剂能节省分析时间，故最终选择甲醇为助溶剂.2.3 系统背压的优化系统背压是超高效合相色谱重要参数之一.其主要作用是控制流动相密度和性能，改变流动相的洗脱能力和性能[15]. CO2超临界流体的密度和黏度随着背压的增加而增加，会导致柱压升高[17]，所以，选择合适背压非常重要.考察了12.411 MPa、13.790 MPa、15.169 MPa和16.548 MPa 4种背压下CO2超临界流体对目标物保留时间和峰型的影响.结果如表2.由表2可知：当背压为12.411 MPa时，维生素D3的保留时间为1.24 min，对称因子为1.34;当背压为15.169 MPa时,维生素D3的保留时间为1.19 min，对称因子为1.19.通过比较保留时间和对称因子，可以看出当柱压为15.169 MPa时，虽然和其他条件相比维生素D3的出峰时间相差不大，但是维生素D3峰型更好；而当柱压为16.548 MPa时，色谱柱压力过高.通过对保留时间、峰型及色谱柱压力的综合考虑，最终选择背压为15.169 MPa.表2 不同系统背压下维生素D3的保留时间和对称因子Table 2 Retention time and symmetry factors of vitamin D3 with different dynamic pressures背压/MPa保留时间/min对称因子12.4111.241.3413.7901.211.3515.1691.191.1916.5481.161.262.4 色谱柱温度的优化温度也能够影响目标物的峰型和保留时间.在30 ℃、40 ℃、50 ℃下考察柱温对目标物分离的影响.结果表明：随着温度的变化，维生素D3的保留时间并没有明显差异，但是，当温度为30 ℃时，柱压较高，基线噪音较大，重现性较差；当温度为40 ℃时，基线噪音有所减小；当温度为50 ℃时，基线噪音减小，基线平稳，具有较好的重现性.所以，色谱柱最终温度选择50 ℃.2.5 流速的选择流速是影响目标物峰型和保留时间的重要因素之一.随着流速的增大，目标物的出峰时间提前，峰型变得尖锐；但是流速过大容易造成柱压过高，影响峰型，缩短色谱柱的使用寿命.实验在 0.8 ～ 1.8 mL/min 范围内对流速进行优化.结果如图3所示.图3 不同流速下的维生素D3色谱图Fig.3 Chromatogram of vitamin D3 with different flow velocities当流速为1.8 mL/min、1.5 mL/min和1.2 mL/min 时，维生素D3的保留时间小于1 min，出峰时间过早，在检测样品时容易与杂质一起出峰，对样品中维生素D3含量的精确度造成干扰；当流速为0.8 mL/min 时，维生素D3的色谱峰过宽.综上所述，选择1 mL/min为最佳流速.2.6 方法学考察2.6.1 线性、检出限及定量限选取500 mg/L、200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、20 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2 mg/L和1 mg/L的维生素D3标准工作液，按照优化好的最佳色谱条件进行测定，绘制样品质量浓度(x，mg/L) 与峰面积(y，mV ·s) 标准曲线，进行线性回归分析，结果如表3 所示.该方法在5 ～ 200 mg/L 时线性关系良好.检出限、定量限如表3 所示.表3 维生素D3的线性回归方程、线性范围、检出限、定量限Table 3 Linerregression,liner range,LOD,LOQ of vitamin D3项目结果线性回归方程y=2 993.5x-2 174.9相关系数r20.999 4线性范围/(mg·L-1)5～200检出限/(mg·L-1)1.2定量限/(mg·L-1)5.02.6.2 回收率和精密度称取1.0 g的鱼肝油样品于离心管中，分别加入5 mg/kg、10 mg/kg，50mg/kg的维生素D3标准工作液，静置一段时间后，样品经正己烷提取，过膜上机，在上述优化好的色谱条件下进样检测，计算其加标回收率.低、中、高3个加标水平分别重复测定6次，结果如表4.维生素D3在3个加标水平中回收率分别为87.4 %、90.7 %和89.3 % ，相对标准偏差(RSD) 为 3.2 %、1.0 %、0.3 %. 表4 回收率及精密度Table 4 Recovery and precision维生素加标量/(mg·L-1)回收率/%RSD/%(n=6)587.43.2VD31090.71.05089.30.32.6.3 实际样品检测对6个不同品牌的鱼肝油样品进行分析，检测结果见表5. 由表5的结果显示：不同品牌的鱼肝油中维生素D3的含量不同，这可能与鱼肝油原料的来源、处理、加工工艺等因素有关.表5 不同品牌鱼肝油中维生素D3的含量Table 5 Content of six kinds of Cod Liver Oil and vitamin D3样品维生素D3含量/(mg·kg-1)116.2213.5340.0415.256.5610.63 结论建立了超高效合相色谱(UPC2) 对鱼肝油中维生素D3的检测方法，考查了色谱柱、助溶剂、系统背压、色谱柱温度、流速等因素，选定了最佳实验条件.该方法分析时间短，维生素D3在2 min出峰完全，实验步骤简单，安全环保，为鱼肝油中维生素D3的检测提供了技术支持，为鱼肝油的质量评价提供新方法.【相关文献】[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:第2部[M].北京：化学工业出版社,2005:354.[2] 邵胜荣,郭利萍.鳕鱼肝油中维生素A、D含量检测方法的探讨[J].食品科技,2013，38(11):276-279.[3] 王银辉,刘国英,汤有宏,等.超高效合相色谱法同时测定米酒中4种脂溶性维生素方法的研究[J].酿酒科技,2016(3):84-87.[4] LETAVERNIER E,VERRIER C,GOUSSARD F,et al.Calcium and Vitamin D Have a Synergistic Role in a Rat Model of Kidney Stone Disease[J].Kidney International,2016,90(4)：809-817.[5] ASLAM J,KHAN S H,KHAN S A .Variation in Fat Soluble Vitamins(A,D,E,K)in in Vitro and Ex Vitro Germinated Chickpea(Cicer Arietinum L.) 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维生素D测定方法
维生素D测定方法维生素D的测定方法，目前只有“婴幼儿配方食品和乳粉通用检验方法”介绍的GB/T 5413.9-1997所列的先正相收集，后反相分离的HPLC测定方法。
该法可同时测定A.D.E，但操作比较烦琐，对于维生素的营养素补充剂，样品中杂质干扰小，在测定A.E的同时可控制采样量和色谱的分离条件，并参照GB/T 5413.9-1997与GB/T 5009.82-2003（食品中维生素A和维生素E的测定）的方法检测营养补充剂维生素D也可同时测定A.E。
一、原理样品中维生素D经热皂化处理后。
用HPLC紫外检测，内标法定量。
二、仪器1、HPLC：water公司，510泵，486紫外检测器，三锐色谱工作站。
2、超声波振荡器3、水浴箱4、0.45μ滤膜三、试剂1、维生素D3标准对照品：精确称取维生素D3标准对照品（sigma公司）5.0mg 左右加已脱醛处理的无水乙醇至50ml刻度，配成100μg/ml的标准D3贮备液。
2、维生素D贮存一般较稳定，贮备液也可在264μn下按常规的标定方法用比吸光系数计算出维生素D3的标准浓度。
维生素D3比吸光系数E1%cm=493。
3、其他试剂：无水乙醚，无水乙醇，无水硫酸钠，甲醇，抗坏血酸，氢氧化钾，内标苯并e芘……等同GB/T 5009.82-2003或GB/T 5413.9-1997四、方法1、准确称取经研碎成粉状的均匀样品2.0g于皂化瓶中，加内标苯并e芘溶液2.0ml，加10%抗坏血酸5ml，样品先混成均匀的糊状，再加无水乙醇30ml同1：1氢氧化钾溶液10ml在沸水上皂化10分钟，使皂化完全，皂化后立即放入冰中冷却。
2、提取、洗涤、浓缩等步骤同GB/T 5009.82-2003，最后用无水乙醇定容至2ml。
五、色谱条件“1、流动相：甲醇：水=97.5：2.52、分析柱：Kromasil C18 5μ250×4.6mm3、紫外检测器波长：264nm（如同时测定维生素A.E可依维生素A.D.E的峰时间在325nm→264nm→292nm转换。
(新)食品分析检验 维生素的测定
一)维生素A的测定
维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源
于肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食
品中。植物性食品中不含VA，但在深色果 蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为 VA，故称为VA原。
二 脂溶性V的测定
VA、VD、VE、与类脂物一起存于食物中，摄食时 可吸收，可在体内积贮。 脂溶性维生素具有以下理化性质：
1．溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂 肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。 2．耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定， 对碱 稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在 下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。
对于紫外分光光度法不必加显色剂显色，
可直接测定维生素A的含量，对样品中含 VA低的也可以测出可信结果，操作简便、 快速。
三、β—胡萝卜素的测定 第一方法是HPLC； 第二方法为纸层析法。 胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的 天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝 卜素，其中在分子结构中含有 β一紫罗宁残基的类
⑶ 对碱稳定；
1.高效液相色谱法测定食物中VA、VC
（GB/T 5009.82—2003中第一法） 高效液相色谱法测定维生素A是近几年发展起 来的方法，此法能快速分离和测定视黄醇和它的 同分异构体、酯及其衍生物。
2.比色法测定VA的含量
（1） 原理
在氯仿溶液中，VA与三氯化锑可生成蓝 色可溶性络合物，在 620 nm 波长处有最大 吸收峰，其吸光度与VA的含量在一定的范 围内成正比，故可比色测定。
一维反相高效液相色谱法测定保健食品中维生素D2和维生素D3
分析 检测一维反相高效液相色谱法测定保健食品中维生素D2和维生素D3 刘剑 易路遥＊ 晏亮 吉伟佳 虞雪军 江西省药品检验检测研究院 江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心章提出利用一维反相高效液相色谱法测定片剂、颗粒、软胶囊和硬胶囊保健食品中维生素Ｄ的含量。
方法：样品经淀粉酶水解，其中加入抗氧化剂；水解后加入氢氧化钾皂化，再用石油醚提取，经氮吹至近干，用甲醇溶解摇匀。
经０．２２µｍ有机滤膜过滤后供液相色谱仪分析。
以Ｔｈｅｒｍｏ Ａｃｃｕｃｏｒｅ Ｐｏｌａｒ Ｐｒｅｍｉｕｍ（１００ｍｍ＊４．６ ｍｍ）为分离柱，甲醇－乙腈为流动相，流速为０．８ｍｌ／ｍｉｎ，进样量为２０µＬ，在ＤＡＤ波长２６４ｎｍ处作检测。
检出限为０．７μｇ／１００ｇ，方法中维生素Ｄ２平均回收率为９３．７％－９８．８％ ；相对标准偏差０．５％－５．６ ％；维生素Ｄ３平均回收率为９２．８％－９９．１％ ；相对标准偏差０．３％－６．７ ％。
该方法快速、简便、准确，适用于片剂、颗粒、软胶囊和硬胶囊保健食品中维生素Ｄ测定。
试验部分仪器与试剂。
高效液相色谱仪（美国，型号Ｕｌｔｉｍａｔｅ），电子天平（美国，型号ＸＳ２０５ＤＵ）、紫外可见分光光度计（日本，型号Ｕ－３９００），氮吹仪（美国Ｏｒｇｎｏｍａｔｉｏｎ公司）。
维生素Ｄ２（中国食品药品检定研究院）标准品和维生素Ｄ３标准品（中国药品生物制品鉴定所）。
乙腈、甲醇、２，６－二叔丁基对甲酚、无水乙醇均为色谱纯；石油醚、抗坏血酸、氢氧化钾为分析纯；α－淀粉酶活力３００Ｕ／ｍｇ。
标准溶液配制。
标准储备液的制备：精密称取维生素Ｄ２标准品１１．８６ｍｇ，置５０ｍＬ棕色量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
精密称取维生素Ｄ３标准品１２．０９ｍｇ，置５０ｍＬ棕色量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；于４℃条件下储存备用。
标准储备液浓度的校正：精密吸取维生素Ｄ２和Ｄ３标准储备液各５００μｌ于各１０ｍｌ棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度，混匀，分别用１ｃｍ比色皿中，以无水乙醇为空白参比，在２６４ｎｍ波长处测定吸光值，得维生素Ｄ２储备液浓度为２２２．４µｇ／ｍｌ和维生素Ｄ３储备液浓度为２３６．８µｇ／ｍｌ。
带你了解25-羟基维他命D检测方法
家庭科学·新健康健康一点通2023·11优生活·营养主义七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七维他命D 主要包括维他命D2与维他命D3，能在肝脏当中转化为25-羟基维他命D3与25-羟基维他命D2，总称为25-羟基维他命D ，能衡量维他命D 营养状态。
25-羟基维他命D 是机体当中必需的脂溶性维他命，是维持人们身体健康、人体生长与发育的重要微量元素。
维他命D 是一种身体必需维他命，自然情况下，紫外线照射以及食物来源是补充维他命D 的主要来源，一般来说不同年龄段群体维持骨骼健康所需维他命D 参考摄入量有所不同，因此需要根据自身情况合理补充维他命D 。
维他命D2和D3能从食物当中获取，也能在人体当中通过特殊化学反应衍生，通过血液进入肝脏，并在维他命D-25羟化酶的作用下转化为25-羟胺D2和25-羟胺D3，在肾脏的催化下转化为有生理活性的1，25-羟基维他命D 。
25-羟基维他命D 在人体当中能留存3周时间，3周之后就会经过肝脏代谢出体外，它相对稳定并且具有相对高的浓度。
这个指标水平高低反映出身体对维他命的转化能力，也能反映出身体的食物摄入量，因此一般应用在人们的营养状况调查当中。
身体维持正常维他命D 水平对钙磷调节比较重要，如果身体缺乏维他命D ，身体仅仅只能吸收七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七七10-15%钙元素与60%左右磷元素，25-羟基维他命D 通过与维他命受体结合，有助于提升钙吸收率，从原来的吸收率能提升到30-40%，而磷吸收率可以提高到大约80%。
维他命D 对骨骼具有一定作用，因此儿童与老人都要注意补充维他命D ，如果儿童缺乏，就会增加软骨病发生风险，如果老年人缺乏，则会患骨质疏松症、增加骨折风险等，同时与自身免疫性疾病、糖尿病等都有一定关联。
25-羟基维他命D 是维他命D 营养状况的评估指标。
维生素D测定方法
维生素D测定方法维生素D的测定方法，目前只有“婴幼儿配方食品和乳粉通用检验方法”介绍的GB/T 5413.9-1997所列的先正相收集，后反相分离的H PLC测定方法。
该法可同时测定 A.D.E，但操作比较烦琐，对于维生素的营养素补充剂，样品中杂质干扰小，在测定A.E的同时可控制采样量和色谱的分离条件，并参照GB/T 5413.9-1997与G B/T 5009.82-2003（食品中维生素A和维生素E的测定）的方法检测营养补充剂维生素D也可同时测定A.E。
一、原理样品中维生素D经热皂化处理后。
用HPLC紫外检测，内标法定量。
二、仪器1、HPLC：water公司，510泵，486紫外检测器，三锐色谱工作站。
2、超声波振荡器3、水浴箱4、0.45μ滤膜三、试剂1、维生素D3标准对照品：精确称取维生素D3标准对照品（sigma公司）5.0mg 左右加已脱醛处理的无水乙醇至50ml刻度，配成100μg/ml的标准D3贮备液。
2、维生素D贮存一般较稳定，贮备液也可在264μn下按常规的标定方法用比吸光系数计算出维生素D3的标准浓度。
维生素D3比吸光系数E1%cm=493。
3、其他试剂：无水乙醚，无水乙醇，无水硫酸钠，甲醇，抗坏血酸，氢氧化钾，内标苯并e芘……等同GB/T 5009.82-2003或G B/T 5413.9-1997四、方法1、准确称取经研碎成粉状的均匀样品2.0g于皂化瓶中，加内标苯并e芘溶液2.0ml，加10%抗坏血酸5m l，样品先混成均匀的糊状，再加无水乙醇30ml同1：1氢氧化钾溶液10ml在沸水上皂化10分钟，使皂化完全，皂化后立即放入冰中冷却。
2、提取、洗涤、浓缩等步骤同GB/T 5009.82-2003，最后用无水乙醇定容至2ml。
总25羟基维生素D操作规程
25羟基维生素D测定标准操作规程1 检验申请单独检验项目申请：25羟基维生素D测定(缩写VD-T)；组合检验项目申请：贫血组合项目测定；临床医生根据需要提出检验申请。
2 标本采集与处理2.1标本采集2.1.1常规静脉采血约2ml，不抗凝，置普通试管中。
或采用含分离胶的真空采血管。
2.1.2检验申请单和血标本试管标上统一且唯一的标识符。
2.1.3急诊标本采集后，在检验申请单上填写标本采集时间。
2.1.4标本采集后与检验申请单一起及时运送至检验科。
专人负责标本的接收并记录标本的状态，对不合格标本予以拒收。
2.1.5 下列标本为不合格标本2.1.5.1标本量不足：少于0.3ml的全血标本，或少于0.1ml的血清或血浆。
2.1.5.2对于测定和吸样有干扰的标本。
2.1.5.3无法确认标本与申请单对应关系的。
2.1.5.4其他如标识涂改、标本试管破裂等。
2.2标本保存2.2.1接收标本后在30min内将标本离心分离出血清, 避免溶血。
2.2.2标本保存时间：室温（15～25℃）下可稳定8h，普通冰箱中（2～8℃）稳定48h。
需较长时间保存应将血清存放于-20℃。
冰冻标本仅可冻融一次。
为避免标本中水分挥发使血清浓缩，对保存时间超过1d的标本均加塞密闭或覆盖湿巾。
2.2.3已完成测试的标本保持完整的识别号，置2～8℃冰箱内保存7d。
2.3标本采集的注意事项2.3.1采血前使受检者保持平静、松弛、避免剧烈活动。
2.3.2采血后应使血液充分凝固，离心后的血清中不能含有颗粒物或微量纤维蛋白；可使用选用分离胶促凝的血液标本。
3 方法原理VD-T测定采用竞争化学发光免疫分析法，其检测原理来如下：第一步：将标本、预处理试剂1和预处理试剂2添加到反应管中，经过孵化，释放出与维生素D结合蛋白结合的25-羟基维生素D。
第二步：将预处理后的标本，抗25-羟基维生素D抗体碱性磷酸酶结合物添加到反应管中，经过孵化，样本中的25-羟基维生素D和抗5-羟基维生素D抗体碱性磷酸酶结合物形成复合物。
12.食品中维生素的测定
皂化样品
→ →
水洗去除脂类物
→ 有机溶剂提取 → →
测定
脂溶性维生素 (不皂化物)
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研磨法：适用于每克样品维生素A含量大于
5～10µg样品的测定，如动物肝脏的检测。步 骤简单，省时，结果准确。
①研磨 ②提取 ③浓缩
（3）测定
同皂化法
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结果计算
c V1 x 100 m V2
式中：C ----由标准曲线上查得样品溶液中维生素A的含量（µg）
m-----样品质量（g） V1----样品提取液的总体积（mL） V2----测定用样品提取液的体积（mL）
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适用范围及特点
适用于维生素A含量较高的样品（高于 510μg /g ），对低含量样品，因受其他脂溶性 物质的干扰，不易比色测定 该法的主要缺点：是生成的蓝色物质的 稳定性差。比色测定必须在6秒钟内完成， 否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。
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注意：
（1）维生素A见光易分解，整个实验应在暗处 进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃仪器 避光。
1/1000-----将mg/L换算成mg/mL
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测定步骤
（1）样品的采集和制备
①粮食：样品用水洗净，臵60℃烘箱中烘干， 磨碎，贮于塑料瓶内，盖紧瓶塞保存，备用。 ②蔬菜与其他植物性食物：取可食部分用 水洗净后，用纱布吸去水滴，切碎，用 组织捣碎机制成匀浆，贮于塑料瓶内于 冰箱中保存备用。
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（7）标准曲线绘制
维生素D测定法
附录VII K 维生素D测定法本法系用高效液相色谱法(附录V D)测定维生素D(包括维生素D2和D3，下同)及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量，以单位表示，每单位相当于维生素D 0.025μg。
测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行。
无维生素A醇及其他杂质干扰的供试品可用第一法测定，否则应按第二法处理后测定；如果按第二法处理后，前维生素D峰仍受杂质干扰，仅有维生素D 峰可以分离时，则可按第三法测定。
第一法对照品贮备溶液的制备根据各制剂中所含维生素D的成分,精密称取相应的维生素D2或D3对照品25mg,置100ml棕色量瓶中，加异辛烷80ml，避免加热，用超声处理助溶1分钟使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀，作为贮备溶液（1）；精密量取5.0ml至50mL棕色量瓶中，加异辛烷稀释至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0℃以下保存，作为贮备溶液（2）。
测定维生素D2时，应另取维生素D3对照品25mg，同法制成维生素D3对照品贮备溶液，供系统适用性试验用。
色谱条件与系统适用性试验用硅胶为填充剂，正己烷-正戊醇(997:3)为流动相，检测波长为254nm。
量取维生素D3对照品贮备溶液（1）5ml，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加热1小时，取出迅速冷却，加正己烷5ml，摇匀，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波长分别为254nm和365nm 的紫外光灯下，将石英吸收池斜放成45°,并距灯管5～6cm,照射5分钟,使溶液中含有前维生素D3、反式维生素D3、维生素D3和速甾醇D3；取此溶液注入液相色谱仪，测定维生素D3的峰值，先后进样5次,相对标准偏差应不大于2.0％；前维生素D3(与维生素D3的比保留时间约为0.5)与反式维生素D3(与维生素D3的比保留时间约为 0.6)以及维生素D3与速甾醇D3(与维生素D3的比保留时间约为1.1)的峰分离度均应大于1.0。
食品分析检验法与考点总结
绪论食品分析方法及开发方向1.分析方法〔1〕化学分析法化学分析法是以物质的化学相应为本原的分析方法。
化学分析法是食品分析的最根基、最重要的分析方法。
方法：重量分析、容量分析〔2〕仪器分析法仪器分析法是目前开发较快的分析技术，它是以物质的物理、化学性质为本原的分析方法。
它具有分析速度快、一次可测定多种组分、减少人为误差、自动化程度高等特点。
方法：色谱分析、电化学分析、原子汲取、核磁共振、比色分析〔3〕微生物分析法和生物鉴定法食品的微生物分析法和生物鉴定法要紧是指细菌学的检验，包括真菌及其毒素、食源性病原细菌及其毒素等的检验。
经典的方法有固体培养基法、液体培养基发酵法等。
(1)测定方法的开发(2)食品分析的仪器化(3)食品分析的自动化第一章一、采样的一般方法〔判定选择〕样品分检样、原始样品和平均样品三种。
由整批食物的各个局限采取的少量样品称为检样。
把许多份检样合在一起称为原始样品。
原始样品通过处理再抽取其中一局限做检验用者称为平均样品。
1.散粒状样品(如粮食、粉状食品)〔判定选择〕散粒状样品的采样容器有自动样品收集器、带垂直喷嘴或歪槽的样品收集器、垂直重力低压自动样品收集器等。
2.液体样品液体样品在采样前必须充分混合，采样一般用长形采样器，用虹吸法分层取样，然后装进小瓶混匀即可。
3.对含水量较高的肉类、鱼类、禽类等样品可取其可食局限，放进铰肉机中铰匀；对含水量更大的水果蔬菜等，取其可食局限，放进高速组织捣碎器中搅匀；于蛋类食品，往壳后用打蛋器打匀；关于罐头食品，取可食局限，并取出各种调味品后，再制备均匀。
二、样品的预处理〔填空选择〕〔不用认真瞧，但要了解有哪些方法〕1.有机物破坏法用于食品中无机盐或金属离子的测定。
在高温或强烈氧化条件下，使食品中有机物质分解，并在加热过程中成气态而散逸掉。
a.干法灰化法：样品在马福炉中(一般550℃)被充分灰化。
灰化前须先碳化样品，即把装有待测样品的坩埚先放在电炉上低温使样品碳化，在碳化过程中为了制止测定物质的散失，往往进进少量碱性或酸性物质(固定剂)，通常称为碱性干法灰化或酸性干法灰化。
维生素制剂中的维生素D化学分析方法
维生素制剂中的维生素D维生素和其它营养物比色法A原理根据制剂是否含有油类，是否有其他脂溶性维生素存在以及维生素D的浓度要求特定的步骤，见表24-1所示。
A.a不含其他维生素的维生素D浓缩物按G制备的样品残留物，含有约2.5mg维生素D〔100，000IU〕，并溶于10.0ml0.1%BHT溶液中B(p)。
分别吸取此溶液4ml至2个10ml 容量瓶中，向其中一个瓶中加入2ml10%马来酸酐溶液B(m)(1)，将塑料管置于瓶颈上，充以氮气并用弹簧夹夹住管子。
在100℃水浴上于暗处加热3h，冷却，用0.1%BHT溶液稀释溶液〔用马来酸酐处理及未处理过的溶液〕，并定容。
定量转移未处理的溶液至200ml容量瓶中且用0.1%BHT溶液稀释定容。
按J(b)加显色剂采用比色法测定处理过的及未处理的稀释溶液的吸光度A。
$$残留物色值(%)＝5×(A/Au)$$式中A及Au分别表示处理过的和未处理过的稀释溶液的吸光度A。
当残留物色值小于等于5%，则被认为异速甾醇可忽略不计。
A.b复合维生素制剂中的维生素D将制剂皂化并提取，未皂化物在磷酸盐处理过的氧化铝色谱柱上层析，成功的除去可能存在的生育酚、胡萝卜素及BHT；在聚乙二醇600-ChromosorbW及Florex上除去可能存在的维生素A，纯化了的样品用马来酸酐处理以除去无生物活性的反式异构体。
维生素D与三氯化锑反应后进行比色法测定，对仍然存在于最后溶液中的维生素A分解产物的干扰应加以校正。
B试剂B.a溶剂大于等于95%Ac2O，乙醇，无甲苯的苯，无过氧化及酸的乙醚，无酸的异辛烷，无过氧化物及酸的聚乙二醇600及无酸的甲苯。
B.b石油醚在颗粒状KOH上回流，收集40℃至60℃的馏分。
B.c乙醚-石油醚洗脱液石油醚中8%和30%的醚。
B.d二氯乙烯按下述方法提纯试剂级产品。
将1L二氯乙烯与50g粒状KOH及约50cm^2^铝箔回流2h，除去KOH及铝，加5g粉末状P2O5与二氯乙烯振摇并蒸馏〔沸点82℃)，弃去50ml初馏液。
BJS201717保健食品中9 种脂溶性维生素的测定
附件5保健食品中9种脂溶性维生素的测定BJS 2017171范围本方法规定了营养素补充剂类保健食品中维生素A、维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素D3、维生素E、维生素E醋酸酯、维生素K1、维生素K2、β-胡萝卜素含量的液相色谱-串联质谱测定方法。
本方法适用于营养素补充剂类保健食品中维生素A、维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素D3、维生素E、维生素E醋酸酯、维生素K1、维生素K2、β-胡萝卜素含量的测定。
2原理试样经混合溶液（异丙醇：二氯甲烷：甲醇=10:10:80，v:v:v）提取后，采用液相色谱-串联质谱仪检测，外标法定量。
3试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂3.1.1甲醇：质谱级。
3.1.2乙腈：质谱级。
3.1.3异丙醇：色谱纯。
3.1.4丙酮。
3.1.5二氯甲烷。
3.1.6提取溶液（异丙醇：二氯甲烷：甲醇=10:10:80，v:v:v）：取异丙醇50mL、二氯甲烷50mL，用甲醇稀释至500 mL，混匀。
3.1.7 0.1%甲酸水溶液：取甲酸1 mL用水稀释至1 000 mL，用滤膜（3.4）过滤后备用。
3.1.8 0.1%甲酸甲醇溶液：取甲酸1 mL用甲醇稀释至1000mL，用滤膜（3.4）过滤后备用。
3.2标准品维生素A、维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素D3、维生素E、维生素E醋酸酯、维生素K1、维生素K2、β-胡萝卜素标准品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见附录A表A.1，纯度≥98%。
3.3标准溶液配制3.3.1标准储备液（100μg/mL）—41 —3.3.1.1维生素K1标准储备液：称取0.01 g（精确至0.000 1 g）的维生素K1标准品（3.2），加入5mL丙酮（3.1.4）溶解，用甲醇转移并定容于100 mL棕色容量瓶中。
3.3.1.2 β-胡萝卜素标准储备液：称取β-胡萝卜素标准品（3.2）0.01 g（精确至0.000 1 g），用二氯甲烷（3.1.5）溶解，转移并定容至100 mL棕色容量瓶中。
维生素D的含量检验方法
维生素D的含量检验方法 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020维生素D3的含量检验方法含量检验操作规程，保证分析结果的准确性。
一、目的：建立维生素D3二、依据：GB/T三、范围：本规程适用于本公司维生素D3含量检验操作四、职责：质量检验员对本标准的实施负责五、正文：1、试制和溶液高峰氏淀粉酶（Taka-Diastase）异丙醇：色谱纯焦性没食子酸的乙醇溶液15g/L氢氧化钾溶液：质量比100:50石油醚：沸程30~60甲醇：重蒸后使用。
正己烷：色谱纯。
环己烷：色谱纯维生素D3标准储备液：含维生素D3100ug/ml（称取10mg维生素 D3，用甲醇定容于100ml量瓶中）维生素D3标准工作液：取维生素D3标准储备液1ml于100ml量瓶中，用甲醇定容。
2、实验室常用仪器。
高效液相色谱仪：具有可变波长的紫外分光检测器、数据处理系统或记录仪。
平底烧瓶：250ml分液漏斗：500ml旋转蒸发器。
3 分析步骤试样处理准确称取10g样品，放入250ml平底烧瓶中，加入1gTaka淀粉酶（），再加入30ml45~50℃的蒸馏水，混合均匀后，用氮气排除瓶中空气，盖上瓶塞，置45℃烘箱内30min，于上述样品中加入100ml没食子酸的乙醇溶液（），充分混匀后加入50ml氢氧化钾溶液（），在蒸汽浴上回流30min后，立即冷却到室温。
将冷却后的皂化液转入500ml分液漏斗中，用100ml水分几次冲洗平底烧瓶，洗涤液并入分液漏斗中；于分液漏斗中加入100ml石油醚（），盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇1min，静置分层，将水相放入另一500ml分液漏斗中。
重复上述萃取过程二次，合并醚液到第一个分液漏斗中。
用蒸馏水洗至中性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在40℃和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近干后，用石油醚转移至10ml量瓶中，定容。
VA、VD、VE的测定
前言测定维生素A、D、E的方法很多，但广为采用的是高压液相色谱法，方法快速、准确，并避免了三种成分的相互干扰。
本标准由中国轻工总会提出。
本标准由全国乳品标准化中心归口。
本标准负责起草单位：国家乳制品质量监督检验中心。
本标准参加起草单位：卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢（中国）投资服务有限公司。
本标准主要起草人：杨金宝、王芸。
中华人民共和国国家标准婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、D、E的测定Milk powder and formula foods for infant and young children-Determination of vitamin A,D,E contentGB/T 5413.9—19971 范围本标准规定了用液相色谱法测定维生素A、D、E的方法。
本标准适用于各种婴幼儿配方食品和乳粉中维生素A、D、E的测定。
2 方法提要样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离，经（用）石油醚萃取后，用高压液相色谱，紫外检测器定量测定。
3 仪器所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。
3．1 高峰氏淀粉酶（Taka-Diastase）。
3．2 异丙醇：色谱纯。
3．3 焦性没食子酸的乙醇溶液：15g/L。
3．4 氢氧化钾溶液：质量比为100：50。
3．5 石油醚：沸程30～60℃。
3．6 甲醇：色谱纯。
3．7 正己烷：色谱纯。
3．8 环己烷：色谱纯。
3．9 维生素A、E标准溶液3．9．1 维生素A标准贮备液，含维生素A100µg/mL的甲醇溶液。
称取10mg的维生素A，用甲醇定容于100mL容量瓶中。
3．9．2 维生素E标准贮备液，含维生素E400µg/mL的甲醇溶液。
称取40mg的维生素E，用甲醇定容于100mL容量瓶中。
3．9．3 维生素A、E标准工作液，其中维生素A的浓度为2μg/mL，维生素E 的浓度为20µg/mL。
乳粉中维生素D外标法与内标法测定方法的研究
黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）乳粉中维生素D外标法与内标法测定方法的研究姓名苑劲松学号074131640专业食品科学与工程班级2007- D指导教师张勇学部食品与环境工程答辩日期2011年5月21日黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）任务书乳粉中维生素D外标法与内标法测定方法的研究摘要维生素D是复杂机体所需的一种营养素，他以不同的方式影响机体的一切组织细胞，他对维持机体生理机能、预防疾病等方面具有非常重要的作用。
人体内各种维生素的缺乏或过多，都会导致人体生理机能的失调和紊乱，甚至导致各种疾病。
乳粉是婴幼儿和中老年人经常食用的一种食品。
本文采用高效液相色谱法，使用外标法和内标法对贝因美的A婴儿奶粉、G儿童奶粉和C中老年奶粉中维生素D含量分别进行了检测及比较分析。
检测结果分析表明：在本实验中，选择贝因美的三种不同年龄段的奶粉采用了不同的检测方法，对其进行维生素D含量的测定。
结果，在同一实验条件下，采用内标法对乳粉中维生素D含量进行检测其结果更加准确，因此采用内标法测定奶粉中维生素D含量为最佳测定方法，此法非常适合乳粉厂和检验检测机构作为测定维生素D含量的方法。
关键词：乳粉；维生素D；外标法；内标法Vitamin D in milk powder and the internal standard external standard method of determinationAbstractVitamin D is a complex body of nutrients needed, of his body in different ways all the cells, he physiological functions in maintaining the body, disease prevention, and so has a very important role. The lack of vitamins in the human body or too much can lead to physiological disorders and disordered function, or even lead to various diseases. Infant milk powder and the elderly are often consumed as a food. In this paper, high performance liquid chromatography, using the external standard method and the internal standard method Beingmate infant formula, A, G and C in older children milk vitamin D content of milk were examined and compared.Test results showed that: In this experiment, three selected Beingmate milk of different ages in different detection methods, its vitamin D content. The results, whatever the formula, were detected by internal standard method is measured under the highest levels, but also closest to the actual amount added. That, in the same experimental conditions, the use of the internal standard method is more precise determination of vitamin D, is the best method.Keywords:Milk；vitamin D；external standard method；internal standard目录摘要 (i)Abstract (ii)第1章绪论 (1)1.1乳及乳制品 (1)1.1.1乳的定义 (1)1.1.2乳的营养价值及分类 (1)1.1.3乳及乳制品的发展 (2)1.2乳粉定义及分类 (2)1.2.1全脂乳粉 (2)1.2.2脱脂乳粉 (3)1.2.3调味乳粉 (3)1.2.4婴儿配方乳粉Ⅰ (3)1.2.5婴儿配方乳粉Ⅱ、Ⅲ (3)1.2.6婴儿配方粉 (3)1.2.7婴幼儿补充谷粉 (3)1.2.8较大婴儿和幼儿配方粉 (4)1.2.9婴幼儿断奶期辅助食品 (4)1.2.10婴幼儿断奶期补充食品 (4)1.3维生素的D概述 (4)1.3.1维生素D的性质和功能 (4)1.4维生素D 测定方法概述 (7)1.4.1外标法概述 (7)1.4.2内标法概述 (8)1.4.3外标法与内标法比较 (9)1.5高效液相色谱法原理及应用 (9)1.5.1高效液相色谱法的检验原理 (9)1.5.2高效液相色谱法在食品检验中的应用 (9)1.6研究目的和意义 (10)第2章材料和方法 (12)2.1实验材料 (12)2.1.1奶粉试样 (12)2.1.2试剂 (12)2.2仪器与设备 (12)2.3试验方法 (13)2.3.1取样 (13)2.3.2使用不同方法测定维生素D (15)2.3.3维生素D的测定 (15)2.3.4维生素D含量测定的计算方法 (16)2.3.5最佳测定方法的确定 (16)2.3.6数据处理 (17)第3章结果分析 (26)3.1各种乳粉采用不同方法下维生素D的检测结果 (26)3.1.1 A婴儿乳粉采用同方法维生素D的检测结果 (26)3.1.2 G儿童乳粉采用不同方法下维生素D的检测结果 (26)3.1.3 C中老年乳粉采用不同方法维生素D的检测结果 (27)3.1.4不同测定方法对测定维生素D含量的结果分析 (27)结论 (29)参考文献 (30)致谢 (31)乳粉中维生素D外标法与内标法测定方法的研究第1章绪论1.1 乳及乳制品1.1.1 乳的定义乳：哺乳动物分娩后乳腺分泌的一种白色或微黄色的不透明液体。
维生素D定性实验
吸收、代谢及分布:
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实验二、维生素D的定性实验
维生素D的测定方法： 比色法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、薄层层析法等。 比色法灵敏度高，但操作十分复杂、费时。 气相色谱法虽然操作简单、精密度也高，但灵敏度低。 高效液相色谱法是目前分析维生素D的最好方法，灵敏度高、分析速度快，是我国国际
维生素D的主要来源： ① 维生素D主要来源于动物性食物，植物性食物几乎不含有维生素D。 ② 主要存在于海鱼、动物肝脏、蛋黄和瘦肉中；脱脂牛奶、鱼肝油、乳酸、坚果和海产品、添加 维他命D的营养强化食品，也含有丰富的维生素D。 ③ 维生素D的来源与其他营养素略有不同，除了食物来源之外，还可来源于自身的合成制造，但这 需要多晒太阳，接受更多的紫外线照射；经常晒太阳，以保证足够的紫外线照射，预防维生素D的 缺乏。
实验二、维生素D的定性实验
5、操作步骤 取1支干燥洁净的试管，加样品液1 mL+苯胺-浓HCl 1 mL，摇匀，于电炉上煮
沸30秒。观察溶液颜色反应。 6、实验注意事项 ① 加热试管时应注意管口不能对着任何人； ② 应不时摇动试管。
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维生素D2无天然存在，维生素D3只存在于动物性食品中。但它们都可由维生素D原（麦角固醇 和7-脱氢胆固醇）经紫外线照射形成。
维生素D缺乏时具体表现为：其突出的表现是小儿的佝偻病和成人的骨软化症并同存骨质疏松 症，同时影响神经、肌肉、造血、免疫等组织器官的功能，严重影响儿童的生长发育。
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实验二、维生素D的定性实验
GB/T5413.9—1997和AOAC995.05所采用的方法。
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实验二、维生素D的定性实验
1、实验目的：进一步了解维生素D的性质，掌握其定性检验方法。
维生素D检测方法的研究进展
维生素D检测方法的研究进展
顿中华
【期刊名称】《华夏医学》
【年(卷),期】2016(029)004
【摘要】应用高效液相色谱法、液质联用法、放射免疫法、酶联免疫法、化学发光免疫法、电化学发光免疫法、全自动生化法等检测血清25-(OH)D浓度,可根据测定结果对人体维生素D的营养状况做出评价,因此,在方法选择时,应根据测定灵敏度、特异性、测定费用、测定时间及实验人员能力和实验室条件等实际情况进行综合考虑.为此,笔者对有关研究进展进行综述.
【总页数】6页(P171-176)
【作者】顿中华
【作者单位】龙胜县人民医院检验科,广西龙胜541700
【正文语种】中文
【中图分类】R446.112
【相关文献】
1.25-羟基维生素D检测方法及临床应用的研究进展 [J], 李津鸿;
2.血清维生素D检测方法研究进展 [J], 谢荣;陆娣;倪君君
3.25-羟维生素D检测方法的研究进展 [J], 饶华春; 粘少硕; 庄跃玲
4.我国25⁃羟基维生素D检测方法及其研究进展 [J], 潘晓芳;吴静标;黄燕虹;朱秀霞;黄鸿新
5.1α,25-二羟基维生素D检测方法的研究进展 [J], 周莉;张杨;田来;张玉琪;罗镧
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碳酸钙D_(3)颗粒(Ⅱ)中维生素D_(3)含量测定的不确定度评定
碳酸钙D_(3)颗粒(Ⅱ)中维生素D_(3)含量测定的不确定度评定朱晓月;吴兆伟;安京烨;刘齐;郑洁;孙毅;王琳【期刊名称】《中国药业》【年(卷),期】2024(33)3【摘要】目的建立测定碳酸钙D_(3)颗粒(Ⅱ)中维生素D_(3)含量不确定度的评定方法。
方法采用《国家药品标准》WS1-XG-033-2021中维生素D_(3)含量测定方法进行测定,同时依据《测量不确定度评定与表示》JJF 1059.1-2012中的相关规定,建立测定维生素D_(3)的不确定度数学模型,并对不确定度来源进行分析和评定。
结果维生素D_(3)含量的不确定度来源主要有对照品纯度(PR),对照品称量(MR),对照品溶液制备(VR),对照品溶液测定(AR),样品称量(MS),供试品溶液制备(VS),样品平均装量(W),样品溶液测定(AS),高效液相色谱仪(I)及方法偏倚(B)。
高效液相色谱外标法测定碳酸钙D_(3)颗粒(Ⅱ)中维生素D_(3)含量的合成不确定度为0.0228,扩展不确定度为3.22%(k=2,置信概率为95%)。
方法偏倚引入的相对标准不确定度为1.83×10^(-2),为潜在风险点。
结论所建立的方法适用于高效液相色谱外标法测定碳酸钙D_(3)颗粒(Ⅱ)中维生素D_(3)含量测定的不确定度评定,但测定方法回收率较低。
建议对该方法进行影响因素试验考察,以改进检验方法,提高平均回收率。
【总页数】4页(P85-88)【作者】朱晓月;吴兆伟;安京烨;刘齐;郑洁;孙毅;王琳【作者单位】北京市药品检验研究院<北京市疫苗检验中心>·国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室·中药成分分析与生物评价北京市重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R927.2;R977.5【相关文献】1.高效液相色谱法测定饲料中25-羟基维生素D_(3)含量的不确定度分析2.维生素D_(3)联合碳酸钙D_(3)在25羟维生素D低水平合并低骨量患者中的应用效果3.半制备-高效液相色谱法测定乳粉中维生素D_(2)和D_(3)含量4.复方碳酸钙制剂中维生素D_(3)含量测定方法的研究5.高效液相色谱法测定复合维生素片中维生素D_(3)含量的不确定度评定因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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食品中維生素D之檢驗方法
1. 適用範圍：本檢驗方法適用於含鈣錠狀、粉狀及膠囊膳食補充品中維生素D2及D3之檢驗。
2. 檢驗方法：高效液相層析法（high performance liquid chromatography, HPLC）
2.1. 裝置：
2.1.1. 高效液相層析儀：
2.1.1.1. 檢出器：具有265 nm波長之紫外光檢出器。
2.1.1.2. 層析管：Vydac C18，5 μm，內徑4.6 × 250 mm或同級品。
2.1.2. 振盪器（Shaker）。
2.1.
3. 減壓濃縮裝置（Rotary evaporator）。
2.1.4. 離心機（Centrifuge）。
2.1.5. 超音波震盪器（Ultrasonic vibrator）。
2.2. 試藥：二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide）、正己烷、乙腈及甲醇採用試藥特級；維生素D2
（ergocalciferol）及維生素D3（cholecalciferol）對照用標準品。
2.3. 器具及材料：
2.3.1. 離心管：50 mL，PP材質。
2.3.2. 濾膜：孔徑0.45 μm，Nylon材質。
2.3.3. 容量瓶：5 mL、100 mL，褐色。
2.3.4. 濃縮瓶：250 mL，褐色。
2.4. 移動相溶液之調製：
甲醇：乙腈以10:90（v/v）之比例混合後，以濾膜過濾，取濾液作為移動相溶液。
2.5. 標準溶液之配製：
取維生素D2及D3對照用標準品各約10 mg，精確稱定，共置於容量瓶中，以正己烷溶解並定容至100 mL，供作混合標準原液，冷藏儲存。
臨用時再以正己烷稀釋至0.1～10.0 μg/mL，供作混合標準溶液。
2.6. 檢液之調製：
取磨細粉末檢體約5 g，精確稱定，置於離心管中，加二甲基亞碸10 mL，於40～50℃水浴中超音波振盪30分鐘，加甲醇：水（1:1，v/v）溶液10 mL混勻後，加入正己烷20 mL振盪萃取30分鐘，以3500 rpm離心10分鐘。
取上層液置入濃縮瓶中，下層液再以正己烷20 mL 重複萃取兩次，合併上層液於濃縮瓶，於30～40℃水浴中減壓濃縮至快乾，殘留物以正己烷溶解並定容至5 mL，以濾膜過濾後，供作檢液。
2.7. 鑑別試驗及含量測定
精確量取檢液及標準溶液各10 μL，注入液相層析儀中，參照下列條件進行液相層析，就檢液與標準溶液所得波峰之滯留時間比較鑑別之，並依下列計算式求出檢體中維生素D之含量。
檢體中維生素D含量（μg/g）＝
C：由標準曲線求得檢液中維生素D（維生素D2或維生素D3）濃度（μg/mL）
V：檢體最後定容之體積（mL）
M：取樣分析檢體之重量（g）
高效液相層析測定條件：
層析管柱：Vydac C18，5 μm，內徑4.6 × 250 mm
紫外光檢出器：波長265 nm
移動相溶液：依2.4節所調製之溶液
移動相流速：1 mL/min
附註：
１、本檢驗方法維生素D2及D3之檢出限量皆為0.1 μg/g。
２、食品中有影響檢驗結果之物質時，應自行探討。