鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤
蛋清溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 了解溶菌酶的生物学特性及其在食品、医药等领域的应用价值。
2. 掌握从鸡蛋清中提取溶菌酶的方法和操作步骤。
3. 学习蛋白质分离纯化的基本原理和实验技术。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种能够水解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键的碱性酶。
它主要存在于鸟类和家禽的蛋清中，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
本实验采用盐析法从鸡蛋清中提取溶菌酶，通过改变溶液的离子强度，使溶菌酶从溶液中析出。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋、去离子水、硫酸铵、盐酸、pH试纸、玻璃棒、滤纸、烧杯、漏斗、电子天平、移液管、离心机、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。
2. 实验试剂：硫酸铵、盐酸、去离子水等。
四、实验步骤1. 鸡蛋清制备：将4-5个新鲜鸡蛋打破，分离出鸡蛋清，加入两倍体积的去离子水，搅拌拌匀，过滤杂质。
2. 盐析：向鸡蛋清溶液中加入适量硫酸铵，搅拌溶解，使硫酸铵浓度达到60%左右。
将溶液静置一段时间，使溶菌酶析出。
3. 沉淀分离：用滤纸过滤析出的沉淀，收集滤液。
4. 洗涤：向沉淀中加入少量去离子水，搅拌洗涤，去除杂质。
重复洗涤2-3次。
5. 离心：将洗涤后的沉淀转移到离心管中，以3000r/min离心10分钟，收集上清液。
6. 蛋白质浓度测定：采用紫外可见分光光度计测定上清液中蛋白质浓度。
7. 溶菌酶活性测定：采用溶菌酶活力测定试剂盒测定溶菌酶活性。
五、实验结果与分析1. 蛋白质浓度测定：上清液中蛋白质浓度为1.5mg/mL。
2. 溶菌酶活性测定：溶菌酶活性为200U/mL。
根据实验结果，从鸡蛋清中提取的溶菌酶蛋白质浓度为1.5mg/mL，活性为200U/mL，说明本实验提取的溶菌酶纯度和活性较高。
六、实验讨论1. 盐析法是一种简单、有效的蛋白质分离纯化方法，适用于溶菌酶的提取。
2. 在实验过程中，要注意控制硫酸铵的加入量，以免影响溶菌酶的活性。
鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤
鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤从鸡蛋中提取溶菌酶的步骤1.鸡蛋清样品制备及粗分离将4～5 个（为⼀个⼩组，同时两个⼩组共同进⾏试验）新鲜鸡蛋打⼊烧杯然后⽤矿泉⽔瓶⼦吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得⼩于8.0），量其体积（量筒50ml），加⼊两倍蛋清体积的（可⽤双蒸⽔替代）去离⼦⽔，边加边缓慢搅拌，拌匀后⽤两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，然后⽤1 mol ／L 的HCl 溶液调pH 值⾄7.0 左右，再⽤脱脂棉过滤收集滤液。
2. 724 弱酸性阳离⼦交换树脂的再⽣及层析1.吸附：将处理好的蛋清约200 mL，加⼊32 g再⽣的724 树脂中，缓慢搅拌吸附6 h。
2.洗涤、洗脱：待分层后，将蛋清液倒去，⽤去离⼦⽔反复冲洗，以去除杂蛋⽩，滤⼲树脂，⽤等体积的0.15mol ／L pH 值为6．5 的磷酸缓冲液洗涤，加⼊等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，收集洗脱液，4℃冰箱静置过夜。
第⼆天，有⽩⾊沉淀析出，离⼼（15 min，10 000r ／min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品浓缩1·透析除盐、去碱性蛋⽩：4℃条件下，⽤去离⼦⽔透析24 h 左右（1天）直到透析完全（⽤BaCl2与透析液发⽣反应直到没有浑浊产⽣为⽌）。
离⼼去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加⼊1 mol ／L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升⾄8．0～9．0，如有⽩⾊沉淀，即离⼼去除；（碱性蛋⽩在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）2·聚⼄⼆醇浓缩：盐析物⽤1 倍去离⼦⽔溶解成稀糊状，装⼊透析袋，在装有聚⼄⼆醇的试管中吸⽔浓缩，收集浓缩液；3·冷冻⼲燥：⽤3 mol ／L 盐酸调pH值⾄5．0，冷冻⼲燥，即得⽩⾊⽚状溶菌酶。
溶菌酶纯度检测SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法①凝胶板的制备：⽤30％分离胶贮液、pH 值为8.9 分离胶缓冲液、10％浓缩胶贮液、pH 值为6.7浓缩胶缓冲液、10％SDS、1％TEMED、重蒸馏⽔、10％APS 溶液配制⽽成；②溶菌酶的处理：⽤磷酸缓冲液制成50 µg ／mL 的溶液，取10~80 µL 点样于凝胶板上③电泳：电流为10 mA，时间4 h；④固定、染⾊和脱⾊：电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染⾊液中浸泡10～30 min，⽤⽔漂洗⼲净，再⽤脱⾊液脱⾊。
鸡蛋溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 掌握鸡蛋溶菌酶的提取方法。
2. 了解溶菌酶的性质和功能。
3. 培养实验操作技能，提高实验分析能力。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于生物体内的碱性蛋白质，主要来源于鸟类的蛋清、哺乳动物的泪液、唾液等。
溶菌酶具有水解细菌细胞壁的作用，能够有效抑制细菌生长，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
本实验采用鸡蛋清作为溶菌酶的提取原料，通过酶解、离心、透析等步骤提取溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋、NaCl、NaOH、丙酮、硫酸铵、蒸馏水等。
2. 实验仪器：高速离心机、恒温水浴锅、玻璃棒、烧杯、漏斗、滤纸、透析袋等。
四、实验步骤1. 酶解：将新鲜鸡蛋打破，取出蛋清，加入适量的NaCl溶液（浓度为0.5mol/L），搅拌均匀，置于恒温水浴锅中，温度控制在37℃，酶解1小时。
2. 离心分离：将酶解后的溶液以3000r/min的速度离心10分钟，收集上清液。
3. 盐析：在上清液中加入适量的硫酸铵固体，搅拌溶解，使蛋白质沉淀。
静置2小时，收集沉淀。
4. 透析：将沉淀用蒸馏水洗涤，去除杂质，然后将其放入透析袋中，置于蒸馏水中，透析24小时，去除小分子物质。
5. 浓缩：将透析后的溶液在50℃下减压浓缩，使蛋白质浓度提高。
6. 纯化：将浓缩后的溶液加入适量的丙酮，使蛋白质沉淀。
静置2小时，收集沉淀。
7. 干燥：将沉淀在50℃下真空干燥，得到溶菌酶粉末。
五、实验结果与分析1. 酶解过程中，蛋清逐渐变得透明，表明溶菌酶开始释放。
2. 离心分离后，上清液中溶菌酶浓度较高，下清液中含有其他杂质。
3. 盐析过程中，蛋白质沉淀较多，表明溶菌酶在硫酸铵溶液中具有较好的溶解性。
4. 透析过程中，透析袋中的溶液逐渐变得清澈，表明小分子物质已被去除。
5. 浓缩过程中，蛋白质浓度逐渐提高，有利于后续的纯化。
6. 纯化过程中，丙酮沉淀的蛋白质较多，表明溶菌酶在丙酮中具有较好的溶解性。
7. 干燥后，得到白色粉末，表明溶菌酶已被成功提取。
鸡蛋清中溶菌酶的分离提取
南师大蛋清中提取溶菌酶实验
蛋清中提取溶菌酶南京师范大学生命科学学院姓名：穆旭学号：09130333摘要：本实验通过离子交换层析提取蛋清中的溶菌酶，掌握静态和动态离子交换的方法；和从生物材料中提取活性蛋白质方法，并用超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶，掌握超滤分离技术的原理和操作。
并且用SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量，从而掌握SDS－PAGE的原理和操作。
关键词：溶菌酶，柱层析，离子交换树脂，超滤，盐析，SDS-PAGE研究材料与实验方法1.柱层析前的准备工作实验材料：树脂：724型阳离子交换树脂、层析柱：φ1.6cm×30cm、溶液：0.1M NaOH，0.1M HCl、其他材料：布氏漏斗，抽滤瓶，铁架台，恒流泵，核酸蛋白检测仪等。
1.1预处理724型阳离子交换树脂碱－酸－碱的方法（Na型），每次用0.1N NaOH或者0.1N HCl溶液（体积约为树脂的2—3倍）浸泡树脂10—15min后，都要用蒸馏水将碱液、酸液冲洗掉。
1.2装填离子交换层析柱（重力沉降法）固定层析柱，保持层析柱垂直；将蒸馏水倒入层析柱中，以排出管道中的空气，当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱下端的塑料管夹紧；用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开下端的塑料管，树脂自然沉降，最后保持蒸馏水面高于树脂表面约2cm。
1.3配制0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0先配制 1M Na2HPO4 57.7mL，1M NaH2PO4 42.3mL将两者混合后稀释至1000mL，装于试剂瓶中。
1.4平衡离子交换树脂0.1M磷酸钠缓冲液恒速缓慢流经树脂，直至流出液的pH值与缓冲液相同，平衡结束。
2.柱层析法提取溶菌酶实验材料：起始缓冲液：0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗脱液：50mM NaCl溶液200mL（溶剂：起始缓冲液）、500mM NaCl溶液150mL （溶剂：起始缓冲液）再生溶液：0.5M NaOH溶液仪器：磁力搅拌器等其他材料：新鲜鸡蛋2.1样品的预处理取2个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积1.5倍的起始缓冲液，搅拌均匀，用4层纱布过滤除去不溶性物质，检查其pH值是否为7.0，否则用0.5M酸、碱调节。
如何从蛋清中提取溶菌酶
盐析法实验步骤
• 将预处理的蛋清倾人烧杯中，边搅拌边加入蛋白质5％的 食盐粉末，促使氯化钠细粉及时溶解，以避免局部浓度过 高或沉淀于容器底部，否则会引起蛋白质的变性而产生大 量的白色沉淀．溶解后再用0．1mol／L的NaOH溶液调节 pH9．5-pH10.0。置于4℃环境中，数天后即有溶菌酶结 晶出现，将酶晶体过滤，收集结晶沉淀粉，用丙酮脱水， 真空干燥即为粗产品。将制得的粗品用pH4．6的醋酸溶 解，然后让酶液静置24小时，接着过滤除去不溶物，收集 滤液并量出体积，按每100毫升液体加5毫克NaCl的比例 加入，然后用0．1mol／L的NaOH溶液缓慢地将其pH值 调节到10．8后，低温下静置结晶。为加速结晶过程可向 酶液中加入溶菌酶晶种，待结晶完全后再倾去上清液，用 布氏漏过滤可得溶菌酶结晶。如纯度不高，可重复操作提 纯，直至达到所需的纯度为止，结晶于30—40℃得溶菌酶 产品。
离子交换法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
从蛋清中提取溶菌酶的方法
溶菌酶作用机制
• 溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。 • 它作用于N一乙酰氨基葡萄糖胺和N一乙酰胞壁酸 之间的B一1，4糖苷键，能使某些细菌细胞中粘 多糖成分分解。因而具有溶菌能力。 • 溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，处理革 兰氏阳性细菌可得到原生质体。溶菌酶是一种无 毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用， 因此可用作食品防腐剂。
常用方法
• 盐析法 • 实验原理：高浓度的中性 盐溶液中存在着大量的带 电荷的盐离子，它们能中 和生物分子表面的电荷， 使之得以稳定的双电层受 损，从而破坏分子外围的 水化层；另外，大量盐离 子自身的水合作用降低了 自由水的浓度，从另一方 面压缩了水化层的浓度， 降低了它的亲水性，从而 沉淀析出。 • 离子交换法 • 实验原理：离子交换剂与 溶液中离子或离子化合物 的反应主要以离子交换方 式进行，或者借助离子交 换剂上电荷基团对溶液中 离子或离子化合物的吸附 作用进行，离子交换剂由 基质、电荷基团(或功能基 团)和反离子构成。
溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取和纯化方法。
2. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法。
3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定。
二、实验原理溶菌酶是一种胞壁质酶，具有分解细菌细胞壁的能力。
本实验通过提取鸡蛋中的溶菌酶，对其进行分离纯化，并测定其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋- 氯化钠- 醋酸铵- 酒精- 乙醚- 磷酸盐缓冲液- 离心机- 电泳仪- 超声波清洗器- 蛋白质定量仪- 分光光度计2. 实验试剂：- 氯化钠溶液- 醋酸铵溶液- 酒精溶液- 乙醚溶液- 磷酸盐缓冲液- 蛋白酶抑制剂四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取- 将鸡蛋打破，取出蛋黄和蛋白，混合均匀。
- 将混合液用氯化钠溶液调至pH 7.0，室温下搅拌30分钟。
- 用纱布过滤混合液，收集滤液。
2. 溶菌酶的分离纯化- 将滤液用醋酸铵溶液调至pH 4.5，室温下搅拌30分钟。
- 用纱布过滤混合液，收集滤液。
- 将滤液加入等体积的酒精溶液，室温下静置过夜。
- 用纱布过滤混合液，收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤三次，收集洗涤液。
3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 将洗涤液用超声波清洗器处理30秒，使溶菌酶充分溶解。
- 用分光光度计测定洗涤液的蛋白浓度。
- 将洗涤液稀释适当倍数，进行酶活力测定。
4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 将洗涤液进行SDS-PAGE电泳，比较样品与标准蛋白的迁移率。
- 根据迁移率计算溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取- 滤液呈淡黄色，说明溶菌酶已从鸡蛋中提取出来。
2. 溶菌酶的分离纯化- 酒精沉淀法可以有效地将溶菌酶与其他蛋白分离。
- 洗涤液呈淡黄色，说明溶菌酶已从沉淀中分离出来。
3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 洗涤液的蛋白浓度为1.5mg/mL。
- 酶活力为100 U/mL。
4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 电泳结果显示，样品与标准蛋白的迁移率一致，说明溶菌酶已达到纯化。
实验三_溶菌酶的提取和结晶
实验三溶菌酶的提取和结晶一、实验目的学习从鸡蛋清中提取和纯化溶菌酶的方法。
二、实验原理溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。
活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50OC，最适PH为6～7左右。
在280nm的消光系数[ ]为13.0。
该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。
三、实验器材仪器：冰箱，pH计，pH试纸，冷冻离心机，恒温培养箱，恒温摇床，分光光度计，水浴锅，滤网（150目），滤纸，电子天平，漏斗，移液器。
试剂：新鲜鸡蛋清，1mol/L NaOH，溶菌酶，5%NaCl,无水丙酮四、实验步骤（1）选择新鲜鸡蛋，蛋清的PH值不能低于8.0。
（2）清洗：用水洗掉蛋壳表面的不洁之物。
（3）破壳分离蛋清。
（4）鸡蛋清均质：搅拌10 分钟，将蛋清搅拌稠度均匀即可，以不引起泡沫为宜，防止蛋白质变性。
（5）过滤：用3 层纱布将稠度均匀的蛋清液过滤，滤去残存的蛋壳及卵带。
（6）加盐：搅拌下，向蛋清液中缓缓加入5%（100ml蛋清中加入5g氯化钠）氯化钠细粉，加料速度以氯化钠及时溶解为宜。
（7）结晶：用1M 氢氧化钠溶液调PH 至9.5-10.0，边加边搅拌均匀，避免过碱引起蛋白质变性。
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从鸡蛋中提取溶菌酶的步骤
1.鸡蛋清样品制备及粗分离
将4～5 个（为一个小组，同时两个小组共同进行试验）新鲜鸡蛋打入烧杯然后用矿泉水瓶子吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得小于8.0），量其体积（量筒50ml），加入两倍蛋清体积的（可用双蒸水替代）去离子水，边加边缓慢搅拌，拌匀后用两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，然后用1 mol ／L 的HCl 溶液调pH 值至7.0 左右，再用脱脂棉过滤收集滤液。
2. 724 弱酸性阳离子交换树脂的再生及层析
1.吸附：
将处理好的蛋清约200 mL，加入32 g再生的724 树脂中，缓慢搅拌吸附6 h。
2.洗涤、洗脱：
待分层后，将蛋清液倒去，用去离子水反复冲洗，以去除杂蛋白，滤干树脂，用等体积的0.15mol ／L pH 值为6．5 的磷酸缓冲液洗涤，加入等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，收集洗脱液，4℃冰箱静置过夜。
第二天，有白色沉淀析出，离心（15 min，10 000r ／min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品
浓缩
1·透析除盐、去碱性蛋白：
4℃条件下，用去离子水透析24 h 左右（1天）直到透析完全（用BaCl2与透析液发生反应直到没有浑浊产生为止）。
离心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入1 mol ／L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升至8．0～9．0，如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）
2·聚乙二醇浓缩：
盐析物用1 倍去离子水溶解成稀糊状，装入透析袋，在装有聚乙二醇的试管中吸水浓缩，收集浓缩液；
3·冷冻干燥：
用3 mol ／L 盐酸调pH值至5．0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。
溶菌酶纯度检测
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法
①凝胶板的制备：
用30％分离胶贮液、pH 值为8.9 分离胶缓冲液、10％浓缩胶贮液、pH 值为6.7浓缩胶缓冲液、10％SDS、1％TEMED、重蒸馏水、10％APS 溶液配制而成；
②溶菌酶的处理：
用磷酸缓冲液制成50 μg ／mL 的溶液，取10~80 μL 点样于凝胶板上
③电泳：
电流为10 mA，时间4 h；
④固定、染色和脱色：
电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染色液中浸泡10～30 min，用水漂洗
干净，再用脱色液脱色。
第一天
鸡蛋处理：
a)将4～5 个（为一个小组，同时两个小组共同进行试验）新鲜鸡蛋打入烧杯然后用矿
泉水瓶子吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得小于8.0）。
b)量其体积（量筒50ml），加入两倍蛋清体积的（可用双蒸水替代）去离子水，边加边
缓慢搅拌，拌匀后用两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等。
c)向透析清液中慢慢加入1 mol \L氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升至8～9，
如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）
树脂吸附：
A.将处理好的蛋清约200 mL，加入32 g再生的724 树脂中(抽滤去除缓冲液)，缓慢搅
拌吸附6 h。
B.3000r/min离心15min，将蛋清回收，用去离子水反复冲洗，直至洗液无浑浊，滤干
树脂。
C.用等体积的0.15mol ／L pH 值为6．5 的磷酸缓冲液洗涤。
D.用等体积的0.15mol ／L pH 值为6．5 的磷酸缓冲液洗涤15min，重复2次，最后
一次除去树脂水分。
E.加入等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，抽
滤收集洗脱液。
F.每83ml洗脱液加32克细磨的固体（NH4）SO4 ,缓慢加入（NH4）SO4搅拌待完全溶解
后，封口4℃冰箱静置过夜。
凝胶溶胀：
1)称取7gSephaexG-75于250ml烧杯中，加入洗脱液140ml，室温溶胀2天。
第二天
透析除盐：
1)第一天的洗脱液会有白色沉淀析出，离心（15 min，10 000r / min）收集沉淀，沉淀物
为溶菌酶粗产品。
2)将上述沉淀用1ml蒸馏水分两次洗下，装入透析袋。
3)4℃条件下，用去离子水透析，期间多次换水，直到透析完全（用BaCl2与透析液发生反
应直到没有浑浊产生为止）。
到此为止所有的试验项目均是有两个平行凝胶层析：
测柱床总体（Vt）：
1·取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。
在距柱上端约3cm处作一记号。
2·关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口。
3·然后用量筒接住柱中去离子水（水面降至层析玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt。
装柱：
4·在柱中注入已脱气洗脱液（约1/3柱床高度）。
5·将溶胀好的凝胶与洗脱液1：3混匀稀释后缓慢倾入柱中。
6·待凝胶沉积约1cm~2cm高度后打开出水口，常压平衡，胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。
7·然后关闭出水口，静置过夜，等凝胶完全沉降。
过夜后的凝胶柱内颗粒大小分布均匀，松紧一致，填料微孔中无气泡，连接处无死体积。
第三天
聚乙二醇浓缩：
1)离心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入1 mol /L 氢氧化钠溶液，同时不断
搅拌，使pH 值上升至8．0～9．0，如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH 条件下会到等电点然后就会沉淀）
2)盐析物用1 倍体积去离子水，溶解成稀糊状，装入透析袋，在装有淹没西的聚乙二
醇的试管中吸水浓缩，收集浓缩液。
时间在6—7小时。
冷冻干燥：
1)用3 mol ／L 盐酸调pH值至5．0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。
凝胶层析：
预加样：
1·在胶面上覆盖一层滤纸，接恒流泵，用2倍床体积的洗脱液以0.5ml/min流速平衡柱子，使柱床稳定，期间测定流速是否与预设的一样，并赶走系统中的气泡。
2·用另一支相同的层析玻璃管与层析柱对比得到外水体积为26.5ml。
3·吸去柱上端的洗脱液，打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（不要干胶），关闭出水口。
4·用细滴管吸取1.0 mL蓝色葡聚糖-2000沿管壁缓慢加入，打开出水口，等蓝色葡聚糖渗入胶床与胶面相切时，关闭出水口。
5·用少许洗脱液加入柱中，柱上端再用洗脱液充满后用0.5mL/min的速度开始洗脱。
6·收集洗脱液没管1.0 ml。
手动记录时间与对应的OD280并绘制曲线。
葡聚糖色带狭窄、均匀平整，层析柱性能良好。
蓝色葡聚糖洗下来之后，用洗脱液(1倍床体积)继续平衡一段时间。
加样和洗脱：
7·按加葡聚糖的操作方法加入溶菌酶样品溶液1.0 mL，用Bio-Rad层析系统设置洗脱条件，以约0.5mL/min的速度洗脱并收集洗脱液每管0.5 ml。
8·手动记录时间及检测到的洗脱液在A280nm处的吸光值。
9·将收集管编号置于4℃冰箱保存.合并洗脱峰内的收集管中的洗脱液。
（预先测得记
录仪至部分收集器的死体积，出现峰值处的收集管延迟死体积所占的管数才为峰值处样品。
）
SDSpage电泳：
制胶
将12%的分离胶加入到电泳槽内的两玻璃板之间，到上口约3cm止，再加一薄层蒸馏水填满，赶走气泡，水与胶面分开并且界面清晰。
静置20min，将水倒去。
将4%的浓缩胶连续平稳加入至刚刚没过薄板，赶走气泡。
迅速从左至右插入梳子，不要留下气泡，静置30min。
● 点样
将样品与loading Buffer 1:1混匀。
将上述处理的各级分样品和蛋白Marker分别加到点样槽中5ul。
接通电源先恒压130V电泳，待各样品从浓缩胶进入分离胶后恒压220V继续电泳，直到溴酚蓝距凝胶边缘5mm是停止电泳，关闭电源。
● 染色及脱色
切去浓缩胶，留分离胶用考马斯亮蓝R-250摇床染色20min,回收考马斯亮蓝R-250，在培养皿中加脱色液脱色（期间多次更换脱色液直至背景清楚，条带清晰），并对电泳图谱拍照记录。